Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة 1U01GM110714-01 وإدارة الطاقة دي-FG02-02ER63445. الكتاب يود أن يشكر الدكتور ريتشارد كوهمان، والدكتور جيني تام، والدكتور إدغار جولوتش لنصائح مفيدة في بناء قسم البروتوكول في هذه المخطوطة.

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

جو، ولا، وقد قدمت جي أم سي براءات اختراع المتصلة بهذا العمل.

وقد تم تحسين هذا البروتوكول البرية من نوع ف. ناتريجينس ووسائط النمو البكتيرية التي تتألف من رطل وتستكمل مع أملاح V2 (جدول المواد). يمكن استزراع سلالات أخرى من ف. ناتريجينس وبالمثل لتوليد مقتطفات خلية النفط الخام لتفاعلات الخلية الحرة؛ ومع ذلك، يتطلب استخدامها التحسين إضافية من هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين هذا النظام التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام حمض 3-فوسفوجليسيريك (3-الشبكة) كمصدر للطاقة الأولية للتجديد. يمكن استخدام مصادر أخرى لتجديد الطاقة؛ ولكن الأمثل من الكواشف والمعايرة سيكون على الأرجح الحصول على تعبير البروتينات ذات العوائد العالية10،11.
إيلاء اهتمام خاص للعديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول سوف ضمان استخراج أقصى إنتاجية عالية الغلة الخلية خالية من إنتاج البروتين. أولاً، يجب أن يكون مستعدا استخراج النفط الخام خلية من الثقافات الخلية V. ناتريجينس تحصد في مرحلة منتصف المتسارع النمو؛ البروتين الغلة القصوى عندما الثقافات تصل OD600 = 1.0 ± 0.2. بينما من الممكن إنتاج بروتين الخلية خالية من الخلايا التي تحصد في طائفة من الكثافة البصرية، وجدنا سابقا أن تحصد في حالة أسي لنمو الخلايا تسفر عن أكثر بكثير البروتين9. لوحظت آثار الكثافة البصرية على أداء استخراج النفط الخام خلية تتسق مع تلك التي أبلغ عنها لنظم التعبير خالية من الخلايا الأخرى المستمدة من الخلايا التي نمت في ظروف ثقافة المجموعة1. لأنه ضد ناتريجينس ينمو بمعدل سريع، من المهم أن ترصد عن كثب الكثافة البصرية للثقافات. وبصفة عامة، يتوقع أن V. ناتريجينس الثقافات ينبغي أن يصل تكاثر التطوير التنظيمي600 1.0 داخل ح 1−1.5 استخدام هذا البروتوكول؛ ومع ذلك، حير ظروف نمو الفردية مثل الاستخدام مقابل قوارير غير حيرة، الذي يؤثر على التهوية، أو الهواء مقابل حضانة المياه، مما يؤثر على معدل واستقرار درجة حرارة الحضانة، قد يغير وقت النمو. وعلاوة على ذلك، من المستحسن عموما مالا يقل عن 250 مل من ف. ناتريجينس في قارورة حيرة ل 1 التأكد من بيليه خلية كبيرة في موسم الحصاد للتلاعب بسهولة ونقل الثقافة. وهذا يحسن إلى حد كبير نجاح إعداد استخراج النفط الخام من الخلية، فضلا عن زيادة الحجم الإجمالي لاستخراج تنتج من بيليه. عند استخدام إعداد مقياس أصغر، ظروف الثقافة والكاشفات يمكن تعديلها على النحو المناسب. للاختمار الواسعة النطاق، مواصلة تحسين ظروف الثقافة قد يكون مطلوباً. وأخيراً، لضمان محصول عالي البروتين، من الأهمية بمكان أن الكريات الخلية تتم معالجتها فورا بعد الحصاد، أو في غضون أيام 1−2 تخزين في-80 درجة مئوية.
تحلل السليم بيليه الخلية بنبض سونيكيشن أمر حاسم لنجاح التعبير بروتين الخلية الحرة وغالباً ما الجانب الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول للمستخدمين الجدد. عادة، سوف تسفر عن بيليه جيدا حجم كبير لاستخراج السائل خالية من الحطام. الاستخراج ينبغي أن يكون لزج قليلاً ولكن يمكن بيبيتيد بسهولة عندما اليقوتينج إلى مخزن أنابيب قبل فلاش التجميد في النيتروجين السائل. يصور الشكل 3 تمثيل بيليه جيدا (الشكل 3A) بالمقارنة بيليه سيئة (الشكل 3B) بعد الخطوة الطرد المركزي تحلل الوظيفة. مؤشرا رئيسيا لتحلل الخلية كاملة استخراج خلية النفط خام مجموع البروتين تركيز > 20 ملغ/مل كما يحددها مقايسة بروتين الكلي (الخطوة 2، 13). Sonication الإفراط أو التسخين المفرط لاستخراج النفط الخام خلية سيضر في جهاز الهاتف الخلوي، الذي لا يمكن تحديده دون القيام برد فعل الخلية الحرة. هكذا، فإنه مفيد للغاية لاختبار كفاءة استخراج بفعل تحكم قبل تكريس قدر كبير من الوقت والجهد لتطبيقات التعبير البروتين المتلقين للمعلومات. بينما التحسين إضافية قد تكون ضرورية للمعدات مختلفة سونيكاتيون، قد نبض sonication الخطوات الموضحة عالية استنساخه في أيدينا.
استخدام قالب الحمض النووي الخطي المستمدة من PCR التضخيم أو هضم إنزيم التقييد، أو التوليف الجيني التجارية يمكن أن تزيد القدرة على إنتاج البروتين الفائق والسريع في نظم التعبير الخلية الحرة24. بينما أظهر إنتاج البروتين من القالب الخطي تضخيم بكر، العائد من ردود الفعل هذه السفلي 13.5-fold تقريبا مقارنة بردود فعل استخدام بلازميد الدنا القالب في نسب اكويمولار9. وهذا يرجع أساسا إلى عدم استقرار قالب الحمض النووي الخطية التي من المحتمل قد أفسدتها nucleases الذاتية موجودة في V. ناتريجينس استخراج النفط الخام من الخلية. بينما بالعاثية أمداً التجمع البروتين قد استخدمت سابقا لحماية "الحمض النووي الخطي" قالب24،25، تم العثور على مقتطفات غير متوافقة مع V. ناتريجينس 9. بالإضافة إلى ذلك، بينما قد تسمح زيادة تركيز خطي الدنا القالب لعائد العالي بروتين، تدهور سريع في استخراج النفط الخام من الخلية ستظل مشكلة رئيسية.
قد يكون حلاً للتغلب على تدهور قالب الدنا الخطي لتكملة ردود فعل الخلية خالية مع قالب مرناً المتولدة من النسخ في المختبر للحمض النووي الخطي. من ناحية أخرى، استخدام المانع رناسي يوفر حماية كبيرة ضد تدهور نسخة مرناً ويمكن الحصول على غلة البروتين ملموس في شكل رد فعل الخلية الحرة 10 ميكروليتر (الشكل 5 أ، ب). استنساخ الحمض النووي الخطي في قالب تعميم عن طريق ربط تا، استنساخ توبو، الجمعية البوابة الذهبية أو غيرها من الأساليب جزئ قد تستخدم للتحايل على تدهور القالب. ومع ذلك، كذلك النهج لتثبيط النشاط nuclease سيكون ضروريا للتعبير البروتين كفاءة استخدام خطي الدنا القالب.
وحتى الآن، اقترحت عدة نهج مختلفة لإعداد استخراج النفط الخام للبروتين الخلية الحرة التعبير9،10،،من1126. في وضع هذا البروتوكول، سعينا إلى تحقيق أقصى قدر من الوصول إلى المستخدم وتقليل التكلفة الإجمالية وتقليل الخطوات تستغرق وقتاً طويلاً. على سبيل المثال، غلة نسبة عالية من بروتين يتم تحقيقه باستخدام عملية الطرد المركزي سونيكيشن من خطوتين بسيطة، ولا تتطلب أجهزة المجانسة الخلية، خطوات الغسيل الكلوي مطولة أو رد فعل الجريان السطحي. أنها بسيطة لتنفيذه في فترة قصيرة من الزمن ولا تتطلب مستوى عاليا من الخبرة المعملية. وهكذا، يمكن أن يساعد تيسير التعبير خالية من الخلايا كمعيار للبحث الأكاديمي متعدية الجنسيات وتصميم العملية الصناعية.
يوسع هذا البروتوكول مجموعة الأدوات المتاحة للتحقيق وفائدة ف. ناتريجينس، أحد الكائنات غير النموذجي مع الخصائص البيولوجية الفريدة. العالي البروتين العائد يمكن أن يتحقق باستخدام نصف أو كامل-مستمر الخلية الحرة ردود الفعل، للسماح لتجديد الطاقة، المتسللة من الأحماض الأمينية، والتخلص من نفايات المنتجات3،5،27. وعلاوة على ذلك، الهندسة من البرية من نوع ف. ناتريجينس لإنتاج سلالات الدناز أو رناسي ناقصة، إزالة الأيضية ضارة والمتنافسة، وتعبير عن ترنس إضافية يمكن أن يعزز إنتاج البروتينات في هذا النظام،من2829. كما كشف البيولوجيا الكامنة وراء نموها السريع، مواصلة تطوير V. ناتريجينس نظم خالية من الخلية قد تسريع قدرات بيوبرودوكشن وتمكين التعبير قوية من الببتيدات العلاجية، والجزيئات الصغيرة، والاصطناعية المواد.

تخليق البروتين الخلية الحرة طريقة فعالة من حيث التكلفة وتنوعاً للتعبير عن قيمة البروتينات أو الببتيدات1،2،،من34. تاريخيا، تم أداؤه تخليق البروتين خالية من الخلية باستخدام أنظمة تعبير الإشريكيّة القولونية ؛ ومع ذلك، كان هناك طفرة في الآونة الأخيرة في استخدام الكائنات الحية البديلة، غير نموذج مع خصائص الرواية كهيكل للتعبير خالية من الخلية5،،من67،،من89 , 10 , 11 , 12-الكائنات مع التشكيلات الجانبية الأيضية فريدة من نوعها هي رئيس الوزراء المرشحين كبدائل لنظم كولاي خالية من الخلية. على سبيل المثال، تضاعف البكتيريا البحرية ناتريجينس الضمة هي الأسرع نمواً من جميع الكائنات المعروفة مع ملاحظتها وقت أقل من 10 دقيقة13. وهذا قد حصل V. ناتريجينس اهتماما كبيرا كمضيف الميكروبية المستجدة للبحوث والتكنولوجيا الأحيائية14،،من1516،،من1718. نظراً لأن معدل النمو السريع ف. ناتريجينس وقد ارتبطت بمعدلات عالية من البروتين وكفاءة الأيض19،20،21، تسخير جهازها الخلوي للخلية الحرة يمكن توسيع توليف مجموعة الأدوات لإنتاج البروتين السريع والفرز الفائق.
في الآونة الأخيرة، خلية حرة قد ثبت ف. ناتريجينس نظام التعبير التي هي قادرة على إنتاج مجلد سوبر التجارة والنقل (سفجفب) بتركيزات > 260 ميكروغرام/مل في ح 3 مع مروج T79. وكان الهدف العام لتطوير هذا الأسلوب لتزويد المستخدمين مع نظام تعبير الوصول للغاية، وفعالة من حيث التكلفة، واستنساخه، وعالية الغلة من بروتين خالية من الخلايا التي يمكن إعدادها باستخدام معدات مختبر مشترك في فترة قصيرة من الزمن. ويستخدم هذا البروتوكول الثقافات 1 لتر في قوارير اهتزاز، وتحلل الخلية بنبض سونيكاتيون، وردود الفعل دفعة صغيرة الحجم في شكل 96-384 جيدا أو الموازاة وفحص الإنتاجية إلى أقصى حد. تعبير بروتين طويلة ومستمرة بفضل مكملات حمض 3-فوسفوجليسيريك (3-الشبكة) كالطاقة مصدر8،،من2223. عند الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، وسوف يكون لمستخدم القدرة على التعبير عن بروتين المطلوب أو استخراج مجموعة من البروتينات في شكل الخلية الحرة باستخدام V. ناتريجينس خلية النفط الخام.
بدءاً من مخزون والغليسيرول، مستعدون V. ناتريجينس مقتطفات النفط الخام خلية من الخلايا حصاد بكثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) 1.0. سوف تسفر عن ثقافة 1 لتر تقريبا 2−3 مل من استخراج، وكافية لأكثر من 800 من ردود الفعل الخلية الحرة في استخراج النفط الخام من الخلية 25%. البروتينات يمكن التعبير عنها باستخدام بلازميد الحمض النووي، والحمض النووي الخطي، أو قالب مرناً؛ إلا أن تظل الخطية تدهور قالب الحمض النووي من نوكلياسيس الذاتية عيب كبير عند استخدام نظام النوع المتوحش ضد ناتريجينس الخلية الحرة9. بدءاً من الثقافات ف. ناتريجينس ، البروتين صالحة للاستخدام للتطبيقات المتلقين للمعلومات يمكن أن تحققه مستخدم واحد في 1−2 يوما كاملا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

البكتيريا البحرية ناتريجينس الضمة قد حصل على اهتمام كبير كمضيف الميكروبية ناشئة عن التكنولوجيا الحيوية بسبب معدل النمو السريع. ويرد وصف بروتوكول عام للإعداد V. ناتريجينس مقتطفات خلية النفط الخام باستخدام معدات المختبرات المشتركة. لقد كان هذا البروتوكول ذات العوائد المرتفعة على وجه التحديد الأمثل للمستخدم إمكانية الوصول وتقليل التكلفة. تخليق البروتين الخلية الحرة (الحراجية) يمكن أن تنفذ في نطاق صغير 10 ميكروليتر دفعة ردود الفعل في شكل جيد 96 أو 384 وتكاثر غلات تركيزات > 260 ميكروغرام/مل سوبر المجلد التجارة والنقل (سفجفب) ضمن حاء 3 عموما، واستخراج النفط الخام خلية الحراجية وإعداد يمكن أن يتحقق في أيام كاملة 1−2 بمستخدم واحد. هذا البروتوكول يمكن دمجها بسهولة في الأنابيب توليف البروتين الموجودة لتسهيل التقدم في الإنتاج البيولوجي وتطبيقات البيولوجيا التركيبية.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

نظم التعبير خالية من الخلية أدوات قوية وفعالة من حيث التكلفة لتوليف الفائق وفحص البروتينات الهامة. وهنا يصف لنا إعداد نظام التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام ناتريجينس الضمة لإنتاج البروتين السريع باستخدام بلازميد الحمض النووي والحمض النووي الخطي قالب مرناً.

الخلية الحرة "استخدام تعبير البروتين" "سرعة نمو بكتيريا" الضمة ناتريجينس

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

يستخدم بروتوكولنا للتعبير عن البروتين الخالي من الخلايا استخراج خام نشط للغاية من البكتيريا سريعة النمو Vibrio natriegens ، والتي يتم إعدادها باستخدام عملية sonication -centrifugation بسيطة وفعالة من حيث الوقت. ويمكن تحقيق إعداد استخراج الخلايا الخام وتخليخل البروتين الخالي من الخلايا في يوم إلى يومين من قبل مستخدم واحد يسمح بدمج هذه التقنية بسهولة في خطوط الأنابيب لأغراض الإنتاج البيولوجي أو تطبيقات البيولوجيا التركيبية. لبدء غسل ملليلتر واحد من ثقافة فيبريو natriegens بين عشية وضحاها من قبل الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي benchtop في 10، 600 مرة ز لمدة دقيقة واحدة.استلهمت من فوق دون إزعاج بيليه، و resuspend في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام LB-V2 الطازجة. تلقيح ملليلتر واحد من الثقافة بين عشية وضحاها غسلها في لتر واحد من وسائل الإعلام الطازجة LB-V2 النمو في قارورة أربعة لتر حائرة erlenmeyer مع غطاء عقيم لتحقيق واحد إلى واحد ألف تخفيف الحصص التموينية. تنمو الثقافة في 30 درجة مئوية في حين تهتز إلى 225 دورة في الدقيقة.استخدام مقياس الطيف لرصد الثقافات OD 600. وعندما تصل إلى 1.0 زائد أو ناقص 0.2 حصاد الثقافة عن طريق الطرد المركزي في اثنين من أنابيب 500 ملليلتر في 3، 500 مرة ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية، ومن ثم وضع على الجليد. التعرق ومعالجة بيليه على الفور.قبل البدء في إجراء تحلل الخلايا بارد حديثا أعدت S30 تحلل العازلة الرقم النزلي 7.7 إلى ما يقرب من أربع درجات مئوية، استخدم 10 ملليلتر من هذا المخزن المؤقت S30 تحلل الباردة لإعادة تعليق جميع الكريات الناتجة عن نفس ثقافة لتر واحد. ونقل التعليق إلى أنبوب 50 ملليلتر. الطرد المركزي هذا التعليق في 3،500 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، ومن ثم الطامح عظمى دون إزعاج بيليه ووضعها على الجليد.العمل في غرفة باردة إضافة 500 ميكرولترات من S30 الباردة العازلة تحلل إلى بيليه في أنبوب 50 ملليلتر وضعت على الجليد. استخدام طرف ماصة تتحمل واسعة لإعادة تعليق بيليه ونقلها بعناية إلى أنبوب مليلتر اثنين أيضا على الجليد. من أجل إنتاج مقتطفات الخام نشطة جدا يجب علينا التأكد من أن الخلايا ليست أكثر من المخفف مع S30 العازلة، ولكن لديها ما يكفي من السوائل ل sonication كفاءة.ملء 600 ملليلتر منقار مع الجليد ووضع حامل أنبوب ملليلتر اثنين على رأس الجليد. دوامة الأنبوب لفترة وجيزة لتجانس الخلايا. قم بالتمرير لإزالة أي خلايا في الجزء السفلي من الغطاء، ووضعها في حامل أنبوب مع غطاء مفتوح.انخفاض تلميح sonicator في تعليق الخلية في الأنبوب بحيث يكون فقط تحت سطح السائل. إعداد مجموعة sonication باستخدام sonicator والتحقيق مع قطر طرف 1/8 بوصة. تعيين sonicator في تردد 20 كيلو هرتز و 50 ٪ السعة.نبض على الوقت من 10 ثانية، ونبض إيقاف الوقت من 60 ثانية. تشغيل بروتوكول صوتنة نبض لمدة ثلاث دورات. ثم استخراج الخلية الخام بالطرد المركزي في 16،000 مرات ز لمدة 30 إلى 45 دقيقة في أربع درجات مئوية حتى lysate خال من أي حطام الخلوية.فحص الخلايا بصريا كما يحدث sonication أمر بالغ الأهمية لضمان أن سونيكيشن عملت كما هو متوقع. العمل في غرفة باردة aliquot 50 ميكرولترات من super الناتجة إلى أنابيب جديدة ملليلتر التأكد من عدم إزعاج بيليه. فلاش تجميد هذه مقتطفات الخلية الخام وضع الأنابيب في حامل أنبوب مع سلسلة غمس تعلق وغمرها في ديوار تحتوي على النيتروجين السائل والتحقق مما إذا كان المجمدة.لأداء التعبير عن البروتين خالية من الخلايا باستخدام قالب الحمض النووي ذوبان 10X مزيج الطاقة حل رئيسي، 4X الحمض الأميني ماجستير مزيج aliquots، والحمض النووي قالب في درجة حرارة الغرفة. ثم إزالة البوليميراز T7 RNA ومثبطات RNAse من الفريزر ناقص 20 درجة مئوية ووضعها على الجليد. مرة واحدة في قالب الحمض النووي، 10X مزيج الطاقة حل رئيسي، و 4X الأحماض الأمينية الرئيسية مزيج يذوب، مكان على الجليد.إعداد مزيج رد فعل خال من الخلايا الرئيسية عن طريق إضافة كل عنصر في الترتيب الدقيق إلى أنبوب مليلتر اثنين على الجليد، ونفض الغبار بلطف الأنبوب بعد كل إضافة إلى المزيج الرئيسي. إزالة فيبريو natriegens الخلية الخام lysate من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية ووضعها على الجليد لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى يذوب. إضافة حجم مناسب من استخراج الخلية الخام المذابة إلى مزيج التفاعل الرئيسي خالية من الخلايا ومزيج بلطف باستخدام ماصة.لأداء نقطة النهاية خالية من الخلايا التعبير البروتين باستخدام thermocycler، أولا إضافة 10 ميكرولترات من مزيج رد فعل تفاعل خالية من الخلايا الرئيسية في بئر من الجزء السفلي من لوحة PCR 96-well مع التأكد من خلط المزيج الرئيسي عن طريق نفض الغبار الأنبوب بلطف بين كل نقل إلى لوحة PCR. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1،000 مرات ز لمدة 10 ثوان لتجميع أي مزيج الرئيسي التي قد تكون عالقة على جانبي الآبار. ثم ختم الآبار مع لاصق لوحة لمنع التبخر.ضع اللوحة في دراجة حرارة حرارية راكد عند 26 درجة مئوية مع غطاء ساخن ينضبط عند 105 درجة مئوية. بعد احتضان التفاعلات في لوحة PCR لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات ، يمكن تنقية البروتينات المعبر عنها ، كمياً واستخدامها في عمليات المصب. لمراقبة حركية التعبير عن البروتين الخالية من الخلايا باستخدام ماص قارئ لوحة 10 ميكرولترات لكل بئر من مزيج التفاعل الرئيسي الخالي من الخلايا إلى الجزء السفلي من لوحة سوداء 384-well ممسحة مع قيعان زجاجية واضحة.وختم الآبار مع لاصق لوحة واضحة لمنع التبخر. ضع لوحة المقايسة في قارئ لوحة مضبوطة عند 26 درجة مئوية وحضن لمدة ثلاث إلى ست ساعات مع مراقبة الإثارة الفلورية المناسبة / الأطوال الموجية للانبعاثات المقابلة للبروتين المعبّر عنه. نظام التعبير خال من الخلايا الموصوفة في هذا البروتوكول تحقيق أفضل النتائج مع قالب dna plasmid تسفر عن كمية أعلى بكثير من البروتين من نفس الكمية من الحمض النووي الخطي كما هو مبين في نقطة النهاية والمقايسات الحركية.ويمكن أيضا استخدام الرنا الرنا التي تولدها ردود الفعل النسخ في المختبر، ولكن هناك حاجة إلى كميات أكبر من مرنا. وقد تأثر إنتاج البروتين بشكل كبير من خلال تركيز أيونات المغنيسيوم والبوتاسيوم. في ظل ظروف محسنة تم العثور على تركيز أيونات المغنيسيوم الأمثل ليكون 3.5 ملليمتر، ولليون البوتاسيوم، 80 ملليمولار.وبالتالي فإن الانحرافات عن هذه التركيزات الأيونية المثلى قد تؤدي إلى انخفاض قدرة هذا التعبير على إنتاج غلات كبيرة من البروتينات. من المهم أن تبقي جميع الكواشف على الجليد أو العمل في غرفة التبريد قدر الإمكان. بالإضافة إلى ذلك، صوتنة السليم والكامل أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول.بعد هذا البروتوكول سيكون لدى المستخدمين القدرة على التعبير عن البروتينات في شكل عالي الإنتاجية ، والتي يمكن استخدامها لتنقية وشاشة لنشاط العديد من البروتينات المختلفة. هذه التقنية توضح استخدام كائنات جديدة ذات خصائص فريدة للتعبير الحر عن الخلايا. فيبريو natriegens هو بكتيريا الهالفيلية سريعة النمو التي قد توفر ظروف فريدة للتعبير عن البروتينات أو جزيئات صغيرة لم يتم استكشافها من قبل في الكائنات العضوية النموذجية الراسخة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

صالحة قابل للغلق غرفة فيمتولتر مجانا خلية علم الأحياء

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

دراسة وظيفة البروتين ودور التعبير البروتين يتغير عن طريق التدخل الأجسام المضادة وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

طريقة لزراعة بيو-ميمريستورس من الوحل العفن

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

تعريف عالي الإنتاجية للمقاومة لـ Pseudomonas syringae pv. الطماطم في الطماطم باستخدام الشتلات الفيضانات أساي

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...