Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de ciências médicas da General 1U01GM110714-01 e departamento de energia DE-FG02-02ER63445. Os autores gostaria de agradecer o Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam e Dr. Edgar Goluch para conselhos úteis sobre construir a seção de protocolo deste manuscrito.

<ol>
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DJW, n, e GMC ter arquivado uma patente relacionada com este trabalho.

Este protocolo foi otimizado para o selvagem-tipo V. natriegens e meios de crescimento bacteriano compostos por LB suplementado com sais V2 (Tabela de materiais). Outras cepas de V. natriegens podem ser cultivadas da mesma forma para gerar extratos bruto célula para célula livre reações; no entanto, seu uso requer otimização adicional do presente protocolo. Além disso, este sistema de expressão de proteínas sem célula foi otimizado usando ácido 3-phosphoglyceric (3-PGA) como fonte de regeneração de energia primária. Outras fontes de regeneração de energia podem ser utilizados; no entanto, a otimização dos reagentes e calibração provavelmente será necessária para obter alto rendimento proteína expressão10,11.
Especial atenção aos vários passos críticos neste protocolo irá garantir produtividade máxima extrato de alto rendimento sem célula de produção de proteína. Primeiro, extrato bruto celular deve ser preparado de V. natriegens célula culturas colhidas numa fase meados-exponencial de crescimento; rendimento de proteína é máximo quando as culturas alcançam uma OD600 = 1,0 ± 0,2. Enquanto a produção de proteína sem célula é possível a partir de células colhidas em uma variedade de densidades ópticas, anteriormente encontramos que as células colhidas em um estado exponencial de crescimento produzem significativamente mais proteína9. Os efeitos observados no desempenho do extrato bruto de célula de densidade óptica são consistentes com aquelas relatadas para outros sistemas de expressão livre de células derivados de células cultivadas em condições de cultura do lote1. Porque V. natriegens cresce a uma taxa rápida, é fundamental acompanhar de perto as densidades ópticas culturas. Em geral, espera-se que V. natriegens culturas reproducibly devem alcançar uma OD600 de 1.0 dentro 1−1.5 h usando este protocolo; no entanto, as condições de crescimento individual como o uso de confundiam versus não-perplexo frascos, que afeta a aeração, ou air contra incubação de água, que afeta a taxa e a estabilidade da temperatura de incubação, podem alterar o tempo de crescimento. Além disso, geralmente recomenda-se cultura de pelo menos 250 mL de V. natriegens num balão de 1L perplexo para garantir um pellet de células grandes na colheita de fácil manipulação e transferência. Isso melhora consideravelmente o sucesso da preparação do extrato bruto de celular, bem como aumenta o volume total do extrato produzido a partir de uma pelota. Ao usar a preparação de escala menor, as condições de cultura e reagentes podem ser ajustados adequadamente. Para a fermentação em larga escala, ainda mais otimização das condições de cultura pode ser necessária. Finalmente, para garantir o rendimento de alta proteína, é fundamental que a célula pelotas são processadas imediatamente após a colheita, ou no prazo de 1−2 dias de armazenamento a-80 ° C.
A Lise adequada do centrifugado pelo sonication pulso é crítico para o sucesso da expressão da proteína sem célula e muitas vezes é o aspecto mais difícil do presente protocolo para novos usuários. Normalmente, uma pelota bem lisada produzirá um volume significativo de extrato líquido livre de detritos. O extrato deve ser ligeiramente viscoso, mas pode facilmente ser pipetado quando alíquotas em armazenamento tubos antes de flash congelamento em nitrogênio líquido. Figura 3 mostra uma representação de um pellet bem lisado (Figura 3A) em comparação com uma pelota mal lisada (Figura 3B) após a etapa de centrifugação de lise de post. Uma indicação importante de lise celular completa é uma célula bruta extrair proteína total concentração > 20 mg / mL, conforme determinado por um ensaio de proteínas totais (etapa 2.13). Sonication excesso ou aquecimento excessivo do extrato bruto de célula irá danificar a maquinaria celular, que não pode ser determinada sem executar uma reação celular livre. Assim, é altamente benéfico testar a eficiência do extrato com uma reação de controle antes de dedicar um tempo significativo e esforço para aplicações de expressão de proteínas a jusante. Enquanto otimização adicional pode ser necessária para equipamentos diferentes sonication, as etapas de pulso sonication descritas foram altamente reprodutíveis em nossas mãos.
O uso do modelo de DNA linear derivado do PCR amplificação, síntese de enzima de restrição ou síntese comercial gene pode aumentar significativamente a capacidade para a produção de proteína de alta produtividade e rápido na célula livre expressão sistemas24. Enquanto a produção de proteína de modelo linear amplificada de PCR tem sido demonstrada, o rendimento destas reações são aproximadamente 13.5-fold inferior em comparação com reações utilizando plasmídeo modelo ADN às relações equimolar9. Isto é principalmente devido à instabilidade do modelo de DNA linear que é provável degradado por nucleases endógenas presentes no V. natriegens extrato bruto de célula. Enquanto do fago lambda que proteína GamS foi anteriormente usado para proteger o DNA Linear modelo de24,25, verificou-se ser incompatível com V. natriegens extrai9. Além disso, enquanto aumentando a concentração de modelo linear de DNA pode permitir um maior rendimento de proteína, sua rápida degradação no extrato bruto celular ainda será um grande problema.
Uma solução para superar a degradação de modelo de DNA linear pode ser suplementar sem célula reações com gerados a partir de in vitro a transcrição de DNA linear do mRNA. Por outro lado, o uso de um inibidor de RNase oferece proteção significativa contra a degradação de transcrição do mRNA e proteína apreciável rendimentos podem ser obtidos no formato sem célula reação 10 μL (Figura 5AB). Clonagem de DNA linear em um modelo circular através da ligadura TA, clonagem de TOPO, montagem de Golden Gate ou outros métodos de recombinação podem ser utilizados para contornar a degradação de modelo. No entanto, novas abordagens para a inibição da atividade da nuclease será necessárias eficiente na expressão de proteínas utilizando modelo linear de DNA.
Até à data, foram propostas várias abordagens diferentes para preparação do extrato bruto de proteína celular livre expressão9,10,11,26. No desenvolvimento deste protocolo, procuramos maximizar a acessibilidade dos utilizadores, reduzir o custo geral e minimizar etapas demoradas. Por exemplo, um rendimento de alta proteína é conseguido usando um processo de centrifugação-sonication duas etapas simples e não requer Homogeneizadores de célula, passos longos diálise ou reação de escoamento. É simples para executar em um curto período de tempo e não exige elevado nível de conhecimentos de laboratório. Assim, pode ajudar a facilitar a célula-livre expressão como um padrão para translação pesquisa acadêmica e projeto de processo industrial.
Este protocolo expande o toolkit, disponível para a investigação e a utilidade do V. natriegens, um organismo não-modelo com propriedades biológicas únicas. Maior rendimento de proteína pode ser conseguido empregando reações sem célula semi ou totalmente-contínua, para permitir a regeneração de energia, segundo de aminoácidos e a remoção de resíduos de produtos3,5,27. Além disso, a engenharia do selvagem-tipo V. natriegens para produzir tensões de DNAse - ou RNAse-deficiente, remoção de vias metabólicas deletérias e concorrentes e expressão de tRNAs adicional podem aumentar consideravelmente a produção de proteínas em Este sistema28,,29. Como podemos desvendar a biologia subjacente a seu rápido crescimento, desenvolvimento de sistemas V. natriegens célula sem acelerar bioproduction recursos e permitir a expressão robusta de peptídeos terapêuticos e pequenas moléculas sintéticas materiais.

Síntese proteica celular-livre é um método versátil e econômico para a expressão de proteínas valiosas ou peptídeos1,2,3,4. Historicamente, síntese proteica celular-livre foi realizada utilizando sistemas de expressão de Escherichia coli ; no entanto, tem havido um aumento recente no uso de organismos alternativos, não-modelo com propriedades romance como chassi para celular-livre expressão5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismos com perfis metabólicos únicos são principais candidatos como alternativas para sistemas sem célula de e. coli . Por exemplo, a bactéria Marinha que Vibrio natriegens é o crescimento rápido de todos os organismos conhecidos com um observado tempo de menos de 10 min13de duplicação. Isto tem atraído V. natriegens considerável atenção como um host microbial emergente para pesquisa e biotecnologia14,15,16,17,18. Dado que a taxa de crescimento rápido de V. natriegens tem sido associada a altas taxas de síntese proteica e eficiência metabólica19,20,21, aproveitando sua maquinaria celular para celular-free síntese pode expandir significativamente o kit de ferramentas para a produção de proteína rápida e seleção da elevado-produção.
Recentemente, uma célula livre V. natriegens sistema de expressão tem sido demonstrado que é capaz de produzir super pasta GFP (sfGFP) em concentrações de > 260 μg/mL em 3 h com um promotor de T79. O objectivo geral de desenvolver esse método foi fornecer aos usuários com um sistema de expressão de proteínas altamente acessível, eficiente, Reproduzível e alto rendimento de célula livre que pode ser preparado utilizando equipamentos comuns de laboratório em um curto espaço de tempo. Este protocolo utiliza 1L culturas em frascos de agitar, lise celular por sonication pulso e reações em pequena escala em lote em um formato de 96 ou 384 poços para maximizar a paralelização e taxa de transferência de rastreio. Uma expressão de proteína longa e sustentado é possibilitada pela suplementação de ácido 3-phosphoglyceric (3-PGA) como uma energia fonte8,22,23. Ao completar com sucesso este protocolo, um usuário terá a capacidade de expressar uma proteína desejada ou extrair o conjunto de proteínas em um formato livre de célula usando V. natriegens célula bruta.
A partir de um estoque de glicerol, V. natriegens extratos de células bruto são preparados a partir de células colhidas em uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de 1.0. Uma cultura de 1L renderá cerca de 2−3 mL de extracto, que é suficiente para mais de 800 sem célula reações no extrato bruto de célula de 25%. As proteínas podem ser expressas usando o plasmídeo DNA, DNA linear ou do mRNA; no entanto, degradação de modelo de DNA linear por nucleases endógenas permanece uma grande desvantagem ao usar o tipo selvagem V. natriegens célula livre sistema9. A partir de culturas de V. natriegens , proteína utilizável para aplicações a jusante pode ser alcançada por um único usuário em dias completos de 1−2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

A bactéria Marinha Vibrio natriegens tem atraído considerável atenção como um host microbial emergente para biotecnologia devido a sua taxa de crescimento rápido. Um protocolo geral é descrito para a preparação da V. natriegens extratos bruto célula utilizando equipamentos comuns de laboratório. Este protocolo alto rendimento tem sido especificamente otimizado para a acessibilidade dos utilizadores e custo reduzido. Síntese de proteína sem célula (CFPS) pode ser realizado em reações de lote em pequena escala 10 μL em qualquer formato 96 ou 384 poços e reproducibly produz concentrações de > 260 μg/mL super pasta GFP (sfGFP) 3 h. em geral, extrato de célula bruta preparação e CFPS pode ser alcançado em dias completos de 1−2 por um único usuário. Este protocolo pode ser facilmente integrado em gasodutos de síntese de proteína existentes para facilitar os avanços na bio-produção e aplicações da biologia sintética.

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Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Sistemas de expressão livre de célula são ferramentas poderosas e custo-eficiente para a síntese de alta produtividade e rastreio de proteínas importantes. Aqui, descrevemos a preparação do sistema de expressão de proteínas sem célula usando Vibrio natriegens para a produção de proteína rápida usando DNA Plasmideo DNA linear e do mRNA.

Proteína celular livre expressão usando o rapidamente crescendo bactéria Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Nosso protocolo de expressão proteica livre de células utiliza extrato bruto altamente ativo da bactéria vibrio natriegens de rápido crescimento, que é preparada usando um processo simples e eficiente de sonicação de duas etapas. A preparação do extrato de células brutas e a síntese de proteínas livres de células podem ser alcançadas em um ou dois dias por um único usuário, permitindo que essa técnica seja facilmente integrada em dutos para aplicações de bioprodução ou biologia sintética. Para começar a lavar um mililitro da cultura de natriegens vibrio durante a noite, centrifugando-o em uma centrífuga de bancada a 10,600 vezes g por um minuto.Aspire o supernatante sem perturbar a pelota, e resuspend em um mililitro de mídia LB-V2 fresca. Inoculado um mililitro de cultura lavada durante a noite em um litro de mídia fresca de crescimento LB-V2 em um frasco erlenmeyer autoclavado de quatro litros perplexo com cobertura estéril para alcançar uma a mil ração de diluição. Cresça cultura a 30 graus Celsius enquanto treme para 225 RPM.Use um espectrômetro para monitorar as culturas OD 600. E quando atingir 1,0 mais ou menos 0,2 colher a cultura centrifugando-a em dois tubos de 500 mililitros a 3.500 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius, e depois colocá-la no gelo. Aspire o supernasce e processe a pelota imediatamente.Antes de iniciar o procedimento de lise celular esfriar o pH tampão S30 recém-preparado de 7,7 a aproximadamente quatro graus Celsius, use 10 mililitros deste tampão de lise S30 frio para suspender de novo todas as pelotas resultantes da mesma cultura de um litro. E transferir suspensão para um tubo de 50 mililitros. Centrifugar esta suspensão a 3.500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e depois aspirar o supernaente sem perturbar a pelota e colocá-la no gelo.Trabalhar em uma sala fria adicione 500 microliters de tampão de lise S30 frio à pelota no tubo de 50 mililitros colocado no gelo. Use uma ponta de pipeta larga para resuspensar a pelota e transferi-la cuidadosamente para um tubo de dois mililitros também no gelo. Para produzir extratos brutos muito ativos, devemos garantir que as células não estejam mais diluídas com tampão S30, mas tenham líquido suficiente para sônica eficiente.Encha um copo de 600 mililitros com gelo e coloque um suporte de tubo de dois mililitros em cima do gelo. Vórtice o tubo brevemente para homogeneizar as células. Filme para remover todas as células na parte inferior da tampa e coloque no suporte do tubo com a tampa aberta.A ponta do sonicador inferior na suspensão celular no tubo de modo que ele esteja logo abaixo da superfície líquida. Prepare a configuração da sônica usando um sonicator e uma sonda com um diâmetro de ponta de 1/8 polegadas. Coloque o sonicator em 20 kilohertz e 50% de amplitude.Tempo de pulso de 10 segundos, e tempo de pulso de 60 segundos. Execute o protocolo de sônica de pulso por três ciclos. E então centrífuga extrato de célula bruta a 16.000 vezes g por 30 a 45 minutos a quatro graus Celsius até que o lysate esteja livre de qualquer detrito celular.Inspecionar visualmente a lise celular à medida que a sônica ocorre é fundamental para garantir que a sônica tenha funcionado como esperado. Trabalhando em uma aliquot 50 microliters de sala fria dos supernantes resultantes para novos tubos de dois mililitros certificando-se de não perturbar a pelota. Para congelar esses extratos de células brutas coloque os tubos em um suporte de tubo com uma corda de mergulho presa e submersa em uma de guerra contendo nitrogênio líquido e verifique se está congelado.Para realizar a expressão proteica livre de células usando o modelo de DNA descongelar 10X solução de energia master mix, 4X aminoácidos mestre mistura alíquotas e modelo de DNA à temperatura ambiente. Em seguida, remova os estoques inibidores de polimerase T7 RNA e RNAse do congelador menos 20 graus Celsius e coloque no gelo. Uma vez que o modelo de DNA, 10X energy solution master mix, e 4X aminoácidos master mix são descongelados, coloque no gelo.Prepare uma mistura mestre de reação livre de células adicionando cada componente na ordem precisa a um tubo de dois mililitros no gelo, e gire suavemente o tubo após cada adição à mistura mestre. Remova o liseto de células brutas vibrio natriegens do congelador de menos 80 graus Celsius e coloque no gelo por 10 a 20 minutos até descongelar. Adicione o volume apropriado de extrato de célula bruta descongelado à mistura mestre de reação livre de células e misture suavemente usando uma pipeta.Para realizar a expressão proteica livre de células endpoint usando termociclador, adicione primeiro 10 microliters da mistura mestre de reação livre de células por poço da parte inferior de uma placa PCR de 96 poços certificando-se de misturar a mistura mestre, movendo o tubo suavemente entre cada transferência para a placa PCR. Centrifugar a placa a 1.000 vezes g durante 10 segundos para agrupar qualquer mistura mestre que possa ter sido presa nas laterais dos poços. E, em seguida, selar os poços com um adesivo de placa para evitar a evaporação.Coloque a placa em um conjunto termociclador a 26 graus Celsius com uma tampa aquecida a 105 graus Celsius. Após a incubação das reações na placa PCR por um mínimo de três horas, as proteínas expressas podem ser purificadas, quantificadas e usadas para processos a jusante. Para monitorar cinética de expressão proteica livre de células usando uma pipeta leitora de placas 10 microliters por poço da mistura mestre de reação livre de células ao fundo de uma placa de ensaio preto 384-bem com fundo de vidro claro.E sele os poços com um adesivo de placa clara para evitar a evaporação. Coloque a placa de ensaio em um conjunto de leitor de placas a 26 graus Celsius e incubar por três a seis horas enquanto monitora os comprimentos de onda fluorescentes/emissões apropriados correspondentes à proteína expressa. O sistema de expressão livre de células descrito neste protocolo alcança os melhores resultados com modelo de DNA plasmídeo produzindo uma quantidade significativamente maior de proteína do que a mesma quantidade de DNA linear mostrada pelos ensaios finais e cinéticos.mRNA gerado por reações de transcrição in vitro também poderia ser usado, mas quantidades maiores de mRNA são necessárias. O rendimento da produção de proteínas foi significativamente afetado pela concentração de íons de magnésio e potássio. Em condições otimizadas, a concentração ideal de íons de magnésio foi encontrada em 3,5 milialares e para íon de potássio, 80 mililitros.Assim, desvios dessas concentrações de íons ideais podem resultar em uma diminuição da capacidade deste sistema de expressão de produzir rendimentos significativos de proteínas. É importante manter todos os reagentes no gelo ou trabalhar em uma sala fria o máximo possível. Além disso, a sônica adequada e completa é fundamental para o sucesso deste protocolo.Seguindo este protocolo, os usuários terão a capacidade de expressar proteínas em um formato de alto rendimento, que pode ser usado para purificar e tela para atividade de muitas proteínas diferentes. Esta técnica demonstra o uso de novos organismos com propriedades únicas para a livre expressão celular. Vibrio natriegens é uma bactéria halofílica de rápido crescimento que pode oferecer condições únicas para a expressão de proteínas ou pequenas moléculas previamente inexploradas em organismos modelos estabelecidos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Bioengenharia

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Arrays Sealable Femtoliter Câmara de Biologia livre-Cell

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Estudar a função da proteína eo papel da expressão proteína alterada pela interferência de anticorpos e reconstruções tridimensionais

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

Um método para o cultivo de Bio-memristors de discoideum

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...