Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 og Institutt for energi-DE-FG02-02ER63445. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam og Dr. Edgar Goluch for nyttige råd på å konstruere den protokoll delen av dette manuskriptet.

1. forberedelse V. natriegens råolje celle utdrag-bakteriell kultur
<ol><li>Forberede V. natriegens bakterievekst media LB-V2 per tabell 1. Sterilisere vekst media av autoklavering. Tillate media å nå til romtemperatur (RT). Lagre overskytende media på RT. Forsiktig: Bruke riktig personlig verneutstyr (PVU) og se lab bestemte instruksjoner når en autoklav.</li>
	<li>Bruk en glyserol lager av vill-type V. natriegens for å vaksinere 3 mL LB-V2 media. Vokse over natten på 30 ° C mens riste på 225 rpm.</li>
	<li>Vask 1 mL av natten kultur med sentrifugering 10 600 x g på en Borstemmaskin sentrifuge i 1 leveringstanken nedbryting uten å forstyrre det resulterende pellet og resuspend i 1 mL av fersk LB-V2 media.</li>
	<li>Forvirret Erlenmeyer kolbe med sterilt dekselet, Legg 1 L frisk LB-V2 vekst medier i en autoklaveres 4 L. Vaksinere bruker 1 mL av vasket natten kultur (1:1, 000 fortynning ratio). Vokse kultur på 30 ° C mens riste på 225 rpm. Merk: V. natriegens kulturer kan skaleres opp eller ned samtidig 1:1,000 fortynning forholdet. For eksempel legge til 250 μL vasket natten kultur til 250 mL frisk LB-V2 vekst medier i en 2 L forvirret Erlenmeyer flasken sterilt dekselet.</li>
	<li>Overvåke kulturen OD600 bruker et spektrofotometer. Når kultur når OD600 = 1.0 ± 0,2, harvest kultur via sentrifugering 3500 x g for 20 min på 4 ° C. Plasser pellet på isen. Merk: V. natriegens vokser raskt, slik at tett oppfølging av kulturen er nødvendig. Vekst OD600 = 1.0 tar ca 1.5−2 h på 1:1,000 fortynning forholdet.</li>
	<li>Sug opp nedbryting og umiddelbart lagre den resulterende bakteriell pellet ved-80 ° C eller direkte gå til celle lysis beskrevet i del 2. Merk: Dette er en god stoppe punktet; Det anbefales imidlertid at pellet behandles umiddelbart eller innen 1−2 dager for best resultat.</li>
</ol>2. forberedelse V. natriegens råolje celle utdrag-cellen Lysis
<ol><li>Forberede S30 lyseringsbuffer per tabell 1 i sterilt deionisert (DI) vann og justere pH til 7.7 bruker iseddik. Forsiktig: Iseddik bør håndteres med riktig PPE når du justerer pH.</li>
	<li>Cool S30 lyseringsbuffer til ca 4 ° C i kjøleskap eller på isen før du begynner celle lysis prosedyren. Merk: For en rask avkjølt, lyse kan bufferen plasseres på 20 ° C. Tillat ikke bufferen fryse.</li>
	<li>Sett celle pellets på isen i 10−20 min eller til helt tint. Resuspend alle pellets fra samme 1 L kulturen med 10 mL kaldt S30 lyseringsbuffer, deretter overføre suspensjon slik 50 mL. Hvis pellets ikke er frosset i fryseren ved-80 ° C i trinn 1.6, går du direkte til rørets. Merk: Øke volumet av S30 lyseringsbuffer brukes til opprinnelig resuspend pellets etter behov.</li>
	<li>Sentrifuger suspensjon 3500 x g i 10 min på 4 ° C. Sug opp nedbryting uten å forstyrre pellet. Vask pellet annen gang benytter 10 mL kaldt S30 lyseringsbuffer. Plasser pellet på isen.</li>
	<li>
En kald rommet, legge til 500 μL kaldt S30 lyseringsbuffer pellet i 50 mL tube. Bruker en bred-fødte pipette tips, resuspend pellet og nøye overføre hele pellet suspensjon slik 2 mL. Merk: Hvis en bar pipette er ikke tilgjengelig, bruk et par saks til å klippe slutten av en 1 mL pipette tips for å øke bar for pellet overføring.<ol>
<li>Overføre pellet så mye som mulig uten betydelig økt volum; men bør pellet være resuspended i nok væske være sonicated, som angitt av en homogen suspensjon i 2 mL tube. Tanken må ikke overfylles 2 mL tube. Suspensjon skal ikke overstige 1,5 mL; delt inn i flere rør om nødvendig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Holde celle pellet på is og arbeide i et kaldt rom. Fyll en 600 mL kanne med is, og Plasser en 2 mL tube holder på isen. Merk: Det er nyttig å plassere rør abonnenten nær side av begeret, så pellet suspensjon vil være synlig i isen til å overvåke sonication fremdrift (se figur 1).</li>
	<li>Vortex suspendert pellet i 2 mL tube kort til homogenize cellene, flick rør fjerne celler på bunnen av hetten og setter inn tube holderen med cap åpne. Lavere sonicator tips i suspensjon slik at det er like under flytende overflaten.</li>
	<li>Forberede sonication oppsett som vist i figur 2 bruker sonicator og sonde med en ⅛-tommers tuppens diameter. Angi følgende innstillinger i kontrollen sonicator: 20 kHz hyppigheten og 50% amplitude, puls tid: 10 s, puls av tid: 60 s.</li>
	<li>Kjør puls sonication protokollen for tre sykluser. Hvis det totale volumet av pellets suspensjon > 500 μL, kjøre puls sonication protokollen seks ganger. Merk: Vanligvis er 3−6 pulser tilstrekkelig til å lyse V. natriegens pellets; ekstra pulser kan være nødvendige, avhengig av sonicator. Under sonication, kan du bruke justering knute plattformen du flytter sonden opp og ned til lyse noen pellet som kan utlignet til bunnen av røret. Røret kan fjernes fra abonnenten og kort vortexed til nytt homogenize suspensjon mellom pulser. Se diskusjon nedenfor for ønsket konsistens av sonicated celler. Forsiktig: Bruk passende hørselsvern når sonicator er aktivert.</li>
	<li>Etter sonication, sentrifuger råolje celle ekstra 16000 x g i 30−45 min 4 ° C eller til lysate er gratis for alle mobilnettet rusk som vist i Figur 3.</li>
	<li>
I et kaldt rom, aliquot 50 μL av de resulterende supernatants til nye 2 mL rør uten å forstyrre pellet. Merk: rusk overføres ved et uhell i den nye 2 mL rør vil drastisk redusere ekstrakts kapasitet for høy gir proteinsyntese.<ol>
<li>Frivillig, sette til side 10 μL celle trekke for post lysis protein kvantifisering i en separat 2 mL tube (se trinn 2.13 nedenfor).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flash fryse råolje celle ekstrakter ved å plassere rør i rør innehaver med en dipping streng festet som vist i Figur 4. Senk rør i en Dewar med flytende nitrogen og samme sted i en fryser ved-80 ° C før bruk. Forsiktig: Bruk passende PPE for håndtering av flytende nitrogen inkludert Laboratoriefrakk, vernebriller, ansiktsskjerm, cryogen forkle og hansker.</li>
	<li>Eventuelt kvantifisere totale protein i cellen lysate med 10 μL satt av fra trinn 2.11.1 ved å fortynne eksempel 1: 100 i 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) og bruke alle standard totale protein kvantifisering analysen som Bradford analysen, bicinchoninic syre analysen (BCA), etc.</li>
</ol>3. forberedelse Cell-free reaksjon komponenter
<ol><li>
Generelle reaksjonen komponenter
	<ol>
<li>Forbered arbeidet aksjer Mg-glutamat og K-glutamat i 50 mL rør med sterilt DI vann i konsentrasjoner på 100 mM og 2000 mM, henholdsvis.</li>
		<li>Forberede en arbeider aksje av 50% (w/v) polyetylenglykol (PEG)-8000 ved å legge til 100 mL steril DI vann til en 250 mL kanne. Plass en liten magnetisk rørestang i begeret. Veie ut 50 g av PEG-8000 og legge til 100 mL vann i begeret.</li>
		<li>Plasser begeret på en oppvarmet rør sett til 100 ° C og rør på 250 rpm til PEG-8000 er i løsningen. Tillate PEG-8000 flytende blandingen avkjøles før du overfører til 50 mL rør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Energi løsning master mix
	<ol>
<li>Forbered en 5 M løsning av KOH ved å legge til 140 g av KOH pellets 500 mL steril DI vann. Forsiktig: Forberede denne løsningen i en kjemisk hette og ha PPE ved håndtering av sterke baser. Løsningen blir varm så flaske cap må være løs for å forhindre trykkoppbygging. Tillate KOH løsningen nå RT før du bruker.</li>
		<li>Forberede en 1750 mM HEPES-KOH buffer ved å legge 20.85 g HEPES til en 100 mL flaske. Sakte Legg sterilt DI vann til volumet når 40 mL. Vortex flaske å oppløse HEPES. Bruk 5 M KOH løsningen å justere pH til 8.0 og deretter gi løsning volumet til 50 ml passer. Forsiktig: KOH skal behandles med riktig PPE når du justerer pH.</li>
		<li>Klargjøre de resterende 10 x energi master mix bestandskomponenter i konsentrasjoner som er angitt i tabell 2 i sterilt DI vann og plasser hver aksje på isen. Tine 100 mM ATP, GTP, CTP og UTP aksjer på RT og sted på is. Merk: En thermomixer 37 ° C og 350 rpm kan brukes å oppløse reagenser i løsning hvis nødvendig. Ikke overopphetes eller la reagenser på thermomixer i lengre tid.</li>
		<li>I en 15 mL tube, legge hver energi løsning master mix komponent i henhold til rekkefølgen og angitt i tabell 2. Vortex løsningen etter at hver komponent er lagt. Dette vil gjøre 5 mL 10 x energi løsning master mix.</li>
		<li>Del 10 x energi løsning master mix i 200 μL dele i 2 mL rør. Flash fryse hver aliquot som utført i trinn 2.12. Umiddelbart plassere dem i fryseren-80 ° C før bruk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aminosyren master mix
	<ol>
<li>For å forberede frisk 4 x aminosyre master mix, begynne med tining bestand aminosyre på RT og deretter plassere hver på is. Bruk en vortex og/eller thermomixer satt på 37 ° C og 350 rpm for å sikre alle aminosyre aksjer er fullt ut oppløst. Merk: Cystein kan ikke løses fullt; Det kan legges til aminosyre master mix som en suspensjon. Ikke overopphetes eller la reagenser på thermomixer i lengre tid.</li>
		<li>I en 15 mL tube, legge til riktig volum aminosyrer sterilt DI vann slik at siste konsentrasjonen av hver er 8 mM i følgende rekkefølge: ALA ARG ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, hans, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU og CYS. Etter tilføyer hver aminosyre, bland vortex master løsning. Volumene som er oppført i tabell 2 utgjør 2,4 mL aminosyre master mix.</li>
		<li>Del 4 x aminosyre master mix i 200 μL dele i 2 mL rør. Flash fryse hver aliquot som utført i trinn 2.12. Umiddelbart plassere i en fryser ved-80 ° C før bruk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Produksjon av reaksjon-klar plasmider DNA mal Merk: Cellen gratis protein uttrykk i dette systemet har blitt optimalisert med super mappen grønne fluorescerende protein (GFP) uttrykk vektoren T7-pJL1-sfGFP (Tabell for materiale). Det anbefales å bruke denne plasmider som en kontroll for celle-fri reaksjon effektivitet og pJL1 ryggraden for kloning og uttrykk for andre protein sekvenser. Andre plasmider DNA maler kan brukes; Det er imidlertid viktig å merke seg at transkripsjon er kontrollert av en T7 promoter sekvens og tilstedeværelsen av T7 RNA polymerase. En enkel protokoll for storskala produksjon av plasmider DNA mal fra transformert E. coli beskrives nedenfor.<ol>
<li>Rense ønsket vektor med en plasmider rensing kit ifølge produsentens instruksjoner (Tabell for materiale). Merk: Konsentrere plasmider DNA malen som mulig anbefaler å møte stramme volum begrensninger av celle-fri reaksjonen. Generelt mål for en 750−1500 ng/μL arbeider lager.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Produksjon av reaksjon-klar mRNA mal Merk: Denne delen er valgfritt. Protein uttrykk er testet med mRNA malen generert fra i vitro transkripsjon av plasmider T7-pJL1-sfGFP av den oppførte T7 RNA polymerase (Tabell for materiale).<ol>
<li>Forberede mRNA mal fra plasmider DNA koding protein rundt bruker i vitro transkripsjon reaksjon komponentene i tabell 3. Inkuber reaksjoner 1t på 37 ° C i en thermocycler. Merk: Det anbefales å utføre 8−10x av disse reaksjonene parallelt til å generere nok materiale.</li>
		<li>Samle alle transkripsjon reaksjoner. Rense bruker en mRNA rensing og konsentrator kit ifølge produsentens instruksjoner (Tabell for materiale). Elute mRNA mal i sterilt DI vann. Lagre mRNA mal ved-80 ° C før bruk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. utfører Cell-free Protein Eexpression reaksjoner bruker V. natriegens rå ekstrakt
<ol><li>
Cellen gratis protein uttrykk bruker plasmider eller lineær DNA-mal
	<ol>
<li>Fjerne 10 x energi løsning master mix og 4 x aminosyre master mix dele fra-80 ° C fryseren, tine på RT, og plasser på is. Fjerne T7 RNA polymerase og RNase inhibitor aksjer fra 20 ° C fryseren og plasser på isen. Tine DNA mal på RT og sted på is.</li>
		<li>Forberede en celle-fri reaksjon master blanding per Tabell 4 ved å legge hver komponent i følgende rekkefølge til en 2 mL tube på is: aminosyre master mix, energi løsning master mix, Mg-glutamat, K-glutamat, DNA mal, PEG-8000, T7 RNA polymerase og RNase hemmer. Forsiktig sveip røret etter hvert tillegg til master mix. Merk: Hvis lineær mal som skal brukes for cellen uten protein uttrykk, Legg 5−10x mer materiale i forhold til plasmider mal å få nevneverdig gir protein.</li>
		<li>Fjerne V. natriegens råolje celle lysate forberedt i trinn 2,12 fra-80 ° C frysere og sted på isen 10−20 min før tint. Legge til riktige volumet råolje cellen pakke til celle-fri reaksjonen master blanding per Tabell 4 og bland forsiktig flicking eller pipettering opp og ned.</li>
		<li>End-Point celle-fri protein uttrykk ved hjelp av thermocycler<ol>
<li>Pipetter 10 μL celle-fri reaksjonen master blanding til bunnen av en 96 - eller 384-godt PCR plate. I mellom hver overføring av PCR platen, bland master mix ved å sveipe røret forsiktig. Merk: Cellen gratis reaksjonen master blanding bør blandes godt hele tiden å maksimere reaksjon reproduserbarhet og celle-fri protein uttrykk i alle prøvene.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kort sentrifuge platen på 1000 x g for 10 s å samle noen master blanding som kan ha blitt fast på sidene av brønnene. Forsegle brønner med en plate limet å forhindre fordampning og deretter plassere PCR platen i en thermocycler satt på 26 ° C med oppvarmet lokk satt på 105 ° C. Merk: Forbedrer protein uttrykk gir jevn og oppvarmet lokket på en thermocycler.</li>
		<li>Inkuber celle-fri reaksjonene i minst 3 h. Etter inkubasjon kan uttrykt proteiner være renset kvantifisert og brukes for nedstrøms prosesser. Merk: Uttrykt proteiner kan kvantifiseres direkte i cellen-fri reaksjonen bruke en brukerens valg. For eksempel fluorescerende proteiner kan kvantifiseres bruke en ekstern standard kurve eller radioaktivitet kan måles hvis bruker en radiolabeled aminosyre i celle-fri reaksjonen. UV-synlig spektroskopi eller totale protein analyser generelt anbefalt ikke for direkte måling av protein produksjon i celle-fri reaksjoner uten en innledende rensing.</li>
		<li>Alternativt, overvåke celle-fri protein uttrykk kinetics likner en plate.<ol>
<li>Pipetter 10 μL celle-fri reaksjonen master blanding til bunnen av en svart 384-vel analysen plate med klart glassbunn. Holde analysen plate is eller arbeider i et kaldt rom mens master mix slik at full kinetic profilen er oppnådd. Forsegle brønnene med et klart plate lim å hindre fordampning og deretter plassere analysen platen i en plate-leser satt på 26 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inkuber celle-fri reaksjonene for 3−6 h mens overvåking riktig fluorescerende eksitasjon/utslipp bølgelengdene tilsvarer uttrykt protein. For eksempel overvåke på Ex / Em = 485 nm/528 nm for sfGFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cellen gratis protein uttrykk bruker mRNA mal
	<ol>
<li>Tine mRNA mal utarbeidet i trinn 3.5.2 RT og sted på is.</li>
		<li>Utføre trinn 4.1.1 gjennom trinn 4.1.6 som tidligere angitt for lineær eller plasmider DNA malen bruker Tabell 4 for å forberede en alternativ celle-fri reaksjon master blanding mRNA mal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. kalibrering av V. natriegens Cell-free reaksjoner med sfGFP
Merk: Denne delen er valgfritt. Den optimale celle-fri reaksjon konsentrasjonen kan variere noe for hver rå ekstrakt forberedelse basert på betingelsene brukes for cellen lysis. Vurdere å utføre valgfri celle-fri reaksjon ion kalibrering protokollen beskrevet nedenfor med sfGFP hvis reaksjonen gir betydelig lavere enn forventet (konsentrasjoner < 1.0 μg/mL).
<ol><li>Forberede Mg2 + og K+ ion kalibrering løsninger som angitt i tabell 5 i sterilt DI vann fra 100 mM Mg-glutamat og 2 000 mM K-glutamat aksjer i trinn 3.1.1. Plasser kalibrering løsninger på is inntil nødvendig.</li>
	<li>
Etter kartet kalibrering i tabell 6 Pipetter 1 μL Mg-glutamat og 2 μL K-glutamat ion kalibrering løsninger i riktig brønnene i en 384-vel PCR plate.
	<ol>
<li>Operasjonsrekkefølgen av dette trinnet er som følger: Pipette Mg-glutamat ion kalibrering løsning i bunnen av hver godt etterfulgt av K-glutamat ion kalibrering løsningen ved siden av godt uten å berøre væsken allerede i brønnene.</li>
		<li>Forsegle brønnene ved å plassere et lim på platen å hindre fordampning klargjøring kalibrering celle-fri reaksjonen master blanding. Forsiktig Tapp 384-vel plate å blande Mg - og K-glutamat kalibrering løsninger. Merk: En repeater pipette anbefales for å fullføre dette trinnet reproduserbar og raskt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør kalibrering celle-fri reaksjon master blandingen som angitt i tabell 5 bruker T7-pJL1-sfGFP plasmider DNA mal i en 2 mL tube. Legge til hver komponent i følgende rekkefølge til master mix: aminosyre master mix, energi løsning master mix, T7-pJL1-sfGFP DNA mal, PEG-8000, T7 RNA polymerase og RNase inhibitor. Forsiktig sveip røret å blande etter hver komponent. Merk: Ikke Legg Mg2 + eller K+ til kalibreringen celle-fri master mix.</li>
	<li>Fjerne limet fra platen. Nøye Pipetter 7 μL kalibrering celle-fri reaksjonen master blanding på sidene av brønnene uten å berøre blandet ion kalibrering løsningen allerede i brønnene. Forsegle brønner med limet og trykk forsiktig 384-vel PCR plate å blande celle-fri master mix med ion kalibrering løsning. Merk: En repeater pipette anbefales for å fullføre dette trinnet reproduserbar og raskt.</li>
	<li>Kort sentrifuge plate 1000 x g for 10 s å samle ublandet væske som kan ha blitt fast på sidene av brønnene. Plass 384-vel platen i en thermocycler satt på 26 ° C med oppvarmet lokk satt på 105 ° C.</li>
	<li>Inkuber celle-fri reaksjonene for 3t. Etter inkubasjon overføre innholdet i hver brønn til en svart 384-vel analysen plate med glassbunn med en flerkanals pipette og lese fluorescens av sfGFP på Ex / Em = 485 nm/528 nm likner en plate for å bestemme ion konsentrasjon kombinasjonen som gir det høyeste beløpet av protein.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

DJW, nei, og GMC har arkivert en patent knyttet til dette verket.

Denne protokollen er optimalisert for vill-type V. natriegens og bakteriell vekst medier består av LB supplert med V2 salter (Tabell for materiale). Andre stammer av V. natriegens kan tilsvarende kultivert for å generere rå celle ekstrakter for celle-fri reaksjoner; imidlertid trenger flere optimalisering av denne protokollen. I tillegg er celle-fri protein uttrykk systemet optimalisert med 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) som primær energi gjenfødelse kilden. Andre energikilder gjenfødelse kan brukes; optimalisering av reagenser og kalibrering vil imidlertid trolig være nødvendig for å oppnå høy gir protein uttrykk10,11.
Spesiell oppmerksomhet til flere avgjørende skritt i denne protokollen sikrer maksimal ekstrakt produktivitet for høytytende celle-fri protein produksjon. Først råolje celle ekstrakt må være forberedt fra V. natriegens cellekulturer høstet i en midt-eksponentiell vekstfase; protein avkastning er maksimal når kulturer når en OD600 = 1.0 ± 0,2. Cellen gratis protein produksjon er mulig fra celler høstes ved en rekke optiske tettheter, har vi tidligere funnet at celler høstes i en eksponentiell delstaten vekst gi betydelig mer protein9. Observerte effekten av optisk tetthet på råolje celle ekstrakt ytelse er samsvarer med de rapporterte for andre celle-frie uttrykk systemer fra celler dyrket i batch kultur forhold1. Fordi V. natriegens vokser i et hurtig tempo, er det viktig å nøye overvåke kulturer optisk tetthet. Generelt er det forventet at V. natriegens kulturer reproduserbar skal nå et OD600 1,0 innen 1−1.5 h bruker denne protokollen; imidlertid forvirret personlige vekst forhold som bruk av versus ikke-forbløffet flasker, som påvirker lufting eller air versus vann inkubasjon som påvirker hastigheten og stabiliteten til inkubasjon temperatur, kan endre vekst tid. Videre er det generelt anbefalt å kultur minst 250 mL av V. natriegens i en 1 L forbløffet bolle å sikre stor celle pellets på harvest for enkel manipulering og overføring. Dette forbedrer suksessen av råolje celle ekstrakt forberedelse som øker det totale volumet av ekstrakt produsert fra pellets. Når du bruker mindre skala forberedelse, kan kultur forhold og reagenser justeres riktig. For storskala gjæring, kan ytterligere optimalisering av oppdrettsforholdene være nødvendig. Til slutt, for å sikre høy protein avkastning, er det avgjørende at cellen pellets behandles umiddelbart etter høsting eller i 1−2 dager lagring på-80 ° C.
Den riktige lysis av cellen pellet av puls sonication er avgjørende for suksess for cellen uten protein uttrykk og er ofte den vanskeligste delen av denne protokollen for nye brukere. Vel lysed pellets vil vanligvis gi en betydelig mengde flytende ekstrakt som er fri for rusk. Ekstraktet bør være litt tyktflytende, men kan være lett pipetted når aliquoting til lagring rør før flash fryse i flytende nitrogen. Figur 3 viser en representasjon av godt lysed pellets (figur 3A) i forhold til dårlig lysed pellets (figur 3B) etter innlegget lysis sentrifugering trinn. En viktig indikasjon på komplett celle lysis er en grov celle ekstra totale protein konsentrasjon > 20 mg / mL som en total protein analysen (trinn 2.13). Over sonication eller overdreven varme av råolje celle ekstraktet vil skade den cellulære maskineriet, som ikke kan avgjøres uten å utføre en celle-fri reaksjon. Dermed er det svært gunstig å teste ekstra effektivitet med en kontroll reaksjon før vie mye tid og krefter til nedstrøms protein uttrykk programmer. Mens ytterligere optimalisering kan være nødvendig for forskjellige sonication utstyr, vært impuls sonication trinnene beskrevet svært reproduserbare i våre hender.
Bruk av lineære DNA mal fra PCR forsterkning, begrensning enzym ufullstendig eller kommersielle gen syntese kan signifikant øke kapasiteten for høy gjennomstrømming og rask protein produksjon i celle-frie uttrykk systemer24. Mens protein produksjon fra PCR forsterket lineær mal har vist, avkastningen av disse reaksjonene er ca 13.5-fold lavere sammenlignet reaksjoner med plasmider DNA mal på ekvimolare prosenter9. Dette er hovedsakelig på grunn av ustabilitet i lineær DNA malen som trolig ved endogene nucleases i V. natriegens råolje celle ekstrakt. Mens lambda phage protein GamS har tidligere blitt brukt til å beskytte lineær DNA mal24,25, ble det funnet inkompatibel med V. natriegens ekstrakter9. I tillegg, mens øker konsentrasjonen av lineær DNA mal kan tillate en høyere protein avkastning, vil dens rask degradering av råolje celle ekstrakt fortsatt være et stort problem.
En løsning for å overvinne lineær DNA mal fornedrelse kan være å supplere celle-fri reaksjoner med mRNA mal fra i vitro transkripsjon av lineær DNA. På den annen side, bruk av en RNase hemmer gir betydelig beskyttelse mot mRNA transkripsjon fornedrelse og merkbar protein gir kan fås i 10 μL celle-fri reaksjon format (figur 5AB). Kloning av lineær DNA i et rundskriv mal gjennom TA hemorroider, kan TOPO kloning, Golden Gate montering eller andre rekombinasjon metoder brukes til å omgå mal degradering. Likevel vil videre tilnærminger for hemming av nuclease aktivitet være nødvendig for effektiv protein uttrykk bruker lineær DNA mal.
Hittil har foreslått flere ulike tilnærminger for utarbeidelse av rå ekstrakt for cellen uten protein uttrykk9,10,11,26. I utvikling av denne protokollen, søkt vi å maksimere bruker tilgjengelighet, redusere totalkostnadene og minimere tidkrevende trinnene. For eksempel en høy protein avkastning er oppnådd med en enkel prosess for sonication-sentrifugering, og krever ikke celle homogenizers, lange dialyse trinnene og avrenning reaksjon. Det er enkelt å utføre i en kort periode og krever ikke høy laboratorium kompetanse. Dermed kan det hjelpe lette celle-frie uttrykk som standard translasjonsforskning akademisk forskning og prosessindustri.
Denne protokollen utvider verktøysettet tilgjengelig for etterforskning og nytten av V. natriegens, en ikke-modellen organisme med unike biologiske egenskaper. Høyere protein avkastning kan oppnås ved å bruke semi - eller fullt-kontinuerlig celle-fri reaksjoner, å tillate energi gjenfødelse, forsyne aminosyrer og fjerning av avfallsprodukter3,5,27. Videre prosjektering av vill-type V. natriegens å produsere DNAse - eller RNAse-mangelfull stammer, fjerning av skadelige og konkurrerende metabolske veier, og uttrykk for flere tRNAs kan øke produksjonen av proteiner i Dette systemet28,29. Som vi løse biologi underliggende dens raske veksten, kan videreutvikling av V. natriegens celle-frie systemer akselerere bioproduction evner og aktivere robust uttrykk for terapeutisk peptider, små molekyler og syntetisk materialer.

Celle-fri proteinsyntese er en allsidig og kostnadseffektiv metode for uttrykket av verdifulle proteiner eller peptider1,2,3,4. Cellen gratis proteinsyntese er historisk utført med Escherichia coli uttrykk systemer; men har det vært en nylig økning i bruker alternative, ikke-modellen organismer med romanen egenskaper som kabinett for celle-frie uttrykk5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unike metabolske profiler er førsteklasses kandidater som alternativer til E. coli celle-frie systemer. For eksempel dobling marine bakterien Vibrio natriegens er de raskest voksende av alle kjente organismer med en observert tid mindre enn 10 min13. Dette har fått V. natriegens stor oppmerksomhet som en fremvoksende mikrobiell vert for forskning og bioteknologi14,15,16,17,18. Gitt at den raske veksten av V. natriegens har vært knyttet til høy forekomst av proteinsyntese og metabolsk effektivitet19,20,21, utnytte det cellulære maskineriet for celle-fri syntese kan betydelig utvide verktøysettet for rask protein produksjon og høy gjennomstrømming screening.
Nylig en celle-fri V. natriegens uttrykk systemet har vist som er produsere super mappen GFP (sfGFP) på konsentrasjoner av > 260 μg/mL i 3 h med en T7 promoter9. Det overordnete målet for å utvikle denne metoden var å gi brukerne et svært tilgjengelig, kostnadseffektiv, reproduserbare og høytytende celle-fri protein uttrykk system som kan tilberedes ved hjelp av vanlige laboratorieutstyr på kort tid. Denne protokollen bruker 1 L kulturer i riste flasker, celle lysis av puls sonication og småskala satsvise reaksjoner i 96 - eller 384-godt format å maksimere parallelization og screening gjennomstrømming. En lang, vedvarende protein uttrykk er gjort mulig ved påfylling av 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) som en energi kilde8,22,23. Ved å fullføre denne protokollen, en bruker vil ha evnen til å uttrykke en ønsket protein eller sett med proteiner i celle-fritt format med V. natriegens råolje cellen pakke.
Fra en glyserol lager, V. natriegens råolje celle ekstrakter er forberedt fra celler høstes ved en optisk densitet ved 600 nm (OD600) av 1.0. En 1 L kultur vil gi ca 2−3 mL ekstrakt som er tilstrekkelig for mer enn 800 celle-fri reaksjoner på 25% råolje celle ekstrakt. Proteiner kan uttrykkes med plasmider DNA, lineær DNA eller mRNA malen. lineær DNA mal nedbrytning av endogene nucleases imidlertid en stor ulempe ved vill type V. natriegens celle-ledig system9. Fra V. natriegens kulturer, kan protein brukbar for nedstrøms programmer oppnås ved en enkeltbruker i 1−2 hele dager.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

Marine bakterien Vibrio natriegens har fått stor oppmerksomhet som en fremvoksende mikrobiell vert for bioteknologi på grunn av sin raske vekst. En generell protokoll er beskrevet for utarbeidelse av V. natriegens råolje celle ekstrakter bruk vanlig laboratoriet. Denne høy gir protokollen er spesielt optimalisert for brukeren tilgjengelighet og reduserte kostnader. Cellen gratis proteinsyntese (CFPS) kan bli utført i liten skala 10 μL satsvise reaksjoner i enten en 96 - eller 384-godt format og reproduserbar gir konsentrasjoner av > 260 μg/mL super mappe GFP (sfGFP) i 3 h. samlet, råolje celle ekstra forberedelse og CFPS kan oppnås i 1−2 hele dager av en bruker. Denne protokollen kan enkelt integreres i eksisterende protein syntese rørledninger til rette fremskritt innen bio-produksjon og syntetisk biologi programmer.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Celle-frie uttrykk systemer er kraftige og kostnadseffektive verktøy for høy gjennomstrømming syntese og screening av viktige proteiner. Her beskriver vi utarbeidelse av celle-fri protein uttrykk systemet med Vibrio natriegens for rask protein produksjon plasmider DNA, lineær DNA og mRNA mal.

Cellen gratis Protein uttrykk ved hjelp av den raskt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Vår protokoll for cellefritt proteinuttrykk benytter svært aktivt råoljeekstrakt fra den raskt voksende bakterien Vibrio natriegens, som er utarbeidet ved hjelp av en enkel og tidseffektiv to-trinns sonikeringssentrigeringsprosess. Rå celle ekstrakt forberedelse og cellefri proteinsyntese kan oppnås i en til to dager av en enkelt bruker slik at denne teknikken lett kan integreres i rørledninger for bioproduksjon eller syntetisk biologi applikasjoner. For å begynne å vaske en milliliter av natten Vibrio natriegens kultur ved å sentrifugere den i en benkeplate sentrifuge på 10, 600 ganger g i ett minutt.Aspirerer det overnaturante uten å forstyrre pelleten, og resuspend i en milliliter frisk LB-V2 media. Inokuler en milliliter vasket over natten kultur i en liter frisk LB-V2 vekstmedier i en autoklavet fire-liters forvirret Erlenmeyer kolbe med sterilt deksel for å oppnå en-til-en tusen fortynning rasjon. Vokse kultur på 30 grader Celsius mens risting til 225 RPM.Bruk et spektrofotometer for å overvåke kulturene OD 600. Og når den når 1,0 pluss eller minus 0,2 høste kulturen ved å sentrifugere den i to 500-milliliter rør på 3, 500 ganger g i 20 minutter ved fire grader Celsius, og deretter plassere på is. Aspirer den overnaturlige og behandle pelleten umiddelbart.Før du starter cellelyseprosedyren kjølig nylaget S30 lysis buffer pH 7.7 til ca fire grader Celsius, Bruk 10 milliliter av denne kalde S30 lysis buffer for å re-suspendere alle pellets som følge av samme en liter kultur. Og overfør suspensjon til et 50-milliliter rør. Sentrifuge denne suspensjonen på 3, 500 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer deretter supernatanten uten å forstyrre pelleten og legg den på is.Arbeid i et kaldt rom tilsett 500 mikroliter kald S30 lysis buffer til pellet i 50-milliliter røret plassert på is. Bruk en bred pipettespiss til å bruke pelleten på nytt og overfør den forsiktig til et to milliliter rør også på is. For å produsere svært aktive råoljeekstrakter må vi sørge for at cellene ikke er over fortynnet med S30-buffer, men har nok væske til effektiv sonikering.Fyll et 600-milliliter beger med is og plasser en to milliliter rørholder på toppen av isen. Vortex røret kort for å homogenisere cellene. Sveip for å fjerne eventuelle celler på undersiden av hetten, og plasser i rørholderen med hetten åpen.Senk sonicator spissen inn i cellefjæringen i røret slik at den er like under den flytende overflaten. Forbered sonikeringssettet ved hjelp av en sonicator og sonde med en 1/8-tommers tuppdiameter. Sett sonicator på 20 kilohertz frekvens og 50% amplitude.Pulstid på 10 sekunder, og puls-off tid på 60 sekunder. Kjør pulssonikeringsprotokollen i tre sykluser. Og så sentrifuge råolje celle ekstrakt på 16, 000 ganger g i 30 til 45 minutter ved fire grader Celsius til lysate er fri for noen cellulære rusk.Visuelt inspeksjon av cellelyse som sonikering finner sted er avgjørende for å sikre at sonikering har fungert som forventet. Arbeider i et kaldt rom aliquot 50 mikroliter av de resulterende supernatantene til nye to-milliliter rør, og sørg for ikke å forstyrre pelleten. For å blinke fryse disse råoljecelleekstraktene, legg rørene i en rørholder med en dyppestreng festet og senk ned i en dewar som inneholder flytende nitrogen og kontroller om de er frosset.For å utføre cellefritt proteinuttrykk ved hjelp av DNA-mal tining 10X energiløsning master mix, 4X aminosyre master mix aliquots, og DNA mal ved romtemperatur. Fjern deretter T7 RNA polymerase og RNAse hemmer aksjer fra minus 20 grader Celsius fryser og plasser på is. Når DNA-malen, 10X energiløsning master mix, og 4X aminosyre master mix er tint, plasser på is.Forbered en cellefri reaksjonsmasterblanding ved å legge hver komponent i nøyaktig rekkefølge til et to milliliter rør på is, og knips forsiktig røret etter hvert tillegg til hovedblandingen. Fjern Vibrio natriegens råoljecellelysat fra minus 80 grader Celsius fryser og legg på is i 10 til 20 minutter til tint. Tilsett riktig volum av tint råoljecelleekstrakt til den cellefrie reaksjonsmalblandingen og bland forsiktig ved hjelp av en pipette.For å utføre endepunktcellefritt proteinuttrykk ved hjelp av termocycler, legg først til 10 mikroliter av den cellefrie reaksjonsmalblandingen per brønn på bunnen av en 96-brønns PCR-plate som sørger for å blande hovedblandingen ved å sveipe røret forsiktig mellom hver overføring til PCR-platen. Sentrifuger platen ved 1000 ganger g i 10 sekunder for å bassenge enhver masterblanding som kan ha blitt sittende fast på sidene av brønnene. Og forsegle brønnene med et platelim for å forhindre fordampning.Plasser platen i en termocycler satt til 26 grader Celsius med et oppvarmet lokk satt til 105 grader Celsius. Etter inkubering av reaksjonene i PCR-platen i minst tre timer, kan uttrykte proteiner renses, kvantifiseres og brukes til nedstrøms prosesser. For å overvåke cellefri proteinuttrykk kinetikk ved hjelp av en plateleserpipette 10 mikroliter per brønn av den cellefrie reaksjonsmalblandingen til bunnen av en svart 384-brønns analyseplate med klare glassbunner.Og forsegle brønnene med et klart platelim for å forhindre fordampning. Plasser analyseplaten i en plateleser satt til 26 grader Celsius og inkuber i tre til seks timer mens du overvåker de riktige fluorescerende eksitasjons-/utslippsbølgelengdene som tilsvarer det uttrykte proteinet. Cellefritt uttrykkssystem som er beskrevet i denne protokollen oppnår de beste resultatene med plasmid DNA-mal som gir betydelig høyere mengde protein enn samme mengde lineært DNA som vist ved endepunkt og kinetiske analyser.mRNA generert av in-vitro transkripsjonsreaksjoner kan også brukes, men høyere mengder mRNA er nødvendig. Utbyttet av proteinproduksjon ble betydelig påvirket av konsentrasjonen av magnesium og kaliumioner. Under optimaliserte forhold ble den optimale magnesiumionkonsentrasjonen funnet å være 3,5 millimolar og for kaliumion, 80 millimolar.Dermed kan avvik fra disse optimale isjonskonsentrasjonene føre til redusert kapasitet for dette uttrykkssystemet for å produsere betydelige utbytter av proteiner. Det er viktig å holde alle reagenser på is eller arbeide i et kjølerom så mye som mulig. I tillegg er riktig og fullstendig sonikering avgjørende for suksessen til denne protokollen.Etter denne protokollen vil brukerne ha kapasitet til å uttrykke proteiner i et høygjennomstrømningsformat, som kan brukes til å rense og screene for aktivitet av mange forskjellige proteiner. Denne teknikken demonstrerer bruk av nye organismer med unike egenskaper for cellefritt uttrykk. Vibrio natriegens er en halofil raskt voksende bakterie som kan tilby unike forhold for uttrykk for proteiner eller små molekyler som tidligere var uutforsket i etablerte modellorganismer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av Complex Systems Bruke Design of Experiments Approach: Forbigående Protein Expression i tobakk som et Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Lukkbar Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Studerer Protein Funksjon og rolle Altered Protein Expression av antistoff Interferens og Tredimensjonal Rekonstruksjoner

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

En metode for voksende Bio-memristors fra Slim Mold

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Høy-gjennomstrømning identifikasjon av motstand mot Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat ved hjelp av frøplanteflomanalyse

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...