Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 e dipartimento di energia DE-FG02-02ER63445. Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam e Dr. Edgar Goluch per utili consigli su come costruire la sezione protocollo di questo manoscritto.

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DJW, NO, e GMC ha presentato un brevetto relative a questo lavoro.

Questo protocollo è stato ottimizzato per selvaggio-tipo V. natriegens e crescita batterica media composto da LB completati con sali V2 (Tabella materiali). Altri ceppi di V. natriegens possono essere coltivate allo stesso modo per generare estratti cellulari grezzo per reazioni senza cellula; Tuttavia, il loro uso richiede ulteriore ottimizzazione del presente protocollo. Inoltre, questo sistema di espressione della proteina senza cellula è stato ottimizzato utilizzando 3-fosfoglicerato (3-PGA) come la fonte di rigenerazione di energia primaria. Altre fonti di rigenerazione di energia possono essere utilizzati; Tuttavia, ottimizzazione dei reagenti e calibrazione sarà probabilmente necessario ottenere alto rendimento proteina espressione10,11.
Un'attenzione specifica ai diversi passaggi critici in questo protocollo garantirà Estratto di massima produttività per ad alto rendimento senza cellula di produzione della proteina. In primo luogo, estratto grezzo delle cellule deve essere preparato da V. natriegens colture cellulari raccolte in una fase metà-esponenziale di crescita; proteina resa è massima quando culture raggiungono un OD600 = 1,0 ± 0,2. Mentre la produzione di proteine senza cellula è possibile da cellule raccolte in una gamma di densità ottiche, precedentemente abbiamo trovato che le cellule raccolte in un stato esponenziale di crescita rendimento significativamente più proteine9. Gli effetti osservati di densità ottica sulla cella greggio estratto di prestazioni sono coerenti con quelli riportati per altri sistemi di espressione senza cellula derivati dalle cellule coltivate in condizioni di coltura batch1. Poiché V. natriegens cresce ad un ritmo rapido, è essenziale monitorare attentamente le densità ottiche culture. In generale, è previsto che il V. natriegens culture riproducibile dovrebbero raggiungere un OD600 di 1.0 all'interno 1−1.5 h usando questo protocollo; Tuttavia, le condizioni di crescita individuale come l'uso di sconcertato contro boccette non sconcertato, che colpisce l'aerazione o aria contro incubazione di acqua, che colpisce il tasso e la stabilità della temperatura di incubazione, possono alterare il tempo di crescita. Inoltre, si consiglia in genere di almeno 250 mL di V. natriegens in un pallone da 1 L sconcertato per garantire un pellet di grandi cellule al momento del raccolto per la facile manipolazione e trasferimento della coltura. Questo migliora notevolmente il successo della preparazione estratto grezzo delle cellule così come aumenta il volume totale dell'estratto prodotto da una pallina. Quando si utilizza preparazione di scala più piccola, i reagenti e le condizioni di coltura possono essere regolati in modo appropriato. Per fermentazione su larga scala, ulteriore ottimizzazione delle condizioni di coltura può essere richiesto. Infine, per garantire il rendimento ad alta percentuale proteica, è fondamentale che il pellet cellulare vengono elaborati immediatamente dopo la raccolta, o all'interno di 1 − 2 giorni di conservazione a-80 ° C.
La lisi corretta del pellet cellulare tramite sonicazione di impulso è fondamentale per il successo dell'espressione della proteina senza cellula e spesso è l'aspetto più difficile di questo protocollo per i nuovi utenti. In genere, una pallina ben lisata produrrà un volume significativo di Estratto liquido privo di detriti. L'estratto deve essere leggermente viscoso, ma può facilmente essere pipettato quando aliquotare in deposito tubi prima di congelamento in azoto liquido flash. Figura 3 raffigura una rappresentazione di una pallina ben lisata (Figura 3A) rispetto ad un pellet scarsamente lisato (Figura 3B) dopo il passaggio di post lisi centrifugazione. Un'indicazione importante di lisi cellulare completo è una cella greggia estratto proteico totale concentrazione > 20 mg / mL come determinato mediante un test di proteine totali (passo 2.13). Sovra-sonicazione riscaldamento eccessivo dell'estratto grezzo cellulare danneggiano il macchinario cellulare, che non può essere determinato senza eseguire una reazione senza cellula. Così, è altamente benefico per testare l'efficienza di estratto con una reazione di controllo prima di dedicare molto tempo e sforzo per applicazioni di espressione di proteine a valle. Mentre ulteriore ottimizzazione può essere necessarie per le apparecchiature di sonicazione diversi, i passaggi di sonicazione impulsi descritti sono stati altamente riproducibili nelle nostre mani.
L'utilizzo del modello di DNA lineare derivato da amplificazione PCR, enzima di restrizione digest o sintesi di geni commerciale può aumentare significativamente la capacità di produzione di proteine ad alta velocità e rapida nell'espressione senza cellula sistemi24. Mentre la produzione di proteine da modello lineare amplificato di PCR è stata dimostrata, il rendimento di queste reazioni sono di circa 13.5-fold inferiore rispetto alle reazioni usando plasmide mascherina del DNA a rapporti equimolare9. Questo è principalmente a causa dell'instabilità del modello lineare del DNA che è probabile degradata dall'azione delle nucleasi endogene presenti in V. natriegens cella greggio estratto. Mentre fago lambda proteina GamS è stato precedentemente utilizzato per proteggere il DNA lineare modello24,25, è stato trovato per essere incompatibile con V. natriegens estratti9. Inoltre, mentre aumentando la concentrazione della mascherina del DNA lineare potrebbe consentire per un rendimento più elevato di proteine, la degradazione veloce in cella greggio estratto sarà ancora un grave problema.
Una soluzione per superare la degradazione di modello lineare del DNA può essere di completare senza cellula reazioni con modello di mRNA generata da trascrizione in vitro di DNA lineare. D'altra parte, l'uso di un inibitore di RNAsi offre la protezione significativa contro il degrado di trascrizione di mRNA e proteina apprezzabile rendimenti possono essere ottenuti nel formato da 10 μL reazione senza cellula (Figura 5AB). Clonazione del DNA lineare in un modello circolare attraverso la legatura TA, clonazione di TOPO, Golden Gate assembly o altri metodi di ricombinazione possono essere utilizzati per aggirare la degradazione di modello. Tuttavia, ulteriori approcci per inibizione dell'attività della nucleasi sarà necessari per l'espressione della proteina efficiente utilizzando il modello di DNA lineare.
Ad oggi, diversi approcci sono stati proposti per la preparazione dell'estratto grezzo per proteina senza cellula espressione9,10,11,26. Nello sviluppo di questo protocollo, abbiamo cercato di massimizzare l'accessibilità degli utenti, ridurre i costi complessivi e ridurre al minimo i passaggi che richiede tempo. Ad esempio, una resa ad alta percentuale proteica è ottenuta mediante un processo di centrifugazione sonicazione in due semplici passaggi e non richiede omogeneizzatori cella, passi lunghi dialisi o reazione di dilavamento. È semplice da eseguire in un breve periodo di tempo e non richiede elevata competenza del laboratorio. Così, può aiutare a facilitare l'espressione senza cellula come standard per la ricerca accademica traslazionale e progettazione di processo industriale.
Questo protocollo si espande il toolkit disponibile per l'inchiesta e l'utilità di V. natriegens, un organismo non-modello con proprietà biologiche uniche. Rendimento più elevato di proteine possa essere realizzato utilizzando reazioni senza cellula semi - o completamente-continuo, per consentire la rigenerazione di energia, rifornire di aminoacidi e la rimozione dei prodotti di scarto3,5,27. Inoltre, l'ingegneria di selvaggio-tipo V. natriegens per produrre ceppi DNasi - o RNasi-carenti, rimozione delle vie metaboliche deleteri e concorrenti e l'espressione di ulteriori tRNAs potrebbe migliorare notevolmente la produzione di proteine in Questo sistema28,29. Come abbiamo svelare la biologia sottostante la sua rapida crescita, ulteriore sviluppo del V. natriegens sistemi senza cellula può accelerare le capacità bioproduction e consentire robusta espressione di peptidi terapeutici, piccole molecole e sintetico materiali.

Sintesi proteica senza cellula è un metodo versatile ed economico per l'espressione di preziose proteine o peptidi1,2,3,4. Storicamente, la sintesi delle proteine senza cellula è stata eseguita utilizzando sistemi di espressione di Escherichia coli ; Tuttavia, c'è stato un aumento recente utilizzando organismi alternativi, non modello con nuove proprietà come telaio per espressione senza cellula5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismi con profili metabolici unici sono candidati principali come alternative ai sistemi senza cellula di Escherichia coli . Ad esempio, il batterio marino che Vibrio natriegens è la più veloce crescita di tutti gli organismi noti con un osservato raddoppiando il tempo di meno di 10 min13. Questo ha raccolto V. natriegens considerevole attenzione come un host microbico emergente per ricerca e biotecnologie14,15,16,17,18. Dato che il tasso di crescita rapida di V. natriegens è stato collegato agli alti tassi di sintesi delle proteine ed efficienza metabolica19,20,21, sfruttando il suo macchinario cellulare per cellulare-free sintesi possono ampliare in modo significativo il toolkit per la produzione di proteine rapida e high throughput screening.
Recentemente, un cellulare-free V. natriegens sistema di espressione è stato dimostrato che è in grado di produrre super cartella GFP (sfGFP) alle concentrazioni di > 260 μg/mL in 3 h con un promotore di T79. L'obiettivo generale di sviluppare questo metodo era di fornire agli utenti un sistema di espressione di proteine senza cellula altamente accessibile, conveniente, riproducibili e ad alto rendimento che possa essere preparato con comuni attrezzature di laboratorio in un breve lasso di tempo. Questo protocollo utilizza 1L culture in boccette di agitare, lisi cellulare di sonicazione impulsi e reazioni di batch su piccola scala in formato 96 o 384 pozzetti per massimizzare la velocità effettiva di screening e parallelizzazione. Un'espressione di proteina prolungati è reso possibile dal completamento di 3-fosfoglicerato (3-PGA) come un fonte di energia8,22,23. Dopo aver completato con successo questo protocollo, un utente avrà la possibilità di esprimere una proteina voluta o set di proteine in un formato privo di cella utilizzando V. natriegens greggio Cella estrarre.
A partire da uno stock di glicerolo, V. natriegens estratti cellulari greggio sono preparati da cellule raccolte alle densità ottica a 600 nm (OD600) di 1.0. Una cultura di 1L produrrà circa 2−3 mL dell'estratto, che è sufficiente per più di 800 senza cellula reazioni al 25% estratti grezzi della cellula. Proteine possono essere espresso utilizzando il DNA del plasmide, DNA lineare o modello del mRNA; degradazione di modello lineare del DNA dall'azione delle nucleasi endogene rimane tuttavia un grave inconveniente, quando si utilizza il tipo selvaggio V. natriegens cell-free sistema9. A partire da V. natriegens culture, proteina utilizzabile per applicazioni a valle può avvenire da un singolo utente in 1 − 2 giorni pieni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

Il batterio marino Vibrio natriegens ha raccolto una notevole attenzione come un host microbico emergente per biotecnologia grazie al suo tasso di crescita rapida. Un protocollo generale è descritto per la preparazione di V. natriegens estratti cellulari grezzo utilizzando attrezzature di laboratorio comuni. Questo protocollo di rendimento elevato è stato specificamente ottimizzato per l'accessibilità degli utenti e la riduzione dei costi. Sintesi proteica senza cellula (CFPS) può essere effettuata nelle reazioni di piccola scala 10 μL batch in formato 96 o 384 pozzetti e riproducibile produce concentrazioni elevate di cartella super μg/mL di > 260 GFP (sfGFP) all'interno di 3 h. nel complesso, cella di greggio estratto preparazione e CFPS può avvenire in giorni pieni di 1 − 2 da un singolo utente. Questo protocollo è facilmente integrabile in proteina sintesi gasdotti esistenti per facilitare gli avanzamenti nella bio-produzione e applicazioni della biologia sintetica.

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Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Sistemi di espressione senza cellula sono strumenti potenti e convenienti per la sintesi di alto-rendimento e screening di proteine importanti. Qui, descriviamo la preparazione del sistema di espressione della proteina senza cellula utilizzando Vibrio natriegens per la produzione di proteina rapida utilizzando il DNA del plasmide, DNA lineare e modello del mRNA.

Senza cellula proteina espressione utilizzando la rapida crescita batterio Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Il nostro protocollo per l'espressione proteica priva di cellule utilizza estratto grezzo altamente attivo dal batterio Vibrio natriegens in rapida crescita, che viene preparato utilizzando un processo di sonicazione-centrifugazione in due fasi semplice ed efficiente in termini di tempo. La preparazione dell'estratto di cellule grezze e la sintesi proteica priva di cellule possono essere ottenute in uno o due giorni da un singolo utente consentendo a questa tecnica di essere facilmente integrata nelle tubazioni per applicazioni di bioproduzione o biologia sintetica. Per iniziare a lavare un millilitro della coltura natriegens Vibrio durante la notte centrifugandolo in una centrifuga da banco a 10.600 volte g per un minuto.Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet e rimescolare in un millilitro di supporti LB-V2 freschi. Inoculare un millilitro di coltura notturna lavata in un litro di mezzi di crescita LB-V2 freschi in un pallone Erlenmeyer sconcertato da quattro litri autoclavato con copertura sterile per ottenere una-a-mille razione di diluizione. Coltiva la cultura a 30 gradi Celsius mentre tremi a 225 giri/min.Utilizzare uno spettrofotometro per monitorare le impostazioni cultura OD 600. E quando raggiunge 1,0 più o meno 0,2 raccolgono la coltura centrifugandola in due tubi da 500 millilitri a 3.500 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius, e poi vengono posizionare sul ghiaccio. Aspirare il supernatante ed elaborare immediatamente il pellet.Prima di iniziare la procedura di lisi cellulare raffreddare tampone di lisi S30 appena preparato pH da 7,7 a circa quattro gradi Celsius, utilizzare 10 millilitri di questo tampone di lisi S30 freddo per sospendere di nuovo tutti i pellet risultanti dalla stessa coltura di un litro. E trasferire la sospensione su un tubo da 50 millilitri. Centrifugare questa sospensione a 3.500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi aspirare il supernatante senza disturbare il pellet e posizionare sul ghiaccio.Lavorando in una stanza fredda aggiungere 500 microlitri di tampone freddo di llisi S30 al pellet nel tubo da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Utilizzare una punta di pipetta a foro largo per rimescolare il pellet e trasferirlo con cura in un tubo da due millilitri anche sul ghiaccio. Per produrre estratti grezzi molto attivi dobbiamo assicurarci che le cellule non siano troppo diluite con tampone S30, ma abbiano abbastanza liquido per una sonicazione efficiente.Riempire un becher da 600 millilitri con ghiaccio e posizionare un portatubi da due millilitri sopra il ghiaccio. Vortice il tubo brevemente per omogeneizzare le cellule. Scorrere per rimuovere eventuali celle sul fondo del cappuccio e posizionarlo nel supporto del tubo con il cappuccio aperto.La punta del sonicatore inferiore nella sospensione cellulare nel tubo in modo che sia appena sotto la superficie liquida. Preparare il set-up di sonicazione utilizzando un sonicatore e una sonda con un diametro della punta di 1/8 pollice. Impostare il sonicatore a una frequenza di 20 kilohertz e al 50% di ampiezza.Tempo di pulse-on di 10 secondi e tempo di pulse-off di 60 secondi. Eseguire il protocollo di sonicazione degli impulsi per tre cicli. E poi centrifugare l'estratto di cellule grezze a 16.000 volte g per 30-45 minuti a quattro gradi Celsius fino a quando il lisato non è privo di detriti cellulari.Ispezionare visivamente la lisi cellulare man mano che avviene la sonicazione è fondamentale per garantire che la sonicazione abbia funzionato come previsto. Lavorando in una stanza fredda aliquota 50 microlitri dei supernatanti risultanti a nuovi tubi da due millilitri assicurandosi di non disturbare il pellet. Per congelare flash questi estratti di cellule grezze posizionare i tubi in un portatubi con una corda di immersione attaccata e immergersi in una dewar contenente azoto liquido e verificare se congelati.Per eseguire l'espressione proteica priva di cellule utilizzando il modello dna scongelare il mix principale di soluzioni energetiche 10X, le aliquote del mix principale di amminoacidi 4X e il modello di DNA a temperatura ambiente. Quindi rimuovere le scorte di inibitori della T7 RNA polimerasi e della RNAse dal congelatore meno 20 gradi Celsius e posizionare sul ghiaccio. Una volta che il modello di DNA, 10X energy solution master mix e 4X aminoacido master mix vengono scongelati, posizionare sul ghiaccio.Preparare un mix di master di reazione privo di cellule aggiungendo ogni componente nell'ordine accurato a un tubo da due millilitri sul ghiaccio e scorrere delicatamente il tubo dopo ogni aggiunta alla miscela principale. Rimuovere il lysato di cellule grezze Vibrio natriegens dal congelatore meno 80 gradi Celsius e posizionare sul ghiaccio per 10-20 minuti fino allo scongelamento. Aggiungere il volume appropriato dell'estratto di cella grezza scongelato alla miscela master di reazione priva di celle e mescolare delicatamente utilizzando una pipetta.Per eseguire l'espressione proteica priva di cellule endpoint utilizzando il termociclometro, aggiungere prima 10 microlitri del mix master di reazione privo di cellule per pozzetto del fondo di una piastra PCR da 96 pozzetti assicurandosi di mescolare il mix principale facendo scorrere delicatamente il tubo tra ogni trasferimento sulla piastra PCR. Centrifugare la piastra a 1.000 volte g per 10 secondi per mettere in comune qualsiasi mix principale che potrebbe essere stato attaccato ai lati dei pozzi. E poi sigillare i pozzi con un adesivo a piastre per evitare l'evaporazione.Posizionare la piastra in un termociclo impostato a 26 gradi Celsius con un coperchio riscaldato impostato a 105 gradi Celsius. Dopo aver incubato le reazioni nella piastra PCR per un minimo di tre ore, le proteine espresse possono essere purificate, quantificate e utilizzate per i processi a valle. Per monitorare la cinetica di espressione proteica priva di cellule utilizzando una pipetta lettore di lastre 10 microlitri per pozzo del mix master di reazione privo di cellule sul fondo di una piastra di dosaggio nera da 384 po 'con fondi di vetro trasparente.E sigillare i pozzi con un adesivo a piastra chiara per evitare l'evaporazione. Posizionare la piastra di dosaggio in un lettore di lastre impostato a 26 gradi Celsius e incubare per tre o sei ore monitorando le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione fluorescenti appropriate corrispondenti alla proteina espressa. Il sistema di espressione senza cellule descritto in questo protocollo ottiene i migliori risultati con il modello di DNA plasmide che produce una quantità significativamente maggiore di proteine rispetto alla stessa quantità di DNA lineare mostrata dai test endpoint e cinetici.l'mRNA generato da reazioni di trascrizione in vitro potrebbe anche essere usato, ma sono necessarie quantità più elevate di mRNA. La resa della produzione proteica è stata significativamente influenzata dalla concentrazione di ioni di magnesio e potassio. In condizioni ottimizzate la concentrazione ottimale di ioni di magnesio è stata trovata di 3,5 millimolare e per lo ione potassio 80 millimolare.Pertanto, le deviazioni da queste concentrazioni ottimali di ioni possono comportare una minore capacità di questo sistema di espressione di produrre rese significative di proteine. È importante mantenere tutti i reagenti sul ghiaccio o lavorare in una stanza fredda il più possibile. Inoltre, una sonicazione corretta e completa è fondamentale per il successo di questo protocollo.Seguendo questo protocollo gli utenti avranno la capacità di esprimere proteine in un formato ad alta produttività, che può essere utilizzato per purificare e schermare per l'attività di molte proteine diverse. Questa tecnica dimostra l'uso di nuovi organismi con proprietà uniche per l'espressione libera dalle cellule. Vibrio natriegens è un batterio a crescita rapida alofilo che può offrire condizioni uniche per l'espressione di proteine o piccole molecole precedentemente inesplorate in organismi modello consolidati.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Ricerca

Bioingegneria

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Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

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L&#39;incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

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