Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
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Ce travail a été financé par le National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 et le ministère de l’énergie DE-FG02-02ER63445. Les auteurs aimeraient remercier Dr. Richard Kohman, Dre Jenny Tam et Dr Edgar Goluch pour obtenir des conseils utiles sur la construction de la section protocole de ce manuscrit.

<ol>
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FILY, NO, et GMC ont déposé un brevet lié à ce travail.

Ce protocole a été optimisé pour sauvage V. natriegens et milieux de culture bactérienne composée de LB additionné de sels V2 (Table des matières). Autres souches de V. natriegens peuvent être cultivées de la même façon pour générer cellulaire brut extraits des réactions acellulaire ; Toutefois, leur utilisation nécessite une optimisation supplémentaire du présent protocole. En outre, ce système d’expression de protéine acellulaire a été optimisé à l’aide de l’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) comme la source de régénération d’énergie primaire. Autres sources de régénération d’énergie peuvent être utilisés ; Cependant, optimisation de réactifs et l’étalonnage sera probablement obligée d’obtenir haut rendement protéines expression10,11.
Une attention particulière à plusieurs étapes cruciales dans ce protocole assurera la productivité maximale extrait pour haut rendement acellulaire la production de protéines. Tout d’abord, extrait cellulaire brut doit être préparé à partir V. natriegens cell cultures récoltées dans une phase de milieu-exponentielle de croissance ; rendement de protéine est maximale quand cultures atteignent une OD600 = 1,0 ± 0,2. La production de protéines acellulaire est possible à partir de cellules prélevées à différentes densités optiques, nous avons constaté précédemment que cellules récoltées dans un état exponentiels de croissance donnent beaucoup plus de protéines9. Les effets observés de la densité optique sur performance extrait cellulaire brut concordent avec ceux rapportés pour d’autres systèmes acellulaires expression dérivées de cellules cultivées dans des conditions de culture lot1. Parce que V. natriegens croît à un rythme rapid, il est essentiel de suivre de près les densités optiques des cultures. En général, il est prévu que V. natriegens cultures devraient atteindre reproductible un OD600 de 1,0 dans les 1−1.5 h utilisant ce protocole ; Toutefois, des conditions de croissance individuels tels que l’utilisation de dérouté par rapport aux flacons non-déconcerté, qui affecte l’aération, ou l’air contre l’incubation de l’eau, qui influe sur le taux et la stabilité de la température d’incubation, peuvent modifier les temps de croissance. En outre, il est généralement recommandé d’au moins 250 mL de V. natriegens dans un ballon jaugé de 1 L dérouté afin d’assurer une boulette de grandes cellules à la récolte pour une manipulation facile et le transfert de la culture. Cela améliore grandement le succès de la préparation d’extrait cellulaire brut ainsi que des augmentations le volume total d’extrait issu une boulette. Lorsque vous utilisez la plus petite préparation d’échelle, les réactifs et les conditions de culture peuvent être ajustés correctement. Pour la fermentation à grande échelle, outre l’optimisation des conditions de culture peut être nécessaire. Enfin, afin d’assurer un rendement de haute teneur en protéines, il est primordial que les granules cellulaires soient traités immédiatement après la récolte, ou 1−2 jours de stockage à-80 ° C.
Provoquer la lyse adéquate dans le culot cellulaire par sonication impulsion est essentielle à la réussite de l’expression protéique acellulaire et est souvent l’aspect le plus difficile du présent protocole pour les nouveaux utilisateurs. En règle générale, une boulette bien lysée produira un volume important d’extrait liquide exempt de débris. L’extrait doit être légèrement visqueux, mais peut être facilement distribué lorsque aliquotage en stock tubes avant congélation dans l’azote liquide flash. La figure 3 illustre une représentation d’une pastille bien lysée (Figure 3 a) en comparaison avec une boulette de mal lysée (Figure 3 b) après l’étape de centrifugation de lyse post. Une indication majeure de la lyse cellulaire complet est un cellulaire brut extrait de protéine totale concentration > 20 mg / mL, tel que déterminé par un dosage des protéines totales (étape 2.13). Sonication excessive ou un réchauffement excessif de l’extrait cellulaire brut risquent d’endommager la machinerie cellulaire, qui ne peut être déterminée sans effectuer une réaction acellulaire. Ainsi, il est très bénéfique pour tester l’efficacité d’extrait avec une réaction de contrôle avant de consacrer beaucoup de temps et d’efforts aux applications expression de protéine en aval. Une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour l’équipement de sonication différents, les étapes de sonication impulsions décrites ont été hautement reproductibles dans nos mains.
L’utilisation de la matrice d’ADN linéaire provenant de PCR amplification, digest de l’enzyme de restriction ou synthèse de gène commerciales peut augmenter considérablement la capacité de production de la protéine rapide et à haut débit à l’expression acellulaire systèmes24. Alors que la production de protéines du modèle linéaire amplification PCR a été démontrée, le rendement de ces réactions sont environ 13.5-fold inférieur par rapport aux réactions à l’aide de plasmide matrice d’ADN à des taux équimolaires9. C’est principalement en raison de l’instabilité de la matrice d’ADN linéaire qui est probablement dégradé par les nucléases endogènes présents dans V. natriegens cellulaire brut extrait. Tandis que phage lambda protéine GamS a été précédemment utilisé pour protéger l’ADN linéaire modèle24,25, il a été constaté incompatible avec V. natriegens extraits9. En outre, alors que l’augmentation de la concentration de la matrice d’ADN linéaire peut permettre un rendement plus élevé de protéine, sa dégradation rapide dans l’extrait cellulaire brut sera toujours un problème majeur.
Une solution pour surmonter la dégradation de l’ADN linéaire pour modèle peut-être compléter acellulaire réactions avec messagère généré par transcription in vitro de l’ADN linéaire. En revanche, l’utilisation d’un inhibiteur de RNase offre une protection significative contre la dégradation des ARNm transcription et peuvent obtenir des rendements de protéines appréciable dans le format de réaction acellulaire 10 μL (Figure 5 aB). Clonage d’ADN linéaire dans un modèle circulaire par ligature TA, TOPO clonage, un assemblage de Golden Gate ou autres méthodes de recombinaison peuvent servir à contourner la dégradation du modèle. Néanmoins, outre des approches pour l’inhibition de l’activité nucléasique sera nécessaires pour l’expression de la protéine efficace à l’aide de la matrice d’ADN linéaire.
A ce jour, plusieurs approches différentes ont été proposées pour la préparation d’extrait brut de proteines acellulaires expression9,10,11,26. Dans l’élaboration de ce protocole, nous avons cherché à maximiser l’accessibilité de l’utilisateur, réduire le coût global et minimiser les étapes fastidieuses. Par exemple, un rendement de haute teneur en protéines est obtenu grâce à un processus de sonication-centrifugation simple en deux étapes et ne nécessite pas d’homogénéisateurs de cellule, marches de dialyse longue ou réaction de ruissellement. Il est simple à exécuter dans un court laps de temps et ne nécessite pas de haut niveau d’expertise de laboratoire. Ainsi, il peut aider à faciliter l’expression sans cellule comme un standard pour la recherche translationnelle et conception des procédés industriels.
Ce protocole s’étend de la boîte à outils disponible pour l’enquête et l’utilité du V. natriegens, un organisme non-modèle avec des propriétés biologiques uniques. Rendement plus élevé de protéine peut être réalisé en employant les réactions acellulaire semi - ou entièrement-continu, afin de permettre la régénération de l’énergie, pour ravitailler des acides aminés et l’élimination des déchets produits3,5,27. En outre, l’ingénierie de type sauvage V. natriegens pour produire des souches de DNAse - ou RNAse-deficient, enlèvement des voies métaboliques délétères qui se font concurrence et l’expression des Arnt supplémentaires pourraient améliorer considérablement la production de protéines dans ce système28,29. Comme nous démêler la biologie qui sous-tendent sa croissance rapide, poursuite de V. natriegens systèmes acellulaires peut-être accélérer les capacités de bioproduction et activer l’expression robuste de peptides thérapeutiques, de petites molécules et synthétique matériaux.

La synthèse protéique acellulaire est une méthode souple et rentable pour l’expression de précieuses protéines ou de peptides1,2,3,4. Historiquement, la synthèse protéique acellulaire a été réalisée à l’aide de systèmes d’expression Escherichia coli ; Cependant, il y a eu une montée subite récente dans l’utilisation des organismes alternatifs, non-modèle avec nouvelles propriétés comme châssis pour expression acellulaire5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. les organismes avec des profils métaboliques uniques sont les candidats principaux comme alternatives aux systèmes acellulaires d’e. coli . Par exemple, la bactérie marine que Vibrio natriegens est la plus forte croissance de tous les organismes connus avec un observé doublement durée inférieure à 10 min13. Il a recueilli V. natriegens une attention considérable comme un hôte microbien émergent pour la recherche et la biotechnologie14,15,16,17,18. Étant donné que le taux de croissance rapide de V. natriegens a été liée à des taux élevés de la synthèse des protéines et de l’efficacité métabolique19,20,21, exploiter sa machinerie cellulaire pour acellulaire la synthèse peut élargir considérablement l’outil pour la production de protéines rapides et criblage à haut débit.
Récemment, un acellulaire V. natriegens système d’expression a été démontrée, qui est capable de produire des super dossier GFP (sfGFP) à des concentrations de 260 > μg/mL en 3 h avec un T7 promoteur9. L’objectif général de mettre au point cette méthode était de fournir aux utilisateurs un système d’expression très accessibles, rentables, reproductible et à rendement élevé de protéine acellulaire qui peut être préparé à l’aide de matériel de laboratoire commun dans un court laps de temps. Ce protocole utilise les cultures 1 L en flacons agitateurs, lyse cellulaire par sonication impulsion et réactions de lot à petite échelle dans un format de 96 ou 384 puits afin de maximiser la parallélisation et débit de dépistage. Une expression de la protéine longue et soutenue est rendue possible par la supplémentation d’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) comme une énergie source8,22,23. Après avoir réussi ce protocole, un utilisateur aura la capacité d’exprimer une protéine désirée ou d’un ensemble de protéines sous forme acellulaire utilisant V. natriegens cellulaire brut extrait.
À partir d’un stock de glycérol, V. natriegens des extraits cellulaires bruts sont préparés à partir de cellules prélevées sur une densité optique à 600 nm (OD600) de 1,0. Une culture de L 1 produira environ 2−3 mL d’extrait, qui est suffisante pour plus de 800 acellulaire des réactions à l’extrait cellulaire brut de 25 %. Les protéines peuvent être exprimées à l’aide de l’ADN plasmidique, l’ADN linéaire ou messagère ; dégradation de modèle ADN linéaire par les nucléases endogènes reste cependant un inconvénient majeur lors de l’utilisation de système de type sauvage, V. natriegens acellulaire9. À partir de cultures de V. natriegens , protéines utilisables pour les applications en aval est possible par un seul utilisateur 1−2 jours complets.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

La bactérie marine Vibrio natriegens a suscité une attention considérable comme un hôte microbien émergent de biotechnologie en raison de son taux de croissance rapide. Un protocole général est décrit pour la préparation des extraits du V. natriegens cellulaire brut à l’aide d’équipement de laboratoire commun. Ce protocole à rendement élevé a été spécifiquement optimisé pour l’accessibilité de l’utilisateur et à un coût réduit. La synthèse des protéines acellulaire (CFPS) peut être effectuée à petite échelle 10 μL lot réactions selon un format de 96 ou 384 puits et reproductible des rendements des concentrations de 260 > dossier super μg/mL GFP (sfGFP) au sein de 3 h. Globalement, cellulaire brut extrait préparation et PFC est possible 1−2 jours complets à un seul utilisateur. Ce protocole peut être facilement intégré dans des conduites de synthèse de protéines existantes afin de faciliter les progrès de la bio-production et applications de la biologie synthétique.

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Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Systèmes d’expression acellulaires sont des outils puissants et rentables pour la synthèse de haut débit et la présélection des protéines importantes. Nous décrivons ici la préparation du système d’expression de protéine acellulaire à l’aide de Vibrio natriegens pour la production de protéine rapide à l’aide de l’ADN plasmidique, ADN linéaire et messagère.

Acellulaire Protein Expression utilisant la rapide croissance bactérie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Notre protocole pour l’expression des protéines sans cellules utilise de l’extrait brut très actif de la bactérie à croissance rapide Vibrio natriegens, qui est préparé à l’aide d’un processus simple et efficace en deux étapes de sonication-centrifugation. La préparation de l’extrait de cellules brutes et la synthèse de protéines sans cellules peuvent être réalisées en un à deux jours par un seul utilisateur permettant à cette technique d’être facilement intégrée dans les pipelines pour des applications de bioproduction ou de biologie synthétique. Pour commencer à laver un millilitre de la nuit Vibrio natriegens culture en le centrifugant dans une centrifugeuse benchtop à 10, 600 fois g pendant une minute.Aspirez le supernatant sans déranger la pastille, et résuspendez en un millilitre de médias LB-V2 frais. Inoculer un millilitre de culture de nuit lavée dans un litre de liquide frais de croissance LB-V2 dans un autoclavé de quatre litres déconcerté flacon Erlenmeyer avec couvercle stérile pour atteindre une à mille ration de dilution. Cultivez la culture à 30 degrés Celsius tout en secouant à 225 RPM.Utilisez un spectrophotomètre pour surveiller les cultures OD 600. Et quand il atteint 1,0 plus ou moins 0,2 récolte la culture en la centrifugant dans deux tubes de 500 millilitres à 3500 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis placer sur la glace. Aspirer le surnatant et traiter la pastille immédiatement.Avant de commencer la procédure de lyse cellulaire refroidir fraîchement préparé S30 lysis tampon pH 7,7 à environ quatre degrés Celsius, Utilisez 10 millilitres de ce tampon froid de lyse S30 pour re-suspendre toutes les granulés résultant de la même culture d’un litre. Et transférer la suspension dans un tube de 50 millilitres. Centrifugez cette suspension à 3500 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirez le supernatant sans déranger la pastille et placez-la sur la glace.En travaillant dans une pièce froide, ajouter 500 microlitres de tampon de lyse S30 froid à la pastille dans le tube de 50 millilitres placé sur la glace. Utilisez une pointe de pipette à alésage large pour résuspendre la pastille et la transférer soigneusement dans un tube de deux millilitres également sur la glace. Afin de produire des extraits bruts très actifs, nous devons nous assurer que les cellules ne sont pas sur diluées avec le tampon S30, mais ont suffisamment de liquide pour une sonication efficace.Remplissez un bécher de 600 millilitres de glace et placez un support de tube de deux millilitres sur la glace. Vortex le tube brièvement pour homogénéiser les cellules. Feuilletez pour enlever toutes les cellules sur le fond du bouchon, et placez-les dans le support de tube avec le chapeau ouvert.Bas de la pointe du sonicateur dans la suspension cellulaire dans le tube de sorte qu’il est juste sous la surface liquide. Préparez la mise en place de la sonication à l’aide d’un sonicateur et d’une sonde d’un diamètre de pointe de 1/8 pouce. Réglez le sonicateur à 20 kilohertz de fréquence et 50% d’amplitude.Temps d’impulsion de 10 secondes et temps d’impulsion de 60 secondes. Exécutez le protocole de sonication des impulsions pendant trois cycles. Et puis centrifugeuse extrait de cellules brutes à 16 000 fois g pendant 30 à 45 minutes à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le lysate soit exempt de débris cellulaires.Il est essentiel d’inspecter visuellement la lyse cellulaire à mesure que la sonication a lieu pour s’assurer que la sonication a fonctionné comme prévu. Travailler dans une chambre froide aliquot 50 microlitres des supernatants résultants à de nouveaux tubes de deux millilitres en s’assurant de ne pas déranger la pastille. Pour congeler flash ces extraits de cellules brutes placer les tubes dans un support de tube avec une corde de trempage attaché et plonger dans une dewar contenant de l’azote liquide et vérifier si congelés.Pour effectuer l’expression des protéines sans cellules à l’aide du modèle d’ADN décongeler 10X mélange maître solution énergétique, 4X acides aminés maître mélange aliquots, et modèle d’ADN à température ambiante. Retirez ensuite les stocks d’inhibiteurs de l’ARN T7 et du RNAse du congélateur de moins 20 degrés Celsius et placez-les sur la glace. Une fois le modèle d’ADN, le mélange maître de solution énergétique 10X et le mélange maître des acides aminés 4X sont décongelés, placez-les sur de la glace.Préparez un mélange maître de réaction sans cellule en ajoutant chaque composant dans l’ordre précis à un tube de deux millilitres sur la glace, et faites glisser doucement le tube après chaque ajout au mélange principal. Retirer le lysate brut Vibrio natriegens du congélateur de moins 80 degrés Celsius et le placer sur la glace pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce qu’ils soient décongelés. Ajouter le volume approprié d’extrait brut décongelé de cellules au mélange maître de réaction sans cellules et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette.Pour effectuer l’expression des protéines sans cellules de point de terminaison à l’aide du thermocycleur, ajoutez d’abord 10 microlitres du mélange maître de réaction sans cellules par puits du fond d’une plaque PCR de 96 puits en vous assurant de mélanger le mélange principal en faisant glisser doucement le tube entre chaque transfert à la plaque PCR. Centrifugeuse la plaque à 1000 fois g pendant 10 secondes pour mettre en commun tout mélange maître qui aurait pu être collé sur les côtés des puits. Et puis sceller les puits avec un adhésif plaque pour empêcher l’évaporation.Placez la plaque dans un thermocycleur fixé à 26 degrés Celsius avec un couvercle chauffant fixé à 105 degrés Celsius. Après avoir incubé les réactions dans la plaque PCR pendant au moins trois heures, les protéines exprimées peuvent être purifiées, quantifiées et utilisées pour les processus en aval. Pour surveiller la cinétique d’expression protéique sans cellules à l’aide d’une pipette de lecteur de plaques 10 microlitres par puits du mélange maître de réaction sans cellules au fond d’une plaque noire d’analyse de 384 puits avec des fonds de verre clairs.Et sceller les puits avec un adhésif de plaque claire pour empêcher l’évaporation. Placez la plaque d’essai dans un lecteur de plaque fixé à 26 degrés Celsius et incubez pendant trois à six heures tout en surveillant les longueurs d’onde fluorescentes/d’émission appropriées correspondant à la protéine exprimée. Système d’expression sans cellules décrit dans ce protocole obtenir les meilleurs résultats avec modèle d’ADN plasmide donnant une quantité significativement plus élevée de protéines que la même quantité d’ADN linéaire que montré par le point final et les analyses cinétiques.L’ARNm généré par des réactions de transcription in vitro pourrait également être utilisé, mais des quantités plus élevées d’ARNm sont nécessaires. Le rendement de la production de protéine a été sensiblement affecté par la concentration des ions de magnésium et de potassium. Dans des conditions optimisées, la concentration optimale d’ion de magnésium s’est trouvée à 3,5 millimolar et pour l’ion de potassium, 80 millimolar.Ainsi, les écarts par rapport à ces concentrations optimales d’ion peuvent entraîner une diminution de la capacité de ce système d’expression à produire des rendements significatifs de protéines. Il est important de garder tous les reagents sur la glace ou de travailler dans une chambre froide autant que possible. En outre, une sonication appropriée et complète est essentielle au succès de ce protocole.Suivant ce protocole, les utilisateurs auront la capacité d’exprimer des protéines dans un format à haut débit, qui peut être utilisé pour purifier et dépister l’activité de nombreuses protéines différentes. Cette technique démontre l’utilisation de nouveaux organismes aux propriétés uniques pour la libre expression cellulaire. Vibrio natriegens est une bactérie halophile à croissance rapide qui peut offrir des conditions uniques pour l’expression de protéines ou de petites molécules auparavant inexplorées dans les organismes modèles établis.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Recherche

Bio-ingénierie

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Caractérisation des systèmes complexes à l&#39;aide de la conception des expériences approche: l&#39;expression transitoire de protéines dans le tabac comme une étude de cas

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Tableaux Scellable femtolitre Chambre pour la biologie acellulaire

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Etudier la fonction des protéines et le rôle de Altered Expression des protéines par les interférences des anticorps et des reconstructions tridimensionnelles

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

Une méthode pour cultiver Bio-memristors de myxomycètes

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

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Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

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Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...