Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
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यह काम जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान 1u01gm110714-01 और ऊर्जा विभाग DE-FG02-02er63445 द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखक इस पांडुलिपि के प्रोटोकॉल खंड के निर्माण पर सहायक सलाह के लिए डॉ. रिचर्ड कोहमन, डॉ जेनी टैम, और डॉ एडगर गोल्च का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

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	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

djw, नहीं, और जीएमसी एक पेटेंट इस काम से संबंधित दायर की है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया गया है वाइल्ड-प्रकार V. natriegens और बैक्टीरियल विकास मीडिया के शामिल पौंड का पूरक V2 लवण के साथ (सामग्री की तालिका). V. natriegens के अन्य उपभेदों इसी तरह सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं के लिए कच्चे तेल के अर्क उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है; हालांकि, उनके उपयोग इस प्रोटोकॉल के अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, इस सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है 3-फ़ॉस्फोग्लिसरिक एसिड (3-पीजीए) प्राथमिक ऊर्जा उत्थान स्रोत के रूप में । अन्य ऊर्जा पुनर्जनन स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, अभिकर्मकों और अंशांकन के अनुकूलन की संभावना उच्च उपज प्रोटीन अभिव्यक्ति10,11प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरणों के लिए विशेष ध्यान उच्च उपज सेल मुक्त प्रोटीन उत्पादन के लिए अधिकतम निकालने उत्पादकता सुनिश्चित करेगा । सबसे पहले, क्रूड सेल निकालने V. natriegens कोशिका संस्कृतियों के विकास के एक मध्य घातीय चरण में काटा से तैयार किया जाना चाहिए; प्रोटीन उपज अधिक से अधिक है जब संस्कृतियों एक OD६०० = १.० ± ०.२ तक पहुंचने । जबकि सेल मुक्त प्रोटीन उत्पादन ऑप्टिकल घनत्व की एक सीमा पर काटा कोशिकाओं से संभव है, हम पहले से पाया है कि कोशिकाओं की वृद्धि उपज की एक घातीय राज्य में काफी अधिक प्रोटीन9काटा । क्रूड सेल निकालने के प्रदर्शन पर ऑप्टिकल घनत्व के मनाया प्रभाव उन के साथ संगत कर रहे है अंय सेल मुक्त अभिव्यक्ति बैच संस्कृति की स्थिति में वृद्धि हुई कोशिकाओं से व्युत्पंन सिस्टम के लिए रिपोर्ट1। क्योंकि वी natriegens एक तीव्र दर से बढ़ता है, यह बारीकी से ' संस्कृतियों ऑप्टिकल घनत्व की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है । सामान्य तौर पर, यह उम्मीद की जाती है कि वी. नेरिएजेंस संस्कृतियों को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 1 − 1.5 h के भीतर १.० के ओडी६०० तक पहुंचने का पुनरुत्पाद करना चाहिए; हालांकि, व्यक्तिगत विकास की स्थिति जैसे चकित बनाम गैर-चकित flasks का उपयोग, जो aeration को प्रभावित करता है, या हवा बनाम पानी ऊष्मायन, जो दर और ऊष्मायन तापमान की स्थिरता को प्रभावित करता है, विकास के समय को बदल सकता है । इसके अलावा, यह आम तौर पर संस्कृति के लिए सिफारिश की है एक 1 एल में सबसे कम २५० मिलीलीटर V. natriegens के चकरा हुआ फ्लास्क आसान हेरफेर और हस्तांतरण के लिए फसल पर एक बड़ी कोशिका गोली सुनिश्चित करने के लिए । यह बहुत कच्चे तेल निकालने की तैयारी की सफलता में सुधार के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक गोली से उत्पादित निकालने की कुल मात्रा बढ़ जाती है. छोटे पैमाने पर तैयारी का उपयोग करते समय, संस्कृति की स्थिति और अभिकर्मकों उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है. बड़े पैमाने पर किण्वन के लिए, संस्कृति की स्थिति के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । अंत में, उच्च प्रोटीन उपज सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सेल छर्रों को कटाई के तुरंत बाद संसाधित किए जाते हैं, या 1 − 2 दिनों के भीतर-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए ।
नाड़ी sonication द्वारा सेल गोली का उचित lysis सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और अक्सर नए उपयोगकर्ताओं के लिए इस प्रोटोकॉल का सबसे कठिन पहलू है । आमतौर पर, एक अच्छी तरह से लीजड ड गोली तरल निकालने की एक महत्वपूर्ण मात्रा है कि मलबे से मुक्त है उपज जाएगा । निकालने के लिए थोड़ा चिपचिपा होना चाहिए, लेकिन आसानी से जब भंडारण ट्यूबों में तरल नाइट्रोजन में फ्लैश ठंड से पहले aliquoting पाइपटित किया जा सकता है । चित्रा 3 एक अच्छी तरह से लीजड ड गोली (चित्रा3a) के बाद एक खराब लीजड ड गोली की तुलना में दर्शाया गया है (चित्रा3a) पोस्ट के बाद lysis centrifugation कदम । पूरा सेल lysis का एक प्रमुख संकेत एक कच्चे तेल की कोशिका निकालने कुल प्रोटीन एकाग्रता > 20 मिलीग्राम/एमएल के रूप में एक कुल प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित (चरण २.१३) । क्रूड सेल निकालने के अधिक sonication या अत्यधिक हीटिंग सेलुलर मशीनरी, जो एक सेल मुक्त प्रतिक्रिया प्रदर्शन के बिना निर्धारित नहीं किया जा सकता है नुकसान होगा । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण समय और downstream प्रोटीन अभिव्यक्ति अनुप्रयोगों के लिए प्रयास समर्पित करने से पहले एक नियंत्रण प्रतिक्रिया के साथ निकालने दक्षता का परीक्षण करने के लिए बेहद फायदेमंद है. जबकि अतिरिक्त अनुकूलन अलग sonication उपकरण के लिए आवश्यक हो सकता है, पल्स sonication चरणों का वर्णन किया गया है हमारे हाथ में अत्यधिक reproducible ।
पीसीआर प्रवर्धन, प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट, या वाणिज्यिक जीन संश्लेषण से व्युत्पन्न रेखीय डीएनए टेम्पलेट का उपयोग सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली24में उच्च थ्रूपुट और तेजी से प्रोटीन उत्पादन के लिए क्षमता को काफी बढ़ा सकता है । जबकि पीसीआर प्रवर्धित रैखिक टेंपलेट से प्रोटीन उत्पादन का प्रदर्शन किया गया है, इन प्रतिक्रियाओं की उपज लगभग १३.५ है-equimolar अनुपात9में प्लाज्मिड डीएनए टेंपलेट का उपयोग प्रतिक्रियाओं की तुलना में कम गुना । यह मुख्य रूप से रैखिक डीएनए टेम्पलेट की अस्थिरता की वजह से है जो वी. नेट्रिजंस क्रूड सेल निकालने में मौजूद अंतर्जात नाभिको द्वारा नीचा होने की संभावना है । जबकि लैम्ब्डा फैज प्रोटीन gams पहले रैखिक डीएनए टेंपलेट की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया गया है24,25, यह वी के साथ असंगत होना पाया गया था natriegens अर्क9. इसके अतिरिक्त, जबकि रैखिक डीएनए टेम्पलेट की एकाग्रता में वृद्धि एक उच्च प्रोटीन उपज के लिए अनुमति दे सकता है, क्रूड सेल निकालने में अपनी तेजी से गिरावट अभी भी एक बड़ी समस्या होगी.
रेखीय डीएनए टेंपलेट गिरावट पर काबू पाने के लिए एक समाधान के लिए सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं के साथ एमएनए रैखिक डीएनए के विट्रो प्रतिलेखन में उत्पंन टेंपलेट के पूरक हो सकता है । दूसरी ओर, एक rnase अवरोधक का उपयोग एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट क्षरण के खिलाफ महत्वपूर्ण सुरक्षा प्रदान करता है और प्रशंसनीय प्रोटीन पैदावार 10 μl सेल-फ्री रिएक्शन फॉर्मेट (चित्रा 5a, B) में प्राप्त किया जा सकता है । रैखिक डीएनए की क्लोनिंग टीए ligation, topo क्लोनिंग, गोल्डन गेट असेंबली, या अन्य पुनर्योजन तरीकों के माध्यम से एक परिपत्र टेम्पलेट में टेम्पलेट क्षरण को दरकिनार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फिर भी, nuclease गतिविधि के निषेध के लिए और अधिक दृष्टिकोण कुशल प्रोटीन अभिव्यक्ति रैखिक डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
तिथि करने के लिए, सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति9,10,11,26के लिए कच्चे तेल निकालने की तैयारी के लिए कई विभिन्न दृष्टिकोणों का प्रस्ताव किया गया है । इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में, हम उपयोगकर्ता पहुंच को अधिकतम करने की मांग की, समग्र लागत को कम करने, और समय लेने वाले कदम कम । उदाहरण के लिए, एक उच्च प्रोटीन उपज एक सरल दो कदम sonication-centrifugation प्रक्रिया का उपयोग कर हासिल की है, और सेल homogenizers, लंबा डायलिसिस कदम या रन-ऑफ प्रतिक्रिया की आवश्यकता नहीं है । यह समय की एक छोटी अवधि में निष्पादित करने के लिए सरल है और प्रयोगशाला विशेषज्ञता के उच्च स्तर की आवश्यकता नहीं है । इस प्रकार, यह शोधों अकादमिक अनुसंधान और औद्योगिक प्रक्रिया डिजाइन के लिए एक मानक के रूप में सेल मुक्त अभिव्यक्ति की सुविधा में मदद कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल की जांच और V. natriegens, अद्वितीय जैविक गुणों के साथ एक गैर मॉडल जीव की उपयोगिता के लिए उपलब्ध टूलकिट फैलता है । उच्च प्रोटीन उपज अर्द्ध या पूरी तरह से सतत सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं को रोजगार द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, ऊर्जा उत्थान के लिए अनुमति देने के लिए, अमीनो एसिड की reआपूर्ती, और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने3,5,27। इसके अलावा, जंगली-प्रकार V. natriegens के इंजीनियरिंग dnase उत्पादन करने के लिए-या rnase कमी उपभेदों, हानिकारक और प्रतिस्पर्धा चयापचय रास्ते को हटाने, और अतिरिक्त trnas की अभिव्यक्ति बहुत में प्रोटीन के उत्पादन में वृद्धि कर सकता यह प्रणाली२८,२९. जैसा कि हम अपनी तेजी से विकास अंतर्निहित जीव विज्ञान जानने, V. natriegens के आगे विकास सेल मुक्त सिस्टम bioproduction क्षमताओं में तेजी लाने और चिकित्सीय पेप्टाइड्स की मजबूत अभिव्यक्ति सक्षम कर सकते हैं, छोटे अणुओं, और सिंथेटिक सामग्री.

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण मूल्यवान प्रोटीन या पेप्टाइड्स1,2,3,4की अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी और लागत प्रभावी तरीका है । ऐतिहासिक दृष्टि से, सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण escherichia कोली अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग किया गया है; हालांकि, सेल-मुक्त अभिव्यक्ति के लिए चेसिस के रूप में उपन्यास संपत्तियों के साथ वैकल्पिक, गैर-मॉडल जीवों का उपयोग करने में हाल ही में वृद्धि हुई है5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. अद्वितीय चयापचय प्रोफाइल के साथ जीव ई. कोलाई सेल मुक्त प्रणालियों के लिए विकल्प के रूप में प्रधान उंमीदवार हैं । उदाहरण के लिए, समुद्री जीवाणु विब्रियो नेट्रिजन सभी ज्ञात जीवों का सबसे तेजी से बढ़ रहा है, जो 10 मिनट13से कम समय में मनाया जाने वाला दुगनी बार है । इस V. अनुसंधान और जैव प्रौद्योगिकी14,15,16,17,18के लिए एक उभरते माइक्रोबियल मेजबान के रूप में काफी ध्यान natriegens है । यह देखते हुए कि V. natriegens की तीव्र वृद्धि दर को प्रोटीन संश्लेषण और चयापचय क्षमता की उच्च दरों से जोड़ा गया है19,20,21, सेल मुक्त करने के लिए अपनी सेलुलर मशीनरी का दोहन संश्लेषण काफी तेजी से प्रोटीन उत्पादन और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए टूलकिट का विस्तार हो सकता है.
हाल ही में, एक सेल मुक्त V. natriegens अभिव्यक्ति प्रणाली का प्रदर्शन किया गया है जो सुपर फ़ोल्डर gfp (sfgfp) के उत्पादन में सक्षम है > २६० μg/एमएल की सांद्रता पर एक T7 प्रवर्तक9के साथ 3 एच में । इस विधि के विकास का समग्र उद्देश्य एक उच्च सुलभ के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करने के लिए था, लागत कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और उच्च उपज सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली है कि समय की एक छोटी राशि में आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को हिला flasks में 1 एल संस्कृतियों का इस्तेमाल करता है, पल्स sonication द्वारा सेल lysis, और छोटे पैमाने पर बैच प्रतिक्रियाओं में एक ९६-या ३८४-अच्छी तरह से समानता और स्क्रीनिंग थ्रुपुट को अधिकतम करने के लिए प्रारूप. एक लंबे, निरंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति 3 की पूरकता द्वारा संभव बनाया है-फॉस्फोग्लिसरिक एसिड (3-पीजीए) एक ऊर्जा स्रोत के रूप में8,22,23. सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल को पूरा करने पर, एक उपयोगकर्ता एक वांछित प्रोटीन या एक सेल मुक्त प्रारूप में प्रोटीन के सेट वी natriegens कच्चे सेल निकालने का उपयोग कर व्यक्त करने की क्षमता होगी ।
एक ग्लिसरोल स्टॉक से शुरू, V. natriegens कच्चे सेल निष्कर्षों १.० के ६०० एनएम (ओडी६००) पर एक ऑप्टिकल घनत्व पर काटा कोशिकाओं से तैयार कर रहे हैं । एक 1 एल संस्कृति निकालने के लगभग 2 − 3 मिलीलीटर निकलेगा, जो 25% क्रूड सेल निकालने पर ८०० से अधिक सेल-फ्री प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है । प्रोटीन प्लाज्मिड डीएनए, रैखिक डीएनए, या एमआरएनए टेम्पलेट का उपयोग करके व्यक्त किया जा सकता है; हालांकि, अंतर्जात नाभिके द्वारा रेखीय डीएनए टेम् पलेट निम्नीकरण का उपयोग करते समय एक प्रमुख खामी बनी रहती है । V. natriegens संस्कृतियों से शुरू, अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के लिए useable प्रोटीन 1 − 2 पूरे दिन में एक एकल उपयोगकर्ता द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

मरीन बैक्टीरियम विब्रियो नेट्रिएंस ने अपनी तेजी से विकास दर के कारण जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक उभरते हुए माइक्रोबियल मेजबान के रूप में काफी ध्यान दिया है । सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करते हुए V. natriegens क्रूड सेल अर्क की तैयारी के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । इस उच्च उपज प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगकर्ता पहुंच और कम लागत के लिए अनुकूलित किया गया है । सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (cfps) या तो एक ९६-या ३८४-अच्छी तरह से प्रारूप में छोटे पैमाने पर 10 μl बैच प्रतिक्रियाओं में किया जा सकता है और > २६० μg/एमएल सुपर फ़ोल्डर gfp (sfgfp) की reproducibly पैदावार सांद्रता 3 एच के भीतर । कुल मिलाकर, क्रूड सेल निकालने की तैयारी और सीएफपी एक एकल प्रयोक्ता द्वारा 1 − 2 पूर्ण दिनों में प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से मौजूदा प्रोटीन संश्लेषण पाइपलाइन में एकीकृत करने के लिए जैव उत्पादन और सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों में अग्रिम की सुविधा कर सकते हैं ।

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Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली शक्तिशाली और उच्च थ्रूपुट संश्लेषण और महत्वपूर्ण प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए लागत कुशल उपकरण हैं । यहां, हम सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली की तैयारी का वर्णन तेजी से प्रोटीन प्लाज्मिड डीएनए, रैखिक डीएनए, और mrna टेंपलेट का उपयोग कर उत्पादन के लिए vibrio natriegens का उपयोग कर ।

कोशिका मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति तेजी से बढ़ जीवाणु vibrio natriegens का उपयोग

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

सेल-फ्री प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए हमारा प्रोटोकॉल तेजी से बढ़ते जीवाणु विब्रियो नेट्रीजन से अत्यधिक सक्रिय क्रूड अर्क का उपयोग करता है, जिसे एक सरल और समय-कुशल दो-चरण सोनीसेफिकेशन-अपकेंद्रित्र प्रक्रिया का उपयोग करके तैयार किया जाता है। क्रूड सेल निकालने की तैयारी और सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण एक से दो दिनों में एक ही उपयोगकर्ता द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जिससे इस तकनीक को बायोप्रोडक्शन या सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए पाइपलाइनों में आसानी से एकीकृत किया जा सकता है। एक मिनट के लिए 10, 600 बार जी पर एक बेंचटॉप अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र द्वारा रात भर विब्रियो नेटरीजेन्स संस्कृति के एक मिलीलीटर को धोना शुरू करना।गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और ताजा एलबी-वी2 मीडिया के एक मिलीलीटर में फिर से खर्च करें। एक-से-एक हजार कमजोर पड़ने वाले राशन को प्राप्त करने के लिए बाँझ कवर के साथ चार लीटर चकित Erlenmeyer फ्लास्क में ताजा पौंड-V2 विकास मीडिया के एक लीटर में धोया रातोंरात संस्कृति के एक मिलीलीटर टीका । २२५ आरपीएम को मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बढ़ें ।ओडी 600 संस्कृतियों की निगरानी के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। और जब यह 1.0 प्लस या माइनस 0.2 तक पहुंचता है तो संस्कृति को दो 500-मिलीलीटर ट्यूबों में 3, 500 बार ग्राम में चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्री करके, और फिर बर्फ पर रखें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और तुरंत गोली को संसाधित करें।सेल लाइसिस प्रक्रिया शुरू करने से पहले ताजा तैयार S30 lysis बफर पीएच 7.7 लगभग चार डिग्री सेल्सियस करने के लिए, इस ठंड S30 lysis बफर के 10 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए फिर से सभी छर्रों एक ही एक लीटर संस्कृति के परिणामस्वरूप निलंबित. और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण । इस निलंबन को चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3, 500 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें, और फिर गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पेरेट करें और इसे बर्फ पर रखें।एक ठंडे कमरे में काम कर बर्फ पर रखा ५० मिलीलीटर ट्यूब में गोली के लिए ठंड S30 lysis बफर के ५०० माइक्रोलीटर जोड़ें । गोली को फिर से खर्च करने के लिए एक विस्तृत बोर पिपेट टिप का उपयोग करें और ध्यान से इसे बर्फ पर दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। बहुत सक्रिय कच्चे तेल के अर्क का उत्पादन करने के लिए हमें यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कोशिकाएं S30 बफर के साथ पतला नहीं हैं, लेकिन कुशल सोनीफिकेशन के लिए पर्याप्त तरल हैं।बर्फ के साथ एक ६०० मिलीलीटर बीकर भरें और बर्फ के शीर्ष पर एक दो मिलीलीटर ट्यूब धारक जगह है । भंवर ट्यूब संक्षेप में कोशिकाओं को समरूप बनाने के लिए। टोपी के तल पर किसी भी कोशिकाओं को हटाने के लिए झटका, और टोपी खुला के साथ ट्यूब धारक में जगह है ।ट्यूब में कोशिका निलंबन में कम ध्वनिक टिप ताकि यह तरल सतह के नीचे हो। एक सोनिकेटर का उपयोग करके सोनिकेशन सेट-अप तैयार करें और 1/8 इंच टिप व्यास के साथ जांच करें। 20 किलोहर्ट्ज आवृत्ति और 50% आयाम पर सोनिकेटर सेट करें।पल्स- 10 सेकंड का समय, और पल्स-ऑफ समय 60 सेकंड का। तीन चक्रों के लिए पल्स सोनिकेशन प्रोटोकॉल चलाएं। और फिर अपकेंद्रित्र क्रूड सेल निकालने के लिए 16, 000 बार जी पर 30 से ४५ मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर जब तक lysate किसी भी सेलुलर मलबे से मुक्त है ।सोनीशन के रूप में सेल लाइसिस का निरीक्षण करना यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सोनीसिएशन ने उम्मीद के अनुसार काम किया है। एक ठंडे कमरे में काम करना 50 माइक्रोलीटर जिसके परिणामस्वरूप सुपरनेटेंट के नए दो मिलीलीटर ट्यूबों के लिए काम करना सुनिश्चित करता है कि गोली को परेशान न किया जा सके। इन कच्चे तेल सेल अर्क फ़्लैश फ्रीज करने के लिए एक सूई स्ट्रिंग संलग्न और तरल नाइट्रोजन युक्त एक देवर में जलमग्न और अगर जमे हुए की जांच के साथ एक ट्यूब धारक में ट्यूब धारक जगह है ।डीएनए टेम्पलेट गल 10X ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स, 4X अमीनो एसिड मास्टर मिक्स aliquots, और कमरे के तापमान पर डीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए । इसके बाद टी7 आरएनए पॉलीमरेज और आरएनईई अवरोधक स्टॉक्स को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दें और बर्फ पर रखें । एक बार डीएनए टेम्पलेट, 10X ऊर्जा समाधान मास्टर मिश्रण, और 4X अमीनो एसिड मास्टर मिश्रण गल रहे हैं, बर्फ पर जगह है ।बर्फ पर एक दो मिलीलीटर ट्यूब के लिए सटीक क्रम में प्रत्येक घटक को जोड़कर एक सेल-मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण तैयार करें, और मास्टर मिश्रण के प्रत्येक अतिरिक्त के बाद धीरे-धीरे ट्यूब को झटका दें। विब्रियो नेट्रिजेंस क्रूड सेल को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से निकालें और गल जाने तक 10 से 20 मिनट तक बर्फ पर रखें। सेल-फ्री रिएक्शन मास्टर मिक्स में गल क्रूड सेल एक्सट्रैक्ट की उचित मात्रा जोड़ें और एक पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे मिलाएं।थर्मोसाइकिलर का उपयोग करके एंडपॉइंट सेल-फ्री प्रोटीन अभिव्यक्ति करने के लिए, पहले 96-अच्छी पीसीआर प्लेट के नीचे की अच्छी तरह से सेल-फ्री रिएक्शन मास्टर मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें, जिससे पीसीआर प्लेट में प्रत्येक स्थानांतरण के बीच में धीरे-धीरे ट्यूब को फ्लिक करके मास्टर मिश्रण को मिलाना सुनिश्चित किया जा सके। 10 सेकंड के लिए 1, 000 बार जी पर थाली अपकेंद्रित्र किसी भी मास्टर मिश्रण है कि कुओं के किनारों को अटक गया हो सकता है पूल । और फिर वाष्पीकरण को रोकने के लिए चिपकने वाली प्लेट के साथ कुओं को सील करें।थाली को 105 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म ढक्कन सेट के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर सेट थर्मोसाइकिलर में रखें। पीसीआर प्लेट में कम से कम तीन घंटे तक प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करने के बाद, व्यक्त प्रोटीन को शुद्ध, मात्रात्मक और डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है। एक प्लेट रीडर पिपेट 10 माइक्रोलीटर प्रति सेल-फ्री रिएक्शन मास्टर मिक्स का उपयोग करके सेल-फ्री प्रोटीन अभिव्यक्ति गतिज की निगरानी करने के लिए एक काले 384-अच्छी तरह से परख प्लेट के नीचे स्पष्ट ग्लास बॉटम के नीचे से नीचे से मिश्रण करता है।और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक स्पष्ट प्लेट चिपकने के साथ कुओं को सील करें। परख की थाली को 26 डिग्री सेल्सियस पर सेट प्लेट रीडर में रखें और व्यक्त प्रोटीन के अनुरूप उपयुक्त फ्लोरोसेंट उत्तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की निगरानी करते हुए तीन से छह घंटे तक इनक्यूबेट करें । इस प्रोटोकॉल में वर्णित सेल-फ्री अभिव्यक्ति प्रणाली प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट के साथ सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करती है जो अंतिम बिंदु और गतिज परख द्वारा दिखाए गए रैखिक डीएनए की समान मात्रा की तुलना में प्रोटीन की काफी अधिक मात्रा में उत्पन्न होती है।इन-विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं द्वारा उत्पन्न एमआरएनए का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एमआरएनए की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है। प्रोटीन उत्पादन की उपज मैग्नीशियम और पोटेशियम आयनों की एकाग्रता से काफी प्रभावित हुई थी। अनुकूलित परिस्थितियों में इष्टतम मैग्नीशियम आयन एकाग्रता 3.5 मिलीमोलर और पोटेशियम आयन, 80 मिलीमोलर के लिए पाई गई।इस प्रकार इन इष्टतम आयन सांद्रता से विचलन के परिणामस्वरूप इस अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए प्रोटीन की महत्वपूर्ण पैदावार का उत्पादन करने की क्षमता में कमी आ सकती है। बर्फ पर सभी अभिकर्ण रखना या जितना हो सके कोल्डरूम में काम करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, उचित और पूर्ण सोनीशन इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है।इस प्रोटोकॉल के बाद उपयोगकर्ताओं के पास एक उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में प्रोटीन व्यक्त करने की क्षमता होगी, जिसका उपयोग कई अलग-अलग प्रोटीन की गतिविधि के लिए शुद्ध और स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक सेल-मुक्त अभिव्यक्ति के लिए अद्वितीय गुणों वाले नए जीवों के उपयोग को दर्शाती है। विब्रियो नेट्रीजन एक हेलोफिलिक तेजी से बढ़ते जीवाणु है जो प्रोटीन या छोटे अणुओं की अभिव्यक्ति के लिए अद्वितीय स्थितियां प्रदान कर सकता है जो पहले स्थापित मॉडल जीवों में बेरोज़गार था।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

उच्च throughput प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच microfluidic नहीं एक जनरेटर का उपयोग

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

एक केस स्टडी के रूप में तंबाकू में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति: प्रयोगों दृष्टिकोण की डिजाइन का उपयोग कर परिसर सिस्टम की विशेषता

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

सेलुलर Mimics के निर्माण के लिए vesicles में सेल मुक्त ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद मशीनरी की इनकैप्सुलेशन

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

सेल मुक्त जीवविज्ञान के लिए sealable Femtoliter चैंबर सारणियों

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

प्रोटीन समारोह का अध्ययन और एंटीबॉडी हस्तक्षेप और तीन आयामी पुनर्निर्माण द्वारा बदल प्रोटीन अभिव्यक्ति की भूमिका

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

कीचड़ मोल्ड से बायो-memristors उगाने के लिए एक विधि

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

एक ई. कोलाईआधारित कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में संक्रामक Bacteriophages का संश्लेषण

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

लंबे समय तक सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के संचालन के लिए एक बहुपरत Microfluidic मंच

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

स्यूडोमोनास सिरिंग पीवी के प्रतिरोध की उच्च-थ्रूपुट पहचान। टमाटर में टमाटर अंकुर बाढ़ परख का उपयोग

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

सेल फ्री बैक्टीरियल अर्क, लिपोसोम्स और इमल्शन ट्रांसफर का उपयोग करके प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...