Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי לאומי כללי לרפואה למדעי 1U01GM110714-01-המחלקה של אנרגיה דה-FG02-02ER63445. המחברים רוצה להודות ד ר ריצ'רד Kohman, ד ר ג'ני Tam ו ד ר אדגר Goluch. עצות מועילות לגבי בניית המקטע פרוטוקול של כתב היד הזה.

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

DJW, לא, ו- GMC הגישו פטנט הקשורים לעבודה זו.

פרוטוקול זה מוטבה פראי-סוג נ' natriegens , התפתחות חיידקים מדיה מורכבת LB בתוספת מלחי V2 (טבלה של חומרים). זנים אחרים של נ' natriegens יכול תרבותי דומה ליצירת תא גולמי תמציות לתגובות ללא תא; עם זאת, השימוש בהם דורש נוספים מיטוב של פרוטוקול זה. בנוסף, מערכת זו ביטוי חלבון נטול תא מוטבה באמצעות חומצה 3-phosphoglyceric (3-PGA) כמקור התחדשות האנרגיה העיקריים. מקורות אנרגיה אחרים של התחדשות עשוי לשמש; עם זאת, אופטימיזציה של ריאגנטים וכיול צפוי להיות נדרש כדי להשיג גבוהה מניב חלבון ביטוי10,11.
תשומת לב מסוימת מספר שלבים קריטיים של פרוטוקול זה יבטיח לפרודוקטיביות תמצית מקסימלי גבוהות תנובה נטולת תא ייצור החלבון. ראשית, חייבים להיות מוכנים תא גולמי תמצית מתרבויות נ' natriegens תא האיסוף-שלב אמצע-מעריכית של צמיחה; חלבון התשואה הוא מקסימלי כאשר תרבויות מגיעים OD של600 = 1.0 ± 0.2. בזמן ייצור החלבון ללא תא אפשרית מתאי נקצרו מגוון של צפיפות אופטית, בעבר גילינו כי תאים שנקטפו במצב מעריכית של הצמיחה תשואות חלבון יותר משמעותית9. השפעת צפיפות אופטית שנצפו על התא גולמי תמצית ביצועים עקביים באלה. שדווחו עבור מערכות אחרות ללא תא הביטוי נגזר מן התאים גדלו ב אצווה תרבות תנאים1. כי נ' natriegens גדל בקצב מהיר, חיוני לעקוב מקרוב אחר צפיפות אופטית של תרבויות. באופן כללי, הוא צפוי כי נ' natriegens תרבויות צריך להגיע reproducibly של יתר600 של 1.0 בתוך h 1−1.5 באמצעות פרוטוקול זה; עם זאת, תנאי הגידול בודדים כגון השימוש של התפישה לעומת מבחנות התפישה, אשר משפיעה על אוורור או באוויר לעומת מים דגירה, אשר משפיע על קצב ועל היציבות בטמפרטורת דגירה, עשוי לשנות זמן צמיחה. יתר על כן, מומלץ בדרך כלל על תרבות לפחות 250 מ של נ' natriegens בבקבוקון במבוכה 1 ליטר כדי להבטיח גלולה תא גדול-הקציר עבור טיפול קל והעברה. זה משפר באופן משמעותי את ההצלחה של הכנת תמצית תא גולמי, כמו גם מגביר הנפח הכולל של תמצית המופקת גלולה. בעת שימוש הכנה בקנה מידה קטן יותר, תרבות ותנאים ריאגנטים ניתן להתאים בהתאם. החימוץ בקנה מידה גדול, נוספים מיטוב של תרבות תנאים עשוי להידרש. לבסוף, כדי להבטיח תשואה חלבון גבוהה, זה קריטי כי כדורי תא יעובדו מיד לאחר הקטיף, או בתוך ימי 1−2 אחסון ב- 80 ° c
פירוק תקין של בגדר תא על-ידי sonication הדופק הוא קריטי להצלחה של ביטוי חלבון נטול תאים, והוא לעיתים קרובות ההיבט הקשה ביותר של פרוטוקול זה עבור משתמשים חדשים. בדרך כלל, גלולה טוב lysed תניב נפח משמעותי של תמצית נוזלית ללא תשלום של פסולת. התמצית צריך להיות מעט צמיגה, אבל יכול להיות בקלות pipetted כאשר aliquoting לאיחסון צינורות לפני פלאש קפוא חנקן נוזלי. איור 3 מתאר ייצוג של גלולה טוב lysed (איור 3 א) בהשוואה גלולה לקוי lysed (איור 3B) לאחר השלב צנטריפוגה פירוק פוסט. סימן העיקריים של פירוק התא המלא הוא תא גולמי תמצית חלבון הכולל ריכוז > 20 מ"ג / מ"ל כפי שנקבע על ידי וזמינותו חלבון הכולל (שלב 2.13). Sonication יתר או חימום יתר של התמצית תא גולמי יגרום נזק המכונות הסלולר, אשר לא ניתן לקבוע ללא ביצוע תגובה ללא תא. לכן, זה מאוד מועיל לבחון את יעילות תמצית עם תגובת שליטה לפני מקדישה זמן ניכר ומאמץ ליישומים ביטוי חלבון במורד הזרם. בעוד נוספים מיטוב עשוי להיות נחוץ עבור ציוד sonication שונים, הדופק sonication השלבים המתוארים היו מאוד לשחזור בידיים שלנו.
השימוש של תבנית ה-DNA ליניארי נגזר הגברה PCR, תקציר אנזים הגבלה או הגן המסחרי סינתזה עלולים להגדיל באופן משמעותי את יכולת ייצור החלבון תפוקה גבוהה ומהירה ללא תא ביטוי מערכות24. ייצור החלבון מתבנית ליניארי מוגבר PCR הוכח, התשואה של תגובות אלו הן כ 13.5-fold נמוכה יותר בהשוואה תגובות באמצעות פלסמיד תבנית ה-DNA יחסי equimolar9. זאת בעיקר בשל חוסר היציבות של תבנית ה-DNA ליניארי אשר צפוי מושפל נוכח נ' natriegens תא גולמי תמצית אנדוגני nucleases. בזמן phage למדא חלבון GamS שימש בעבר כדי להגן על ה-DNA ליניארי תבנית24,25, התברר להיות בקנה אחד עם נ' natriegens תמציות9. בנוסף, בעוד הגדלת הריכוז של תבנית ה-DNA ליניארי עשוי לאפשר תשואה גבוהה יותר של חלבון, והשפלות שלו מהר תא גולמי תמצית עדיין תהיה בעיה רצינית.
פתרון להתגברות על השפלה תבנית ה-DNA ליניארי ייתכן להשלמת התא ללא תגובות עם תבנית ה-mRNA המופקים במבחנה שעתוק של ה-DNA ליניארי. מצד שני, השימוש מעכב RNase מציע הגנה משמעותית נגד mRNA התעתיק השפלה, ניתן להשיג תשואות חלבון ניכר בתבנית התגובה ללא תא 10 μL (איור 5 אב'). שכפול ה-DNA ליניארי לתוך תבנית מעגלית דרך ת א מצדו, טופוגרפיה שיבוט, שער הזהב ההרכבה או בשיטות אחרות רקומבינציה עשוי לשמש כדי לעקוף תבנית השפלה. ובכל זאת, עוד יותר גישות עבור עיכוב של פעילות נוקלאז יהיה צורך עבור ביטוי חלבון יעיל באמצעות תבנית ה-DNA ליניארי.
עד כה, הוצעו מספר גישות שונות עבור הכנה של תמצית גולמי חלבון נטול תא ביטוי9,10,11,26. פיתוח פרוטוקול זה, אנחנו ביקשו להגדיל את נגישות המשתמש, להפחית את העלות הכוללת, ולצמצם את זמן רב שלבים. לדוגמה, תשואה חלבון גבוהה מושגת באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים sonication-צנטריפוגה, אינה דורשת תא לטקס, צעדים דיאליזה ארוך או מי נגר ולמפולות התגובה. היא פשוט לביצוע תוך תקופה קצרה של זמן, לא דורשת רמה גבוהה של מומחיות מעבדה. לכן, זה יכול לעזור להקל על התא ללא ביטוי כתקן עבור מחקר אקדמי translational ועיצוב תהליך תעשייתי.
פרוטוקול זה מרחיב את ערכת הכלים הזמינים עבור חקירה, התועלת של נ' natriegens, אורגניזם שאינו-דגם עם תכונות ביולוגיות ייחודיות. תשואה גבוהה יותר של חלבון יכולה להיות מושגת על ידי העסקת חצי או מלא-רציף לחלוטין נטול תא תגובות, כדי לאפשר התחדשות האנרגיה, resupplying של חומצות אמינו, ואת סילוק הפסולת-3,-5,-27. יתר על כן, ההנדסה של פראי-סוג נ' natriegens כדי לייצר זנים DNAse או RNAse-לקויה, הסרה של מסלולים מטבוליים ברישול, מתחרים, וביטוי של tRNAs נוספים יכול מאוד לשפר את הייצור של חלבונים ב- זה28,מערכת29. ככל שנחשוף את הביולוגיה שבבסיס הצמיחה המהירה שלה, להמשך פיתוח מערכות נ' natriegens נטולת תא עשוי להאיץ bioproduction יכולות ולאפשר ביטוי חזקים של פפטידים טיפולית, מולקולות קטנות סינתטיים חומרים.

סינתזה של חלבון נטול תא היא שיטה רב-תכליתי וחסכוני עבור הביטוי של חלבונים יקר או פפטידים1,2,3,4. מבחינה היסטורית, סינתזה של חלבון נטול תא בוצעה באמצעות מערכות ביטוי Escherichia coli ; עם זאת, היה נחשול האחרונות שימוש אלטרנטיבי, ללא-דגם אורגניזמים עם מאפיינים הרומן מארז עבור ביטוי נטולת תא5,6,-7,-8,-9 , 10 , 11 , 12. אורגניזם בעל פרופיל מטבולי ייחודי הם מועמדים כחלופות למערכות ללא תא החיידק . לדוגמה, החיידק ימית שויבריו natriegens הוא המהירות גוברת של כל האורגניזמים ידוע עם התצפיות הכפלת זמן של פחות מ- 10 דקות13. זה צברה נ' natriegens תשומת לב רבה כמארח מיקרוביאלי המתעוררים ביוטכנולוגיה ומחקר14,15,16,17,18. בהתחשב בכך יש שיעור הצמיחה המהירה של נ' natriegens מקושר שיעור גבוה של סינתזת חלבונים ויעילות מטבולית19,20,21, רתימת מכונות הסלולר שלה ללא תא סינתזה עשוי להרחיב באופן משמעותי ערכת הכלים עבור ייצור החלבון מהירה ו ההקרנה תפוקה גבוהה.
לאחרונה, תא-חינם נ' natriegens ביטוי המערכת הוכח שהוא מסוגל לייצר תיקייה סופר GFP (sfGFP) בריכוזים של > 260 μg/מ ל-3 שעות עם יזם T79. המטרה הכוללת של פיתוח שיטה זו היה לספק למשתמשים מערכת ביטוי מאוד נגיש, חסכוניים, הדירים גבוהות תנובה ללא תא חלבון ניתן להכין בעזרת ציוד מעבדה נפוץ בתוך זמן קצר. פרוטוקול זה מנצל תרבויות 1 ליטר טלטול מבחנות, פירוק תאים על-ידי sonication הדופק, ותגובות אצווה בקנה מידה קטן בתבנית 96 - או 384-ובכן להגדיל את תפוקת parallelization וסינון. ביטוי חלבון ארוך, ממושך התאפשר על ידי תוספת של חומצה 3-phosphoglyceric (3-PGA) כמו אנרגיית מקור8,22,23. בסיום בהצלחה פרוטוקול זה, למשתמש יש את היכולת לבטא חלבון הרצוי או לחלץ קבוצת חלבונים בתבנית ללא תא באמצעות נ' natriegens תא גולמי.
החל ממניה גליצרול, נ' natriegens תא גולמי תמציות מוכנות מתאי נקצרו של צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 1.0. תרבות 1 ליטר תניב כ 2−3 מ ל תמצית, וזה מספיק עבור יותר מ-800 תגובות ללא תא ב 25% תמצית תא גולמי. חלבונים יכול להתבטא באמצעות פלסמיד ה-DNA, ה-DNA ליניארי או תבנית ה-mRNA; עם זאת, השפלה תבנית ה-DNA ליניארי מאת nucleases אנדוגני נשאר חיסרון גדול בעת שימוש פראי סוג נ' natriegens תא ללא מערכת9. החל מתרבויות נ' natriegens , חלבון שמיש עבור יישומי הזרם יכולה להיות מושגת על ידי משתמש בודד בימים מלא 1−2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

החיידק ימית ויבריו natriegens צברה תשומת לב רבה כמארח מיקרוביאלי המתעוררים לביוטכנולוגיה בשל קצב הצמיחה המהיר שלה. פרוטוקול כללית מתוארת עבור הכנת נ' natriegens תא גולמי תמציות בעזרת ציוד מעבדה נפוץ. פרוטוקול זה מניב גבוהה כבר במיוחד מותאמת לנגישות המשתמש ואת עלות מופחתת. סינתזה של חלבון נטול תאים (CFPS) יכול להתבצע בתגובות בקנה מידה קטן 10 μL אצווה בתבנית או 96 - או 384-ובכן, reproducibly מניב ריכוזי > 260 μg/mL סופר תיקיה GFP (sfGFP) בתוך ה 3 בסך הכל, תא גולמי לחלץ והכנה CFPS יכולה להיות מושגת בימים מלא 1−2 על ידי משתמש בודד. פרוטוקול זה ניתן לשלב בקלות לתוך צינורות סינתזה של חלבון קיים כדי להקל על ההתקדמות ביו-הייצור ויישומים ביולוגיה סינתטית.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

מערכות ללא תא ביטוי הן כלי עוצמתי וחסכוני עבור תפוקה גבוהה סינתזה ו ההקרנה של חלבונים חשובים. כאן, אנו מתארים את הכנת המערכת ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות ויבריו natriegens לייצור חלבון המהירה באמצעות פלסמיד DNA DNA ליניארי, תבנית ה-mRNA.

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

הפרוטוקול שלנו לביטוי חלבון ללא תאים משתמש בתמצית גולמית פעילה מאוד מהחיידק הגדל במהירות Vibrio natriegens, המוכן באמצעות תהליך פשוט ויעיל של שני שלבים של sonication-צנטריפוגה. הכנת תמצית תאים גולמיים וסינתזת חלבונים נטולת תאים יכולה להיות מושגת תוך יום עד יומיים על ידי משתמש יחיד המאפשר לשלב טכניקה זו בקלות בצינורות עבור יישומי ביו-פרודוקציה או ביולוגיה סינתטית. כדי להתחיל לשטוף מיליליטר אחד של תרבות ויבריו natriegens לילה על ידי צנטריפוגה אותו בצנטריפוגה ספסל ב 10, 600 פעמים גרם לדקה אחת.שאף את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור, ולחץ מחדש במיליליטר אחד של מדיה LB-V2 טרייה. לחסן מיליליטר אחד של תרבות לילה שטף לתוך ליטר אחד של מדיה צמיחה LB-V2 טרי בבקבוק ארלנפייר Erlenmeyer מבולבל אוטומטית עם כיסוי סטרילי כדי להשיג אחד לאלף מנות דילול. לגדול תרבות ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול ל 225 סל"ד.השתמש בספקטרופוטומטר כדי לפקח על התרבויות OD 600. וכאשר הוא מגיע 1.0 פלוס או מינוס 0.2 לקצור את התרבות על ידי צנטריפוגה אותו בשני צינורות 500 מיליליטר ב 3, 500 פעמים גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מניחים על קרח. שאף את העל-טבעי ועבד את גלולת הכדור מיד.לפני תחילת הליך תות התא לקרר טרי מוכן S30 lysis מאגר pH 7.7 עד כארבע מעלות צלזיוס, השתמש 10 מיליליטר של מאגר תזה S30 קר זה כדי להשעות מחדש את כל כדורי הנובעים מאותה תרבות ליטר אחד. ולהעביר השעיה לצינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה השעיה זו ב 3, 500 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שאף את supernatant מבלי להפריע גלולה למקם אותו על קרח.עבודה בחדר קר להוסיף 500 microliters של חיץ תזה S30 קר לכדור בצינור 50 מיליליטר להציב על קרח. השתמש בקצה פיפטה משעמם רחב כדי לעכל מחדש את גלולה בזהירות להעביר אותו צינור שני מיליליטר גם על קרח. על מנת לייצר תמציות גולמיות פעילות מאוד עלינו לוודא כי התאים אינם מדוללים יתר על פני עם מאגר S30, אבל יש מספיק נוזל עבור sonication יעיל.ממלאים מקור 600 מיליליטר בקרח וממקם מחזיק צינור שני מיליליטר על גבי הקרח. מערבולת הצינור בקצרה כדי הומוגניזציה התאים. לחץ כדי להסיר את כל התאים בתחתית המכסה, והמקום לתוך מחזיק צינור עם כובע פתוח.קצה sonicator התחתון לתוך ההשעיה התא בצינור, כך שהוא ממש מתחת לפני השטח הנוזליים. הכן את הגדרת sonication באמצעות sonicator ו בדיקה עם קוטר קצה 1/8 אינץ '. הגדר את sonicator בתדר 20 קילוהרץ ו 50% משרעת.זמן דופק של 10 שניות, ותנות דופק של 60 שניות. הפעל את פרוטוקול sonication הדופק במשך שלושה מחזורים. ואז תמצית תאים גולמיים צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g במשך 30 עד 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס עד ליאזט הוא ללא כל פסולת הסלולר.בדיקה חזותית של תות התאים כאשר sonication מתרחש הוא קריטי כדי להבטיח כי sonication עבד כצפוי. עבודה בחדר קר aliquot 50 microliters של supernatants וכתוצאה מכך צינורות חדשים שני מיליליטר הקפדה לא להפריע גלולה. כדי להבהב להקפיא תמציות תאים גולמיים אלה למקם את הצינורות לתוך מחזיק צינור עם מחרוזת טבילה מחובר לטבול לתוך dewar המכיל חנקן נוזלי ולבדוק אם קפוא.כדי לבצע ביטוי חלבון ללא תאים באמצעות תבנית DNA להפשיר 10X אנרגיה פתרון אב לערבב, 4X חומצת אמינו מאסטר לערבב aliquots, ותבנית DNA בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להסיר את הפולימראז T7 RNA ו RNAse מעכבי מניות מן המקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס ולה מניחים על קרח. לאחר תבנית ה-DNA, 10X תווי אנרגיה מאסטר לערבב, ו 4X חומצת אמינו מאסטר לערבב מופשרים, מקום על קרח.הכינו תערובת מאסטר תגובה נטולת תאים על ידי הוספת כל רכיב בסדר המדויק לצינור של שני מיליליטר על קרח, והניפו בעדינות את הצינור לאחר כל תוספת לתערובת הראשית. הסר Vibrio natriegens תא גולמי lysate מן המקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס ולה מניחים על הקרח במשך 10 עד 20 דקות עד מופשר. הוסיפו את הנפח המתאים של תמצית תאים גולמיים מופשרת לתערובת המאסטר של התגובה נטולת התאים וערבבו בעדינות בעזרת פיפטה.כדי לבצע ביטוי חלבון נטול תאים נקודת קצה באמצעות thermocycler, תחילה להוסיף 10 microliters של התגובה ללא תאים לערבב ל הבאר של החלק התחתון של צלחת PCR 96 היטב הקפד לערבב את התערובת הראשית על ידי הבהוב הצינור בעדינות בין כל העברה לצלחת PCR. צנטריפוגה הצלחת ב 1, 000 פעמים g במשך 10 שניות כדי בריכה כל תערובת הורים שאולי היה דבוק לצדדים של בארות. ואז לאטום את בארות עם דבק צלחת כדי למנוע אידוי.מניחים את הצלחת לתוך התרמוצ'ילר להגדיר ב 26 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם להגדיר ב 105 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של התגובות בצלחת PCR למשך שלוש שעות לפחות, חלבונים מבוטאים יכולים להיות מטוהרים, מכומתים ומשמשים לתהליכים במורד הזרם. כדי לפקח על קינטיקה ביטוי חלבון ללא תאים באמצעות pipette קורא צלחת 10 microliters לכל באר של תערובת מאסטר התגובה ללא תאים לתחתית צלחת 384-well מים שחורים עם תחתיות זכוכית ברורות.ולאטום את בארות עם דבק צלחת ברורה כדי למנוע אידוי. מניחים את צלחת ההתזה לתוך קורא צלחת להגדיר ב 26 מעלות צלזיוס דגירה במשך שלוש עד שש שעות תוך ניטור אורך גל פלורסנט המתאים / פליטה המתאימים חלבון לידי ביטוי. מערכת ביטוי ללא תאים המתוארת בפרוטוקול זה משיגה את התוצאות הטובות ביותר עם תבנית DNA פלסמיד המניבה כמות חלבון גבוהה משמעותית מאותה כמות של דנ"א ליניארי כפי שמוצג על ידי נקודות קצה ובדיקות קינטיות.mRNA שנוצר על ידי תגובות שעתוק במבחנה יכול לשמש גם, אבל כמויות גבוהות יותר של mRNA נדרשים. התשואה של ייצור החלבון הושפעה באופן משמעותי על ידי ריכוז של מגנזיום ויוני אשלגן. בתנאים אופטימליים נמצא כי ריכוז יוני המגנזיום האופטימלי הוא 3.5 מילימולר ואשלגן יון, 80 מילימולר.לפיכך, סטיות מריכוזי היונים האופטימליים הללו עלולות לגרום לירידה ביכולתה של מערכת ביטוי זו לייצר תשואות משמעותיות של חלבונים. חשוב לשמור את כל הריג'ים על הקרח או לעבוד בחדר קר ככל האפשר. בנוסף, sonication הנכון והשלם הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה.בעקבות פרוטוקול זה למשתמשים תהיה היכולת לבטא חלבונים בפורמט תפוקה גבוהה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לטהר מסך לפעילות של חלבונים רבים ושונים. טכניקה זו מדגימה את השימוש באורגניזמים חדשים בעלי תכונות ייחודיות לביטוי ללא תאים. Vibrio natriegens הוא חיידק הגדל במהירות הילופילית שעשוי להציע תנאים ייחודיים לביטוי חלבונים או מולקולות קטנות שלא נחקרו בעבר באורגניזמים מבוססים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

מערכים רבים סגר Femtoliter הלשכה לביולוגיה ללא סלולארי

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

תפקוד חלבון לימוד ותפקיד ביטוי חלבון לשנות על ידי הפרעת נוגדן שחזור תלת ממדי

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

שיטה לגידול ביו-memristors מן העיפוש רפש

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...