Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 en de afdeling van DE energie-FG02-02ER63445. De auteurs bedank Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam en Dr. Edgar Goluch voor nuttig advies over het bouwen van de protocol-sectie van dit manuscript.

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

DJW, Nee, en GMC hebben ingediend te patent verband met dit werk.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor wild-type V. natriegens en bacteriële groei media bestaat uit LB aangevuld met V2 zouten (Tabel van materialen). Andere stammen van V. natriegens kunnen ook worden gekweekt voor het genereren van extracten van de ruwe cel voor cel-vrije reacties; het gebruik ervan vereist echter aanvullende optimalisatie van dit protocol. Bovendien, is deze cel-vrije eiwit expressie systeem geoptimaliseerd met behulp van 3-phosphoglyceric zuur (3-PGA) als de primaire energiebron voor de regeneratie. Andere energiebronnen voor de regeneratie mag worden gebruikt; optimalisatie van reagentia en kalibratie waarschijnlijk zullen echter moeten verkrijgen van hoge opbrengst eiwit expressie10,11.
Specifieke aandacht voor de verschillende kritische stappen in dit protocol zorgt voor maximale extract productiviteit voor hoge opbrengst cel-vrije productie van eiwitten. Eerst, ruwe cel uittreksel moet worden bereid uit V. natriegens celculturen geoogst in een midden-exponentiële fase van groei; eiwit opbrengst is maximale wanneer culturen een OD600 bereiken = 1,0 ± 0,2. Hoewel cel-vrije eiwitproductie uit cellen geoogst op een aantal optische dichtheden mogelijk is, hebben we eerder gevonden dat cellen geoogst in een exponentiële staat van groei aanzienlijk meer eiwit9opleveren. De waargenomen effecten van optische dichtheid op ruwe cel extract prestaties komen overeen met die voor andere cel-vrije expressiesystemen afgeleid van cellen gekweekt in batch cultuur voorwaarden1gerapporteerd. Omdat V. natriegens in een snel tempo groeit, is het essentieel om nauwlettend toe te culturen optische dichtheden. In het algemeen, de verwachting is dat V. natriegens culturen reproducibly tot een OD-600 voor 1.0 binnen 1−1.5 h met gebruikmaking van dit protocol; echter verbijsterd individuele groei omstandigheden zoals het gebruik van versus niet-verbijsterd kolven, welke invloed beluchting, of lucht versus water incubatie, die invloed op de snelheid en stabiliteit van incubatietemperatuur, groei tijd kunnen wijzigen. Bovendien is het in het algemeen aanbevolen om de cultuur van ten minste 250 mL V. natriegens in een maatkolf van 1 L verbijsterd om een grote cel pellet bij de oogst voor gemakkelijke manipulatie en overdracht. Dit verbetert sterk het succes van ruwe cel extract voorbereiding, alsmede verhoging van de totale hoeveelheid extract geproduceerd uit een pellet. Bij het gebruik van kleinere schaal voorbereiding, kunnen kweekomstandigheden en reagentia op passende wijze worden aangepast. Voor grootschalige gisting, kan verdere optimalisatie van de kweekomstandigheden worden verlangd. Tot slot, om ervoor te zorgen eiwitrijk rendement, is het essentieel dat cel pellets worden verwerkt, onmiddellijk na de oogst, of binnen 1−2 dagen na opslaan bij-80 ° C.
De juiste lysis van de cel pellet met het ultrasoonapparaat puls is cruciaal voor het succes van cel-vrije eiwit expressie en is vaak het moeilijkste aspect van dit protocol voor nieuwe gebruikers. Een goed lysed pellet levert meestal een aanzienlijk volume aan vloeibaar extract dat is vrij van vuil. Het extract moet licht viskeuze maar kan gemakkelijk worden pipetted als aliquoting in opslag buizen voordat flash ingevroren in vloeibare stikstof. Figuur 3 toont een vertegenwoordiging van een goed lysed pellet (figuur 3A) in vergelijking met een slecht lysed pellet (figuur 3B) na de post lysis centrifugeren stap. Een belangrijke indicatie van volledige cellysis is een ruwe cel extraheren totaal eiwit concentratie > 20 mg / mL zoals bepaald door een totaal eiwit assay (stap 2.13). Overmatige ultrasoonapparaat of buitensporige verwarming van het extract van de ruwe cel beschadigt de cellulaire machines, die kan niet worden bepaald zonder het uitvoeren van een reactie van cel-vrij. Het is dus zeer gunstig voor het testen van de efficiëntie van het extract met de reactie van een besturingselement voor het wijden van aanzienlijke tijd en moeite aan downstream eiwit expressie toepassingen. Aanvullende optimalisatie nodig kan zijn voor verschillende ultrasoonapparaat apparatuur, zijn de pols ultrasoonapparaat stappen geweest zeer reproduceerbaar in onze handen.
Het gebruik van lineaire DNA sjabloon afgeleid van PCR versterking, restrictie-enzym verificatiesamenvatting of commerciële gene synthese kan de capaciteit voor de productie van hoge-doorvoer en snelle eiwitten in cel-vrije expressie systemen24aanzienlijk verhogen. Terwijl de productie van eiwitten van PCR versterkte lineaire sjabloon heeft aangetoond, de opbrengst van deze reacties zijn ongeveer 13.5-fold lager in vergelijking met reacties met behulp van de plasmide DNA sjabloon bij mengsel ratio's9. Dit is voornamelijk te wijten aan de instabiliteit van de lineaire DNA-sjabloon die afgebroken door endogene nucleasen aanwezig in V. natriegens ruwe cel extract dreigt. Terwijl lambda phage eiwit GamS is eerder gebruikt ter bescherming van lineaire DNA sjabloon24,25, bleek niet compatibel zijn met V. natriegens extracten9. Bovendien, terwijl de verhoging van de concentratie van lineaire DNA sjabloon mogelijk is voor een hoger rendement van de eiwitten, wel zijn snelle degradatie in ruwe cel extract een groot probleem.
Een oplossing voor het overwinnen van lineaire aantasting van de sjabloon van het DNA kan worden ter aanvulling van cel-vrije reacties met mRNA sjabloon gegenereerd op basis van in vitro transcriptie van lineaire DNA. Aan de andere kant, het gebruik van een RNase-remmer biedt aanzienlijke bescherming tegen aantasting van de transcriptie van mRNA en merkbare eiwit opbrengst kunnen worden verkregen in de 10 μL reactie cel-vrij formaat (figuur 5AB). Klonen van lineaire DNA in een circulaire sjabloon via TA afbinding, mogen klonen TOPO, Golden Gate vergadering of andere recombinatie methoden worden gebruikt voor het omzeilen van de aantasting van de sjabloon. Echter zal verdere benaderingen voor remming van de nuclease activiteit nodig zijn voor efficiënte eiwit expressie met behulp van lineaire DNA sjabloon.
Tot op heden zijn verscheidene verschillende benaderingen voorgesteld voor bereiding van ruwe extract voor cel-vrije eiwit expressie9,10,11,26. Bij het ontwikkelen van dit protocol, dat wij willen maximaliseren gebruiker toegankelijkheid, het verminderen van de totale kosten, en het minimaliseren van tijdrovende stappen. Bijvoorbeeld, een eiwitrijk rendement wordt bereikt met behulp van een eenvoudige stappen ultrasoonapparaat-centrifugeren, en vereist geen cel homogeniseerders, lange dialyse stappen of afspoeling reactie. Het is eenvoudig uit te voeren in een korte periode van tijd en vereist geen hoog niveau van deskundigheid van het laboratorium. Het kan dus helpen vergemakkelijken van cel-vrije meningsuiting als een standaard voor het translationeel academisch onderzoek en industrieel procesontwerp.
Dit protocol breidt de toolkit beschikbaar voor onderzoek en het nut van V. natriegens, een niet-model-organisme met unieke biologische eigenschappen. Hogere eiwit opbrengst kan worden bereikt door gebruik te maken van semi - of volledig-continu cel-vrije reacties, met het oog op energie regeneratie, bevoorraden van aminozuren, en de verwijdering van afvalproducten3,5,27. Bovendien, de engineering van wild-type V. natriegens DNAse - of RNAse-deficiënte stammen produceren, verwijdering van schadelijke en concurrerende stofwisselingsroutes en expressie van extra tRNAs kan sterk verbeteren de productie van eiwitten in Dit systeem28,29. Zoals wij de biologie die ten grondslag liggen aan de snelle groei ontrafelen, kan verdere ontwikkelingen van V. natriegens cel-vrije systemen versnellen bioproduction mogelijkheden en robuuste expressie van therapeutische peptiden, kleine moleculen en synthetische inschakelen materialen.

Cel-vrije eiwitsynthese is een veelzijdig en kosteneffectieve methode voor de expressie van waardevolle eiwitten of peptiden1,,2,,3,4. Historisch, is cel-vrije eiwitsynthese uitgevoerd met behulp van Escherichia coli expressiesystemen; echter is er een recente toename in het gebruik van alternatieve, niet-model organismen met nieuwe eigenschappen als chassis voor cel-vrije expressie5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismen met unieke metabolische profielen zijn voornaamste kandidaten als alternatieven voor E. coli cel-vrije systemen. Bijvoorbeeld, verdubbeling de mariene bacterie die Vibrio natriegens is de snelst groeiende van alle bekende organismen met een waargenomen tijd van minder dan 10 min13. Dit oogstte V. natriegens aanzienlijke aandacht als een opkomende microbiële gastheer voor onderzoek en biotechnologie14,15,16,17,18. Gezien het feit dat de snelle groei van V. natriegens gekoppeld aan hoge tarieven voor eiwitsynthese en metabole efficiëntie19,20,21, gebruik te maken van haar mobiele machines voor cel-vrij synthese kan beduidend meer voor de toolkit voor snelle eiwitproductie en high-throughput screening.
Onlangs, een cel-vrij V. natriegens expressie systeem heeft aangetoond dat is geschikt voor het produceren van super map GFP (sfGFP) bij concentraties van > 260 μg/mL in 3 h met een T7 promotor9. Het algemene doel van de ontwikkeling van deze methode was om de gebruikers te voorzien van een zeer toegankelijk, kosten-efficiënte reproduceerbaar en hoge opbrengst van de cel-vrije eiwit expressie systeem dat kan worden bereid met behulp van gemeenschappelijke lab apparatuur in een korte hoeveelheid tijd. Dit protocol maakt gebruik van 1 L culturen in shake kolven, lysis van de cel door puls ultrasoonapparaat en kleinschalige batch reacties in de indeling van een 96 - of 384-goed om paralellisatie en screening van doorvoer te maximaliseren. Een lange, aanhoudende eiwit expressie wordt mogelijk gemaakt door suppletie van 3-phosphoglyceric zuur (3-PGA) als een energie bron8,22,23. Na het succesvol voltooien van dit protocol, een gebruiker zal hebben de mogelijkheid om uit te drukken een gewenste eiwit of set van eiwitten in een cel-vrij formaat met behulp van V. natriegens ruwe cel extraheren.
Vanaf een voorraad van glycerol, V. natriegens ruwe cel extracten bereid zijn uit cellen geoogst op een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) voor 1.0. Een 1 L-cultuur zal opleveren ongeveer 2−3 mL extract, die voldoende is voor meer dan 800 cel-vrije reacties op 25% ruwe cel extract. Eiwitten kunnen worden uitgedrukt met behulp van de plasmide DNA, lineaire DNA of mRNA de sjabloon; lineaire DNA sjabloon afbraak door endogene nucleasen blijft echter een groot nadeel bij het gebruik van wild type V. natriegens de cel-vrij systeem9. Vanaf V. natriegens culturen, kan eiwit bruikbaar voor downstream toepassingen worden bereikt door een enkele gebruiker in 1−2 volle dagen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

De marine bacterie Vibrio natriegens oogstte veel aandacht als een opkomende microbiële gastheer voor de biotechnologie als gevolg van de snelle groei. Een algemeen protocol wordt beschreven voor de bereiding van V. natriegens ruwe cel extracten met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Dit hoge opbrengst protocol is speciaal geoptimaliseerd voor gebruiker toegankelijkheid en lagere kosten. Cel-vrije eiwitsynthese (GVB) kan worden uitgevoerd in kleine schaal 10 μL batch reacties in beide een 96 - of 384-well-indelingen en reproducibly levert concentraties van > 260 μg/mL super map GFP (sfGFP) binnen 3 h. over het geheel genomen, ruwe cel extract voorbereiding en GVB kan worden bereikt in 1−2 volle dagen door één gebruiker. Dit protocol kan gemakkelijk geïntegreerd worden in bestaande eiwit synthese pijpleidingen om vooruitgang in de bio-productie en synthetische biologie toepassingen.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cel-vrije expressiesystemen zijn krachtige en kosten-efficiënte hulpmiddelen voor de synthese van hoog-productie en de screening van belangrijke eiwitten. Hier beschrijven we de voorbereiding van cel-vrije eiwit expressie systeem met behulp van Vibrio natriegens voor de productie van de snelle eiwitten met behulp van de plasmide DNA, lineaire DNA en mRNA sjabloon.

Cel-vrije eiwit expressie met behulp van de snel groeiende bacterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Ons protocol voor celvrije eiwitexpressie maakt gebruik van zeer actief ruw extract uit de snelgroeiende bacterie Vibrio natriegens, die wordt voorbereid met behulp van een eenvoudig en tijd-efficiënt tweestapsonicatie-centrifugatieproces. Ruwe cel extract voorbereiding en cel-vrije eiwitsynthese kan worden bereikt in een tot twee dagen door een enkele gebruiker waardoor deze techniek gemakkelijk worden geïntegreerd in pijpleidingen voor bioproductie of synthetische biologie toepassingen. Om te beginnen wassen een milliliter van de 's nachts Vibrio natriegens cultuur door centrifugeren in een benchtop centrifuge op 10, 600 keer g gedurende een minuut.Aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet, en resuspend in een milliliter van verse LB-V2 media. Inoculeren een milliliter gewassen 's nachts cultuur in een liter verse LB-V2 groeimedia in een autoclaved vier-liter verbijsterd Erlenmeyer fles met steriele dekking te bereiken een-op-een duizend verdunning rantsoen. Kweek cultuur op 30 graden Celsius terwijl schudden tot 225 RPM.Gebruik een spectrofotometer om de culturen OD 600 te controleren. En wanneer het 1,0 plus of min 0,2 oogst oogst de cultuur door het te centrifugeren in twee 500-milliliter buizen op 3, 500 keer g gedurende 20 minuten op vier graden Celsius, en dan op ijs. Aspirate de supernatant en het proces van de pellet onmiddellijk.Gebruik 10 milliliter van deze koude S30 lysis buffer om alle pellets als gevolg van dezelfde één litercultuur opnieuw op te schorten. En breng de vering over naar een buis van 50 milliliter. Centrifuge deze suspensie op 3, 500 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en dan aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet en plaats het op ijs.Werken in een koude kamer voeg 500 microliters van koude S30 lyse buffer aan de pellet in de 50-milliliter buis geplaatst op ijs. Gebruik een brede boring pipet tip om de pellet resuspend en zorgvuldig overbrengen naar een twee-milliliter buis ook op ijs. Om zeer actieve ruwe extracten te produceren moeten we ervoor zorgen dat de cellen niet over verdund zijn met S30-buffer, maar voldoende vloeistof hebben voor een efficiënte sonicatie.Vul een bekerglas van 600 milliliter met ijs en leg een tubehouder van twee milliliter bovenop het ijs. Vortex de buis kort om de cellen te homogeniseren. Veeg om eventuele cellen op de bodem van de dop te verwijderen en plaats in buishouder met open dop.Lagere sonicator tip in de cel suspensie in de buis, zodat het net onder het vloeibare oppervlak. Bereid de sonicatie-opstelling voor met behulp van een sonicator en sonde met een tipdiameter van 1/8 inch. Stel de sonicator in op een frequentie van 20 kilohertz en 50%amplitude.Polstijd van 10 seconden, en puls-off tijd van 60 seconden. Voer het pulssoononicatieprotocol uit voor drie cycli. En dan 30 tot 45 minuten bij vier graden Celsius ruwe celextract centrifugeren tot lysaat vrij is van cellulair puin.Het visueel inspecteren van cellyse als sonicatie plaatsvindt is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat sonicatie heeft gewerkt zoals verwacht. Werken in een koude kamer aliquot 50 microliters van de resulterende supernatants aan nieuwe twee-milliliter buizen ervoor te zorgen niet om de pellet te verstoren. Om te knipperen bevriezen deze ruwe cel extracten plaats de buizen in een buis houder met een dompelen string bevestigd en onderdompelen in een deoorlog met vloeibare stikstof en controleren of bevroren.Om celvrije eiwitexpressie uit te voeren met behulp van DNA-sjabloon dooi 10X energie-oplossing master mix, 4X aminozuur master mix aliquots, en DNA-sjabloon op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de T7 RNA polymerase- en RNAse-remmervoorraden uit de minus 20 graden Celsius vriezer en plaats op ijs. Zodra de DNA-sjabloon, 10X energie-oplossing master mix, en 4X aminozuur master mix zijn ontdooid, plaats op ijs.Bereid een celvrije reactiemastermix door elk onderdeel in de juiste volgorde toe te voegen aan een buis van twee milliliter op ijs en veeg de buis voorzichtig na elke toevoeging aan de mastermix. Verwijder Vibrio natriegens ruwe cel lysate uit de min 80 graden Celsius vriezer en plaats op ijs voor 10 tot 20 minuten ontdooid. Voeg het juiste volume ontdooid ruw celextract toe aan de celvrije reactiemastermix en meng voorzichtig met een pipet.Om endpoint celvrije eiwitexpressie uit te voeren met behulp van thermocycler, voeg u eerst 10 microliters van de celvrije reactiemastermix per put van de bodem van een PCR-plaat met 96 goed toe om de mastermix te mengen door de buis zachtjes tussen elke overdracht naar de PCR-plaat te bewegen. Centrifuge de plaat op 1,000 keer g gedurende 10 seconden tot het zwembad van een master mix die kan zijn geplakt aan de zijkanten van de putten. En sluit de putten af met een plaatlijm om verdamping te voorkomen.Plaats de plaat in een thermocycler ingesteld op 26 graden Celsius met een verwarmd deksel ingesteld op 105 graden Celsius. Na het uitbroeden van de reacties in de PCR-plaat gedurende minimaal drie uur, kunnen uitgedrukte eiwitten worden gezuiverd, gekwantificeerd en gebruikt voor downstreamprocessen. Om cel-vrije eiwit expressie kinetiek met behulp van een plaatlezer pipet 10 microliters per put van de cel-vrije reactie master mix te controleren tot de bodem van een zwarte 384-well assay plaat met heldere glazen bodems.En sluit de putten af met een heldere plaatlijm om verdamping te voorkomen. Plaats de testplaat in een plaatlezer die op 26 graden Van Celsius wordt geplaatst en incubbate drie tot zes uur terwijl het controleren van de aangewezen fluorescente opwinding/emissiegolflengten die aan het uitgedrukte eiwit overeenkomen. Cel-vrije expressie systeem beschreven in dit protocol bereiken de beste resultaten met plasmid DNA template opbrengst aanzienlijk hogere hoeveelheid eiwit dan dezelfde hoeveelheid lineair DNA, zoals blijkt uit eindpunt en kinetische testen.mRNA gegenereerd door in-vitro transcriptie reacties kunnen ook worden gebruikt, maar hogere hoeveelheden mRNA zijn vereist. De opbrengst van de eiwitproductie werd aanzienlijk beïnvloed door de concentratie magnesium en kaliumionen. Onder geoptimaliseerde omstandigheden bleek de optimale magnesiumionconcentratie 3,5 millimolar te zijn en voor kaliumion, 80 millimolar.Zo kunnen afwijkingen van deze optimale ionenconcentraties resulteren in een verminderde capaciteit voor dit expressiesysteem om aanzienlijke opbrengsten van eiwitten te produceren. Het is belangrijk om alle reagentia zoveel mogelijk op ijs te houden of in een koelcel te werken. Bovendien is een goede en volledige sonicatie van cruciaal belang voor het succes van dit protocol.Na dit protocol zullen gebruikers de capaciteit hebben om eiwitten uit te drukken in een hoge doorvoervorm, die kan worden gebruikt om te zuiveren en te screenen op activiteit van veel verschillende eiwitten. Deze techniek toont het gebruik van nieuwe organismen met unieke eigenschappen voor celvrije expressie. Vibrio natriegens is een halofiele snelgroeiende bacterie die unieke voorwaarden kan bieden voor expressie van eiwitten of kleine moleculen die voorheen onontgonnen waren in gevestigde modelorganismen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

Een methode voor het kweken van Bio-memristors uit Slime schimmel

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identificatie van resistentie tegen Pseudomonas syringae pv. Tomaat in Tomaat met seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...