Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 og Institut for energi DE-FG02-02ER63445. Forfatterne vil gerne takke Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam og Dr. Edgar Goluch for nyttige råd om konstruere protokoltjenesten af dette manuskript.

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

DJW, nej, og GMC har indgivet en patent relateret til dette arbejde.

Denne protokol er blevet optimeret til vildtype V. natriegens og bakteriel vækst medier består af LB suppleret med V2 salte (Tabel af materialer). Andre stammer af V. natriegens kan ligeledes kulturperler for at generere rå celle ekstrakter til celle-fri reaktioner; deres anvendelse kræver imidlertid yderligere optimering af denne protokol. Derudover er denne celle-fri protein ekspressionssystem blevet optimeret ved hjælp af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som den primære energikilde regenerering. Andre energi regenerering kilder kan anvendes; men optimering af reagenser og kalibreringen vil sandsynligvis være forpligtet til at opnå høj højtydende protein udtryk10,11.
Særlig opmærksomhed til flere kritiske trin i denne protokol vil sikre maksimal ekstrakt produktivitet for højtforrentede celle-gratis protein produktion. Først, rå celle ekstrakt skal vaere tilberedt af V. natriegens cellekulturer høstet i en midt-eksponentiel vækst; protein udbytte er maksimal, når kulturer nå en OD600 = 1,0 ± 0,2. Mens celle-fri protein produktion er muligt fra celler høstet på en vifte af optiske tætheder, har vi tidligere fundet, at celler høstet i en eksponentiel tilstand af vækst giver betydeligt mere protein9. De observerede virkninger af optisk tæthed på rå celle ekstrakt ydeevne er i overensstemmelse med dem, der indberettes til andre celle-fri udtryk systemer stammer fra celler dyrkes i batch kultur betingelser1. Fordi V. natriegens vokser i et hastigt tempo, er det afgørende at nøje overvåge kulturer optisk tætheder. Generelt forventes det, at V. natriegens kulturer reproducerbar bør nå en OD600 1.0 inden for 1−1.5 h bruger denne protokol; dog forbløffet enkelte vækstbetingelser såsom brugen af versus ikke-forvirret kolber, hvilket påvirker luftning eller luft versus vand inkubation, der påvirker den hastighed og stabilitet i inkubation temperatur, kan ændre vækst tid. Det anbefales generelt at kultur mindst 250 mL af V. natriegens i en 1 L forbløffet kolbe til at sikre en stor celle pellet ved høst for easy manipulation og overførsel. Dette forbedrer succes af rå celle ekstrakt forberedelse samt øger den samlede mængde af ekstrakt fremstillet af en pellet. Når du bruger mindre skala forberedelse, justeres dyrkningsbetingelserne og reagenser korrekt. For storstilet gæring, kan yderligere optimering af kultur betingelser være påkrævet. Endelig, for at sikre høj protein udbytte, det er afgørende, at celle pellets forarbejdes straks efter høst, eller senest 1−2 dage oplagring ved-80 ° C.
Den ordentlig lysering af celle pellet ved puls sonikering er afgørende for succes af celle-fri protein udtryk og er ofte den vanskeligste aspekt af denne protokol for nye brugere. Typisk, en godt lysed pellet vil give en betydelig mængde af flydende ekstrakt, der er fri for snavs. Ekstrakten skal være lidt tyktflydende men kan være let pipetted, når aliquoting i opbevaring rør før flash fryser i flydende kvælstof. Figur 3 viser en repræsentation af en godt lysed pellet (figur 3A) i forhold til et dårligt lysed pellet (figur 3B) efter post lysis centrifugering skridt. En større angivelse af komplet celle lysis er en rå celle ekstrakt total protein koncentration > 20 mg / mL, som bestemmes af en total protein assay (trin 2.13). Overdreven sonikering eller overdreven opvarmning af rå celle ekstrakt vil skade den cellulære maskiner, der ikke kan fastsættes uden at udføre en celle-fri reaktion. Det er således meget gavnligt at teste ekstrakt effektivitet med en kontrol reaktion før afsætte betydelige tid og kræfter til downstream protein udtryk ansøgninger. Mens yderligere optimering kan være nødvendigt for forskellige sonikering udstyr, har pulse sonikering trinene beskrevet været stærkt reproducerbare i vores hænder.
Brug af lineære DNA skabelon afledt af PCR forstærkning, begrænsning enzym digest eller kommercielle gen syntese kan øge kapaciteten til høj overførselshastighed og hurtige protein produktion i celle-fri udtryk systemer24. Mens protein produktion fra PCR forstærket lineær skabelon er blevet påvist, udbyttet af disse reaktioner er ca 13.5-fold lavere sammenlignet med reaktioner ved hjælp af plasmid DNA skabelon på equimolar nøgletal9. Dette skyldes primært ustabiliteten i den lineære DNA-skabelon, som er sandsynligvis nedbrudt af endogene nukleaser stede i V. natriegens rå celle ekstrakt. Mens lambda phage protein GamS har tidligere er blevet anvendt til at beskytte lineære DNA skabelon24,25, konstateredes det, at være uforenelig med V. natriegens ekstrakter9. Derudover mens øger koncentrationen af lineære DNA skabelon kan give mulighed for et højere protein udbytte, vil dens hurtig nedbrydning i rå celle ekstrakt stadig være et stort problem.
En løsning til at overvinde lineære DNA skabelon nedbrydning kan være at supplere celle-fri reaktioner med mRNA skabelon genereret fra in vitro-transskription af lineære DNA. På den anden side brugen af en RNase hæmmer tilbyder betydelig beskyttelse mod mRNA udskrift nedbrydning og mærkbar protein udbyttet kan fås i 10 μL celle-fri reaktion format (figur 5AB). Kloning af lineære DNA i en cirkulær skabelon gennem TA ligatur, kan TOPO kloning, Golden Gate forsamling eller andre rekombination metoder anvendes til at omgå skabelon nedbrydning. Ikke desto mindre vil yderligere tilgange til hæmning af nukleasen aktivitet være nødvendigt for effektiv protein udtryk ved hjælp af lineære DNA skabelon.
Til dato, er blevet foreslået flere forskellige tilgange til tilberedning af rå ekstrakt til celle-fri protein udtryk9,10,11,26. I udviklingen af denne protokol, forsøgte vi at maksimere bruger tilgængelighed, reducere samlede omkostninger og minimere tidskrævende trin. For eksempel, et højt proteinindhold udbytte er opnået ved hjælp af en simpel totrinsproces sonikering-centrifugering, og kræver ikke celle homogenizers, langvarige dialyse trin eller afstrømning reaktion. Det er simpelt at udføre i en kort periode og kræver ikke højt niveau af ekspertise, laboratorium. Det kan således bidrage til at lette celle-fri udtryk som en standard for Translationel akademisk forskning og industriel procesdesign.
Denne protokol udvider toolkit tilgængelig for undersøgelse og nytte af V. natriegens, en ikke-model organisme med unikke biologiske egenskaber. Højere protein udbytte kan opnås ved at ansætte semi - eller fuldt-løbende celle-fri reaktioner, at tillade energi regenerering, genlevering af aminosyrer, og fjernelse af affaldsprodukter3,5,27. Derudover engineering af vildtype V. natriegens at producere DNAse - eller RNAse-mangelfuld stammer, fjernelse af skadelige og konkurrerende stofskifteveje og udtryk for yderligere tRNAer kunne i høj grad øge produktionen af proteiner i Dette system28,29. Som vi optrævle biologi bag sin hurtige vækst, kan videreudvikling af V. natriegens celle-fri systemer fremskynde bioproduktion kapaciteter og aktiverer robust udtryk for terapeutisk peptider, små molekyler og syntetiske materialer.

Celle-fri proteinsyntesen er en alsidig og omkostningseffektiv metode til udtryk af værdifulde proteiner eller peptider1,2,3,4. Celle-fri proteinsyntesen har historisk set udført ved hjælp af Escherichia coli udtryk systemer; dog har der været en nylig bølge i brugen af alternative, ikke-model organismer med nye egenskaber som kabinet for celle-fri udtryk5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unikke metaboliske profiler er prime kandidater som alternativer til E. coli celle-fri systemer. For eksempel, fordobling marine bakterien Vibrio natriegens er det hurtigst voksende alle kendte organismer med en observerede tid på mindre end 10 min.13. Dette har høstet V. natriegens stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for forskning og bioteknologi14,15,16,17,18. Betragtning af, at den hurtige vækst af V. natriegens har været knyttet til høje priser af proteinsyntesen og metaboliske effektivitet19,20,21, udnytte dets cellulære maskiner til celle-fri Sammenfattende kan betydeligt udvide toolkit for hurtig protein produktion og høj overførselshastighed screening.
For nylig, en celle-gratis V. natriegens ekspressionssystem har påvist som er i stand til at producere super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) i koncentrationer på > 260 μg/mL i 3 h med en T7 promotor9. Det overordnede formål at udvikle denne metode var at give brugere med et meget tilgængeligt, omkostningseffektiv, reproducerbare og højtydende celle-fri protein udtryk, der kan forberedes ved hjælp af fælles lab udstyr i en kort tid. Denne protokol udnytter 1 L kulturer i ryste kolber, celle lysering af pulse ultralydbehandling og små batch reaktioner i en 96 - eller 384-godt format at maksimere parallelization og screening overførselshastighed. En lang og vedvarende protein udtryk er muliggjort af tilskud af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som en energi kilde8,22,23. Efter endt denne protokol, en bruger vil have mulighed for at udtrykke en ønskede protein eller sæt af proteiner i en celle-fri format ved hjælp af V. natriegens rå celle uddrag.
Start fra en glycerol bestand, V. natriegens rå celle ekstrakter er fremstillet af celler høstet ved en optisk tæthed på 600 nm (OD600) 1.0. En 1 L kultur vil give ca 2−3 mL ekstrakt, som er tilstrækkelig for mere end 800 celle-fri reaktioner på 25% rå celle ekstrakt. Proteiner kan udtrykkes ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA eller mRNA skabelon; lineære DNA skabelon nedbrydning af endogene nukleaser er imidlertid en stor ulempe ved brug af vildtype V. natriegens celle-fri ordning9. Startende fra V. natriegens kulturer, kan protein brugbar for downstream applikationer opnås ved en enkelt bruger i 1−2 hele dage.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

Marine bakterien Vibrio natriegens har høstet stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for bioteknologien på grund af sin hurtige vækst. En generel protokol er beskrevet til fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter ved hjælp af fælles laboratorieudstyr. Denne høje højtydende protokol har været specielt optimeret til brugeren tilgængelighed og lavere omkostninger. Celle-fri proteinsyntesen (CFPS) kan udføres i lille skala 10 μL batch reaktioner i enten en 96 - eller 384-godt format og reproducerbar giver koncentrationer af > 260 μg/mL super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) inden for 3 h. samlet, rå celle uddrag forberedelse og CFPS kan opnås i 1−2 fulde dage af en enkelt bruger. Denne protokol kan let integreres i eksisterende protein syntese rørledninger til at lette fremskridt inden for bio-produktion og syntetisk biologi applikationer.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Celle-fri udtryk systemer er kraftfulde og omkostningseffektive værktøjer til høj overførselshastighed syntese og screening af vigtige proteiner. Her beskriver vi udarbejdelsen af celle-fri protein udtryk system ved hjælp af Vibrio natriegens til hurtig protein produktion ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA og mRNA skabelon.

Celle-fri Protein udtryk ved hjælp af hurtigt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Vores protokol for cellefri proteinudtryk anvender meget aktivt råekstrakt fra den hurtigt voksende bakterie Vibrio natriegens, som er udarbejdet ved hjælp af en enkel og tidseffektiv totrinssonde-centrifugeringsproces. Råcelleekstrakt forberedelse og celle-fri proteinsyntese kan opnås i en til to dage af en enkelt bruger gør det muligt for denne teknik let at integrere i rørledninger til bioproduktion eller syntetisk biologi applikationer. At begynde at vaske en milliliter af natten Vibrio natriegens kultur ved centrifugering det i en benchtop centrifuge på 10, 600 gange g i et minut.Inspirer supernatanten uden at forstyrre pellet, og resuspend i en milliliter friske LB-V2 medier. Inokuler en milliliter vasket natten kultur i en liter frisk LB-V2 vækstmedier i en autoklaveret fire-liters forvirret Erlenmeyer kolbe med sterilt dække for at opnå en-til-tusind fortynding ration. Vokse kultur på 30 grader Celsius, mens ryster til 225 RPM.Brug et spektrofotometer til at overvåge kulturerne OD 600. Og når den når 1,0 plus eller minus 0,2 høst kulturen ved centrifugering det i to 500-milliliter rør på 3, 500 gange g i 20 minutter ved fire grader Celsius, og derefter placere på is. Inspirer supernatanten og betaf pellets straks.Før du starter cellen lysis procedure cool frisklavet S30 lysis buffer pH 7,7 til ca fire grader Celsius, Brug 10 milliliter af denne kolde S30 lysis buffer til at re-suspendere alle pellets som følge af den samme en liter kultur. Og overfør suspension til et 50-milliliter rør. Centrifuge denne suspension på 3, 500 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og derefter aspirere supernatant uden at forstyrre pellet og læg den på is.Arbejde i et koldt rum tilføje 500 mikroliter af kolde S30 lysis buffer til pellet i 50-milliliter rør placeret på is. Brug en bred borepipettespids til at opslænne pellets og overfør den forsigtigt til et to milliliterrør også på is. For at producere meget aktive rå ekstrakter skal vi sørge for, at cellerne ikke er over fortyndet med S30 buffer, men har nok væske til effektiv sonikering.Fyld et 600 milliliter bægerglas med is og læg en to milliliter rørholder oven på isen. Vortex røret kort for at homogenisere cellerne. Svirp for at fjerne alle celler i bunden af hætten, og placer i rørholderen med hætten åben.Lavere sonicator spids i cellen suspension i røret, så det er lige under den flydende overflade. Forbered sonikering set-up ved hjælp af en soniker og sonde med en 1/8-tommer spids diameter. Indstil sonikatoren til 20 kilohertz frekvens og 50%amplitude.Puls-on tid på 10 sekunder, og puls-off tid på 60 sekunder. Kør puls sonikering protokol for tre cyklusser. Og derefter centrifuge rå celle ekstrakt på 16, 000 gange g i 30 til 45 minutter ved fire grader Celsius, indtil lysate er fri for cellulære snavs.Visuel inspektion af cellelyse som sonikering finder sted, er afgørende for at sikre, at sonikering har fungeret som forventet. Arbejde i et koldt rum aliquot 50 mikroliter af de resulterende supernatants til nye to-milliliter rør og sørg for ikke at forstyrre pellet. For at blinke skal disse råcelleekstrakter anbringes rørene i en rørholder med en dypningsstreng fastgjort og nedsænkes i en dewar, der indeholder flydende nitrogen, og kontroller, om de er frosne.For at udføre cellefrit proteinudtryk ved hjælp af DNA-skabelon tø 10X energi løsning master mix, 4X aminosyre master mix aliquots, og DNA skabelon ved stuetemperatur. Fjern derefter T7 RNA polymerase og RNAse-hæmmerlagrene fra minus 20 grader Celsius-fryseren og læg den på is. Når DNA-skabelonen, 10X energi løsning master mix, og 4X aminosyre master mix er optøet, sted på is.Forbered en cellefri reaktion master mix ved at tilføje hver komponent i den nøjagtige rækkefølge til en to-milliliter rør på is, og forsigtigt svirp røret efter hver tilføjelse til master mix. Fjern Vibrio natriegens rå celle lysate fra minus 80 grader Celsius fryser og sted på is i 10 til 20 minutter, indtil optøet. Tilsæt den passende mængde optøet råcelleekstrakt til den cellefrie reaktionsmasterblanding, og bland forsigtigt ved hjælp af en pipette.For at udføre slutpunkt cellefri protein udtryk ved hjælp af thermocycler, først tilføje 10 mikroliter af celle-fri reaktion master mix per brønd i bunden af en 96-brønd PCR plade og sørg for at blande master mix ved at svippe røret forsigtigt i mellem hver overførsel til PCR plade. Centrifuge pladen ved 1,000 gange g i 10 sekunder for at samle enhver master mix, der kan have været fast på siderne af brøndene. Og derefter forsegle brøndene med en plade lim for at forhindre fordampning.Placer pladen i en termocyr indstillet på 26 grader Celsius med en opvarmet låg indstillet ved 105 grader Celsius. Efter inkubation af reaktionerne i PCR-pladen i mindst tre timer kan udtrykte proteiner renses, kvantificeres og anvendes til downstream-processer. At overvåge cellefri protein udtryk kinetik ved hjælp af en pladelæser pipette 10 mikroliter pr brønd af celle-fri reaktion master mix til bunden af en sort 384-godt analyse plade med klare glasbunde.Og forsegle brøndene med en klar plade lim for at forhindre fordampning. Analysepladen hældes i en pladelæser, der er indstillet til 26 grader Celsius, og inkuberes i tre til seks timer, mens de relevante lysstofrører/emissionsbølgelængder, der svarer til det udtrykte protein, overvåges. Cellefri ekspressionssystem, der er beskrevet i denne protokol, opnår de bedste resultater med plasmid DNA-skabelon, der giver betydeligt større mængde protein end den samme mængde lineært DNA som vist ved endepunkt og kinetiske analyser.mRNA genereret af in vitro transskriptionsreaktioner kunne også anvendes, men der kræves større mængder mRNA. Proteinproduktionens udbytte blev væsentligt påvirket af koncentrationen af magnesium og kaliumioner. Under optimerede forhold blev den optimale magnesiumionkoncentration fundet at være 3,5 millimolar og til kaliumion, 80 millimolar.Således kan afvigelser fra disse optimale ionkoncentrationer resultere i en nedsat evne til dette udtrykssystem til at producere betydelige udbytter af proteiner. Det er vigtigt at holde alle reagenser på is eller arbejde i et kølerum så meget som muligt. Derudover er korrekt og fuldstændig sonikering afgørende for denne protokols succes.Efter denne protokol brugere vil have kapacitet til at udtrykke proteiner i et højt gennemløb format, som kan bruges til at rense og screene for aktivitet af mange forskellige proteiner. Denne teknik demonstrerer brugen af nye organismer med unikke egenskaber for cellefrit udtryk. Vibrio natriegens er en halofil hurtigt voksende bakterie, der kan tilbyde unikke betingelser for ekspression af proteiner eller små molekyler, der tidligere var uudforskede i etablerede modelorganismer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering af komplekse systemer ved hjælp af udformning af eksperimenter Fremgangsmåde: Transient Protein Expression i tobak som et casestudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Forsegles Femtoliter Chamber Arrays for celle-fri Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Studere Protein Funktion og rolle ændret protein Expression af antistof Interferens og Tre-dimensionelle rekonstruktioner

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

En metode til dyrkning af Bio-memristors fra SLIM skimmel

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identifikation af resistens over for Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat ved hjælp af sætteplante Oversvømmelse Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...