Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 und Abteilung von Energie-DE-FG02-02ER63445 finanziert. Die Autoren möchten Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam und Dr. Edgar Goluch Danke für hilfreiche Tipps zu konstruieren die Protokoll-Abschnitt des Manuskripts.

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DJW, Nein, und GMC haben meldete ein Patent im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

Dieses Protokoll wurde für Wildtyp V. Natriegens und Bakterienwachstum Medien bestehend aus LB ergänzt mit V2 Salze (Table of Materials) optimiert. Andere Stämme von V. Natriegens können in ähnlicher Weise kultiviert werden, um grobe Zellextrakte für zellfreie Reaktionen zu erzeugen; Ihr Einsatz erfordert jedoch zusätzliche Optimierung dieses Protokolls. Darüber hinaus wurde dieses zellfreien Protein Ausdruck System optimiert, mit 3-Phosphoglyceric-Säure (3-PGA) als die primäre Energiequelle für die Regeneration. Andere Energiequellen Regeneration können verwendet werden; Optimierung von Reagenzien und Kalibrierung werden jedoch wahrscheinlich zu hoch ertragreiche Protein Ausdruck10,11erwerben.
Besondere Aufmerksamkeit auf einige wichtige Schritte in diesem Protokoll sorgt für maximale Extrakt Produktivität für ertragreiche zellfreien Protein-Produktion. Zunächst groben Zelle extrahieren muss bereit sein, von V. Natriegens Zellkulturen geerntet in eine Mitte-exponentielle Wachstumsphase; Proteinausbeute ist maximal, wenn Kulturen eines OD600 erreichen = 1,0 ± 0,2. Während zellfreien Protein-Produktion von Zellen in einem Bereich der optischen Dichte möglich ist, haben wir bereits festgestellt, dass Zellen in einem exponentiellen Wachstum deutlich mehr Protein9ergeben. Die beobachteten Effekte der optischen Dichte auf Rohöl Zellleistung Extrakt entsprechen denen anderer zellfreie Expressionssysteme Zellen gezüchtet in Batch-Kultur-Bedingungen-1abgeleitet. Da V. Natriegens rasant wächst, ist es wichtig zu optischen Dichte der Kulturen verfolgen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass V. Natriegens Kulturen reproduzierbar ein OD600 von 1,0 in 1−1.5 h unter Verwendung dieses Protokolls erreichen sollte; allerdings verblüfft individuelle Wachstumsbedingungen wie die Verwendung von versus nicht ratlos Flaschen, welche Affekte Belüftung oder Luft im Vergleich zu Wasser Inkubation, betrifft die Geschwindigkeit und Stabilität der Inkubationstemperatur Wachstumszeit verändern können. Darüber hinaus empfiehlt es im allgemeinen Kultur mindestens 250 mL V. Natriegens in einem 1 L ratlos Kolben um eine große Zelle Pellet bei der Ernte für einfache Handhabung und Übertragung zu gewährleisten. Dies verbessert den Erfolg der groben Zelle Extrakt Zubereitung sowie steigt das Gesamtvolumen der Auszug aus einem Pellet hergestellt. Bei der Verwendung von kleineren Maßstab Vorbereitung können Kulturbedingungen und Reagenzien entsprechend angepasst werden. Für die groß angelegte Gärung weitere sein Optimierung der Kulturbedingungen erforderlich. Schließlich um proteinreiche Ausbeute zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Zelle Pellets sofort nach der Ernte oder innerhalb von 1−2 Tagen Lagerung bei-80 ° c verarbeitet werden
Die richtige lyse der Zelle Pellet durch Puls Ultraschallbehandlung ist entscheidend für den Erfolg der zellfreien Proteinexpression und ist oft der schwierigste Aspekt dieses Protokolls für neue Benutzer. Ein gut lysierten Pellet wird in der Regel einen signifikanten Teil der Flüssigextrakt hervorbringen, die frei von Fremdkörpern ist. Der Extrakt sollte leicht viskose aber kann leicht pipettiert werden, wenn Rohre Aliquotierung Einlagerung vor Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Abbildung 3 zeigt eine Darstellung eines gut lysierten Pellet (Abbildung 3A) im Vergleich zu einem schlecht lysierten Pellet (Abb. 3 b) nach der Post Lyse Zentrifugationsschritt. Ein wichtiger Indikator für vollständige Zelle Lysis ist eine grobe Zelle extrahieren Gesamtprotein Konzentration > 20 mg / mL eine Gesamt-Protein Assay (Schritt 2.13) bestimmt. Übermäßige Anwendung von Ultraschall oder übermäßige Erhitzung des groben Zelle Extraktes beschädigen die zelluläre Maschinerie, die ohne Durchführung einer zellfreien Reaktion nicht ermittelt werden kann. Daher ist es sehr vorteilhaft, Extrakt Effizienz mit einem Kontrollreaktion bevor widmet viel Zeit und Mühe auf nachgelagerten Protein Ausdruck Anwendungen testen. Zusätzliche Optimierung für verschiedene Beschallung Geräte erforderlich sind, wurden die beschriebenen Schritte zur Beschallung der Puls hoch reproduzierbare in unseren Händen.
Die Verwendung von linearen DNA-Vorlage abgeleitet von PCR-Amplifikation, Restriktionsenzym verdauen oder kommerzielle Gensynthese kann die Kapazität für hohen Durchsatz und schnelle Proteinproduktion in zellfreien Ausdruck Systeme24deutlich erhöhen. Während Protein-Produktion von PCR amplifizierten lineare Vorlage wurde nachgewiesen, die Ausbeute dieser Reaktionen sind etwa 13.5-fold niedriger im Vergleich zu Reaktionen mit Plasmid DNA Schablone äquimolaren Verhältnisse9. Dies ist in erster Linie aufgrund der Instabilität der linearen DNA-Vorlage dürfte abgebaut durch endogene Nukleasen in V. Natriegens groben Zelle extrahieren vorhanden. Während des Lambda-Phagen Protein GamS hat früher zum Schutz der lineare DNA Schablone24,25, ergab für unvereinbar mit V. Natriegens 9extrahiert. Darüber hinaus während Erhöhung der Konzentration von linearen DNA Schablone für einen höheren Eiweiß-Ertrag ermöglichen, werden seinen schnellen Abbau in groben Zelle Extrakt nach wie vor ein großes Problem.
Eine Lösung zur Überwindung der linearen DNA Schablone Verschlechterung möglicherweise zellfreie Reaktionen mit mRNA Vorlage generiert aus in-vitro-Transkription von linearen DNA zu ergänzen. Auf der anderen Seite die Verwendung von ein RNase-Inhibitor bietet erhebliche Schutz gegen mRNA-Transkript-Abbau und spürbare Protein Erträge erhalten Sie in den 10 μL zellfreie Reaktion Format (Abbildung 5AB). Klonen von linearen DNA in eine kreisförmige Vorlage durch TA Ligation, können TOPO Klonen, Golden Gate Montage oder Rekombination Methoden zur Vorlage Abbau zu umgehen. Dennoch werden weitere Ansätze zur Hemmung der Aktivität der Nuklease für effiziente Proteinexpression mit linearen DNA Schablone erforderlich sein.
Bisher wurden verschiedene Ansätze zur Vorbereitung von Rohöl Extrakt zellfreien Protein Ausdruck9,10,11,26vorgeschlagen. Bei der Entwicklung dieses Protokolls, haben wir versucht, maximale Zugänglichkeit Benutzer, reduzieren Gesamtkosten und zeitaufwändigen Schritte zu minimieren. Zum Beispiel ein hohen Protein-Ertrag erfolgt über einen einfachen Schritten Beschallung-Zentrifugation und erfordert keine Zelle Homogenisatoren, langwierige Dialyse Schritte oder Run-off Reaktion. Es ist einfach, in kurzer Zeit auszuführen und erfordert keine hohe Labor Kompetenz. So kann es helfen, zellfreie Ausdruck als Standard für die translationale Forschung und industrielle Prozess-Design zu erleichtern.
Dieses Protokoll erweitert das Toolkit für Untersuchung und den Nutzen von V. Natriegens, nicht-Modellorganismus mit einzigartigen biologischen Eigenschaften zur Verfügung. Höherer Eiweiß-Ertrag erzielt werden, durch den Einsatz von halb - oder voll-ständige zellfreie Reaktionen zu ermöglichen, Energierückgewinnung, Nachschub von Aminosäuren und die Beseitigung der Abfallprodukte3,5,27. Darüber hinaus könnte das Engineering von Wildtyp V. Natriegens , DNAse oder RNAse-defizienten Stämme produzieren, Entfernung von schädlichen und konkurrierenden Stoffwechselwege und Ausdruck der zusätzlichen tRNAs erheblich die Produktion von Proteinen in verbessern Dieses System28,29. Da wir die Biologie zugrunde liegenden seines schnellen Wachstums entwirren, kann Weiterentwicklung von V. Natriegens zellfreien Systemen Bioproduktion Fähigkeiten zu beschleunigen und ermöglichen robuste Ausdruck der therapeutischen Peptide, small Molecules und synthetische Materialien.

Zellfreie Proteinsynthese ist eine vielseitige und kostengünstige Methode für die Ausprägung der wertvollen Proteine oder Peptide1,2,3,4. In der Vergangenheit wurde zellfreie Proteinsynthese mit Escherichia coli Expressionssysteme durchgeführt; Es wurde jedoch eine neue Schwankung im Umgang mit Alternativen, nicht-Modell Organismen mit neuartigen Eigenschaften als Fahrgestell für zellfreie Expression5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. Organismen mit einzigartigen Stoffwechselprofile sind Hauptkandidaten als Alternativen zu E. Coli zellfreien Systemen. Zum Beispiel Verdopplungszeit des marinen Bakteriums Vibrio Natriegens ist die am schnellsten wachsende aller bekannten Organismen mit einer beobachteten von weniger als 10 min13. Dies hat V. Natriegens große Aufmerksamkeit als eine aufstrebende mikrobielle Host für Forschung und Biotechnologie14,15,16,17,18sammelte. Angesichts der Tatsache, dass das schnelle Wachstum von V. Natriegens hat worden zu hohen Protein-Synthese und Stoffwechseleffizienz19,20,21, Nutzbarmachung der zellulären Maschinerie für zellfreie verbunden Synthese kann das Toolkit für schnelle Proteinproduktion und Hochdurchsatz-Screening deutlich erweitern.
Vor kurzem eine zellfreie V. Natriegens Expressionssystem wurde nachgewiesen, die in der Lage, super Ordner GFP (SfGFP) bei Konzentrationen von > 260 μg/mL in 3 h mit einer T7-Promotor-9ist. Das übergeordnete Ziel der Entwicklung dieser Methode war Benutzern eine sehr zugänglich, kostengünstige, reproduzierbare und ertragreiche zellfreien Protein Expressionssystems zur Verfügung zu stellen, die mit gemeinsamen Labor-Equipment in kürzester Zeit zubereitet werden können. Dieses Protokoll nutzt 1 L Kulturen in Fläschchen schütteln, Lyse der Zelle durch Puls-Beschallung und kleine Batch Reaktionen in einem 96 oder 384-Well-Format, Parallelisierung und screening-Durchsatz zu maximieren. Eine lange, anhaltende Protein-Expression wird als eine Energie Quelle8,22,23durch Supplementierung von 3-Phosphoglyceric-Säure (3-PGA) ermöglicht. Nach erfolgreichem Abschluss dieses Protokolls, ein Benutzer haben die Möglichkeit, einen gewünschten Proteins auszudrücken oder Satz von Proteinen in einem zellfreien Format mit V. Natriegens groben Zelle extrahieren.
Ausgehend von einem Glycerin-Lager, V. Natriegens Rohöl Zellextrakte bereiten wir aus Zellen geerntet eine Extinktion bei 600 nm (OD600) von 1,0. Eine 1 L-Kultur wird etwa 2−3 mL Extrakt, nachgeben, die für mehr als 800 zellfreie Reaktionen auf 25 % Rohöl Zelle Extrakt ausreicht. Proteine können mit Plasmid DNA, lineare DNA oder mRNA Vorlage ausgedrückt werden; lineare DNA-Vorlage-Abbau durch endogene Nukleasen bleibt jedoch einen großen Nachteil bei der Verwendung von Wildtyp V. Natriegens zellfreien System9. Ausgehend von V. Natriegens Kulturen, kann Protein nutzbar für downstream-Anwendungen von einem einzelnen Benutzer in 1−2 volle Tage erreicht werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

Die marinen Bakteriums Vibrio Natriegens hat beträchtliche Aufmerksamkeit als aufstrebenden mikrobielle Gastgeber für die Biotechnologie aufgrund seiner schnellen Wachstumsrate sammelte. Ein allgemeines Protokoll wird für die Zubereitung von V. Natriegens Rohöl Zellextrakte mit gemeinsamen Laborgeräte beschrieben. Dieses hohe ertragreiche Protokoll wurde speziell für die Zugänglichkeit Benutzer optimiert und Kosten reduziert. Zellfreie Proteinsynthese (GFP) in kleinem Maßstab 10 μL Batch Reaktionen in entweder einem 96 oder 384-Well-Format vorgenommen werden und reproduzierbar ergibt Konzentrationen von > 260 μg/mL super Ordner GFP (SfGFP) innerhalb von 3 h insgesamt, groben Zelle zu extrahieren, Vorbereitung und GFP kann ein einzelner Benutzer in 1−2 volle Tage erreicht werden. Dieses Protokoll kann leicht in vorhandene Protein Synthese Pipelines, Fortschritte in der Bio-Produktion und synthetische Biologie Anwendungen zu erleichtern integriert werden.

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Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Zellfreie Expressionssysteme sind leistungsstarke und kostengünstige Werkzeuge für den Hochdurchsatz-Synthese und Screening von wichtigen Proteinen. Hier beschreiben wir die Vorbereitung der zellfreien Protein Expressionssystems mit Vibrio Natriegens für die schnelle Proteinproduktion Plasmid-DNA, lineare DNA und mRNA-Vorlage verwenden.

Zellfreien Protein Ausdruck mithilfe der rasch wachsenden Bakterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Unser Protokoll zur zellfreien Proteinexpression verwendet hochaktiven Rohextrakt aus dem schnell wachsenden Bakterium Vibrio natriegens, das mit einem einfachen und zeiteffizienten zweistufigen Beschallungsprozess hergestellt wird. Die Herstellung von Rohzellextrakten und die zellfreie Proteinsynthese können in ein bis zwei Tagen von einem einzigen Benutzer erreicht werden, so dass diese Technik problemlos in Pipelines für die Bioproduktion oder synthetische Biologie integriert werden kann. Um einen Milliliter der über Nacht Vibrio natriegens Kultur zu waschen, indem Sie es in einer Tischzentrifuge bei 10, 600 mal g für eine Minute zentrifugieren.Den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören, und in einem Milliliter frischer LB-V2-Medien wieder aufsetzen. Impfen Sie einen Milliliter gewaschener Nachtkultur in einen Liter frischer LB-V2-Wachstumsmedien in einem autoklavierten Vierliter-Verwirrten Erlenmeyerkolben mit steriler Abdeckung, um eine Verdünnungsration von eintausend tausend zu erreichen. Wachsen Kultur bei 30 Grad Celsius beim Schütteln bis 225 RPM.Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Kulturen OD 600 zu überwachen. Und wenn es 1,0 plus oder minus 0,2 erreicht, ernten Sie die Kultur, indem sie sie in zwei 500-Milliliter-Röhren bei 3, 500 mal g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert und dann auf Eis legen. Den Überstand ansaugen und das Pellet sofort verarbeiten.Vor Beginn des Zelllyseverfahrens frisch zubereitete S30-Lysepuffer pH 7,7 bis etwa vier Grad Celsius abkühlen, Verwenden Sie 10 Milliliter dieses kalten S30-Lysepuffers, um alle Pellets, die aus derselben Ein-Liter-Kultur resultieren, wieder aufzuhängen. Und die Suspension in ein 50-Milliliter-Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie diese Suspension bei 3, 500 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, und aspirieren Sie dann den Überstand, ohne das Pellet zu stören und auf Eis zu legen.Bei der Arbeit in einem Kalten Raum werden dem Pellet in der 50-Milliliter-Röhre, die auf Eis gelegt wird, 500 Mikroliter kalten S30-Lysepuffer hinzufügen. Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze, um das Pellet wieder aufzuhängen und vorsichtig auf ein Zwei-Milliliter-Rohr auch auf Eis übertragen. Um sehr aktive Rohextrakte zu produzieren, müssen wir sicherstellen, dass die Zellen nicht mit S30-Puffer überverdünnt sind, sondern über genügend Flüssigkeit für eine effiziente Beschallung verfügen.Füllen Sie einen 600-Milliliter-Becher mit Eis und legen Sie einen Zwei-Milliliter-Rohrhalter auf das Eis. Wirbeln Sie die Röhre kurz, um die Zellen zu homogenisieren. Flick, um alle Zellen auf der Unterseite der Kappe zu entfernen, und legen Sie in Rohrhalter mit Kappe offen.Niedrigere Beschallungsspitze in die Zellsuspension im Rohr, so dass sie sich knapp unter der flüssigen Oberfläche befindet. Bereiten Sie die Beschallung mit einem Beschallungsgerät und einer Sonde mit einem Spitzendurchmesser von 1/8 Zoll vor. Stellen Sie den Beschallungsgerät auf 20 Kilohertz Frequenz und 50%Amplitude ein.Puls-On-Zeit von 10 Sekunden und Puls-off-Zeit von 60 Sekunden. Führen Sie das Pulsschallungsprotokoll für drei Zyklen aus. Und dann Zentrifuge Rohzellextrakt bei 16.000 mal g für 30 bis 45 Minuten bei vier Grad Celsius, bis Lysat frei von Zellablagerungen ist.Die visuelle Inspektion der Zelllyse während der Beschallung ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Beschallung wie erwartet funktioniert hat. Arbeiten in einem kalten Raum aliquot 50 Mikroliter der resultierenden Überstand zu neuen Zwei-Milliliter-Röhren sicherstellen, dass das Pellet nicht stören. Um zu blitzen, legen diese rohen Zellextrakte die Rohre in einen Rohrhalter mit einer Tauchschnur befestigt und tauchen in einen Dewar mit flüssigem Stickstoff und überprüfen, ob gefroren.Um die zellfreie Proteinexpression mit DNA-Vorlagen-Tauton 10X Energielösung Master-Mix, 4X Aminosäure-Master-Mix-Aliquots und DNA-Vorlage bei Raumtemperatur durchzuführen. Dann entfernen Sie die T7-RNA-Polymerase- und RNAse-Inhibitorbestände aus dem Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis. Sobald die DNA-Vorlage, 10X Energielösung Master-Mix, und 4X Aminosäure Master-Mix aufgetaut sind, auf Eis legen.Bereiten Sie einen zellfreien Reaktionsmaster-Mix vor, indem Sie jede Komponente in der genauen Reihenfolge zu einem Zwei-Milliliter-Rohr auf Eis hinzufügen, und nach jeder Zugabe des Master-Mix sanft die Röhre bewegen. Entfernen Vibrio natriegens Rohzelllysat aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und legen Sie auf Eis für 10 bis 20 Minuten, bis aufgetaut. Fügen Sie das entsprechende Volumen des aufgetauten Rohzellextrakts in den zellfreien Reaktionsmaster-Mix und mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette.Um die endpunktfreie Proteinexpression mit Thermocycler durchzuführen, fügen Sie zunächst 10 Mikroliter des zellfreien Reaktionsmaster-Mix pro Bohrung des Bodens einer 96-Well-PCR-Platte hinzu, um sicherzustellen, dass der Master-Mix durch sanftes Streichen des Rohres zwischen den einzelnen Übertragungen auf die PCR-Platte gemischt wird. Zentrifugieren Sie die Platte 1000 mal g für 10 Sekunden, um jede Master-Mischung zu bündeln, die an den Seiten der Brunnen geklebt worden sein könnte. Und dann versiegeln Sie die Brunnen mit einem Plattenkleber, um Verdunstung zu verhindern.Legen Sie die Platte in einen Thermocycler auf 26 Grad Celsius mit einem beheizten Deckel auf 105 Grad Celsius eingestellt. Nach der Inkubation der Reaktionen in der PCR-Platte für mindestens drei Stunden können exprimierte Proteine gereinigt, quantifiziert und für nachgelagerte Prozesse verwendet werden. Zur Überwachung der zellfreien Proteinexpressionskinetik mit einer Plattenleserpipette 10 Mikroliter pro Brunnen des zellfreien Reaktionsmeister-Mixes auf den Boden einer schwarzen 384-Well-Assay-Platte mit klarglasböden.Und versiegeln Sie die Brunnen mit einem klaren Plattenkleber, um Verdunstung zu verhindern. Legen Sie die Assayplatte in einen Plattenleser, der auf 26 Grad Celsius eingestellt ist, und brüten Sie drei bis sechs Stunden, während Sie die entsprechenden fluoreszierenden Anregungs-/Emissionswellenlängen überwachen, die dem exprimierten Protein entsprechen. Das in diesem Protokoll beschriebene zellfreie Expressionssystem erzielt die besten Ergebnisse mit einer Plasmid-DNA-Vorlage, die eine signifikant höhere Menge an Protein liefert als die gleiche Menge an linearer DNA, wie sie durch Endpunkt- und kinetische Assays gezeigt wird.mRNA, die durch In-vitro-Transkriptionsreaktionen erzeugt wird, könnte ebenfalls verwendet werden, aber es sind höhere Mengen an mRNA erforderlich. Die Ausbeute der Proteinproduktion wurde durch die Konzentration von Magnesium- und Kaliumionen erheblich beeinflusst. Unter optimierten Bedingungen wurde die optimale Magnesiumionenkonzentration bei 3,5 Millimolar und für Kaliumion, 80 Millimolar, ermittelt.Daher können Abweichungen von diesen optimalen Ionenkonzentrationen zu einer verminderten Fähigkeit dieses Expressionssystems führen, signifikante Proteinerträge zu erzeugen. Es ist wichtig, alle Reagenzien auf Eis zu halten oder so weit wie möglich in einem Kühlraum zu arbeiten. Darüber hinaus ist eine ordnungsgemäße und vollständige Beschallung entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls.Nach diesem Protokoll benutzer haben die Fähigkeit, Proteine in einem High-Throughput-Format auszudrücken, die verwendet werden können, um zu reinigen und Bildschirm für die Aktivität von vielen verschiedenen Proteinen. Diese Technik demonstriert die Verwendung neuer Organismen mit einzigartigen Eigenschaften für die zellfreie Expression. Vibrio natriegens ist ein halophiles schnell wachsendes Bakterium, das einzigartige Bedingungen für die Expression von Proteinen oder kleinen Molekülen bieten kann, die bisher in etablierten Modellorganismen unerforscht waren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Forschung

Biotechnik

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Plombierbare Femtoliter Kammer Arrays für Zellfreie Biologie

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Das Studium von Proteinfunktionen und die Rolle der Altered Protein Expression von Antikörper-Interferenz und Dreidimensionale Rekonstruktionen

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

Eine Methode für den Anbau von Bio-Memristoren von Slime Mold

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...