Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Эта работа финансировалась национального института Генеральной медицинских наук 1U01GM110714-01 и Департамента энергетики де-FG02-02ER63445. Авторы хотели бы поблагодарить д-р Ричард Kohman, д-р Дженни там и д-р Эдгар Goluch за полезные советы по строительству в разделе протокол этой рукописи.

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

DJW, нет, и GMC подали патент, связанные с этой работой.

Этот протокол был оптимизирован для одичал тип V. natriegens и бактериальных питательных сред, состоящая из LB дополнена V2 солей (Таблица материалов). Другие штаммы V. natriegens можно аналогичным образом культивировали для создания сырой клеточных экстрактов для свободных клеток реакций; Однако их использование требует дополнительной оптимизации этого протокола. Кроме того эта система выражения протеина, клетки бесплатно была оптимизирована с помощью 3-phosphoglyceric кислоты (3-PGA) как источника первичной энергии регенерации. Могут использоваться другие источники энергии регенерации; Однако оптимизация реагентов и калибровки, вероятно, будет необходимо получить высокие урожайность белка выражение10,11.
Особое внимание на несколько важных шагов в этот протокол обеспечит максимальное извлечение производительности для высокоурожайных свободной ячейки производства белка. Во-первых экстракт сырой ячейки должны быть готовы от V. natriegens клеточных культур собирают в середине экспоненциальной фазе роста; белка урожай максимальна, когда культур достигают ОД600 = 1,0 ± 0,2. Хотя производство клеток бесплатно белка возможен из клеток, собирают в диапазон оптических плотностей, мы ранее нашли что клетки собирают в состоянии экспоненциального роста урожайности значительно больше белков9. Наблюдаемые эффекты оптической плотности на сырой сотовый экстракт производительности согласуются с данным для других систем ячейки свободного выражения, полученные из клеток, выращенных в партии культуры условия1. Потому что V. natriegens растет быстрыми темпами, важно внимательно следить за культур оптических плотностей. В целом ожидается, что V. natriegens культур можно воспроизвести должен достичь ОД600 1.0 в пределах 1−1.5 h, используя этот протокол; Однако индивидуального роста условий, таких как использование озадаченного против-озадаченного колбы, который затрагивает аэрации, или воздуха и воды инкубации, которая влияет на скорость и стабильность температуры инкубации, может изменить время роста. Кроме того обычно рекомендуется культуры по крайней мере 250 мл против natriegens в 1 Л озадачен колбу для обеспечения крупноклеточный лепешки на урожай для легкой обработки и передачи. Это значительно повышает успех экстракт подготовка сырой клетки, а также увеличивает общий объем экстракт получают из гранул. При использовании меньших масштабах подготовки, условий культуры и реагенты могут быть скорректированы соответствующим. Для крупномасштабных ферментации дальнейшей оптимизации условий культуры могут потребоваться. Наконец чтобы обеспечить доходность высоким содержанием белка, важно, что гранулы клетки обрабатываются сразу же после сбора урожая, или в течение 1−2 дней хранения при температуре-80 ° C.
Надлежащего lysis клетки Пелле, пульс sonication имеет решающее значение для успешной экспрессии белков, клеток бесплатно и часто является самым трудным аспектом этого протокола для новых пользователей. Как правило хорошо лизированных Пелле даст значительный объем жидкого экстракта, который свободен от мусора. Выписка должна быть слегка вязкая, но может быть легко накапаны, когда aliquoting в хранилище трубы до вспышки, замораживание в жидком азоте. На рисунке 3 изображена представление хорошо лизированных Пелле (Рисунок 3А) по сравнению с плохо лизированных Пелле (рис. 3B) после центрифугирования шаг лизис пост. Основным показанием лизис полного клеток является ячейку сырой экстракт общего белка концентрацию > 20 мг / мл определяется общий белок пробирного (шаг 2.13). Чрезмерная sonication или чрезмерного нагрева сырой сотовый экстракт повредит клеточными, который не может быть определено без выполнения реакции клетки бесплатно. Таким образом это очень полезно для тестирования экстракта эффективность управления реакцией прежде чем посвятить значительное время и усилия вниз по течению белка выражение приложений. В то время как дополнительные оптимизации могут быть необходимы для различных sonication оборудования, пульс sonication шаги, описанные были весьма воспроизводимые в наших руках.
Использование линейного шаблона дна, производный от амплификации PCR, дайджест энзима ограничения или синтеза коммерческую генов может значительно увеличить потенциал для производства высокой пропускной способностью и быстрым белка в ячейки свободного выражения систем24. Несмотря на то, что было продемонстрировано производство белка от PCR усиливается линейный шаблон, доходность этих реакций являются примерно 13.5-fold ниже по сравнению с реакции, с помощью плазмида ДНК шаблон в эквимолярных соотношениях9. Это главным образом обусловлено нестабильностью линейной ДНК шаблон, который является вероятно деградировали эндогенного nucleases присутствует в V. natriegens экстракт сырой клеток. Хотя фага лямбда белка GamS ранее использовалась для защиты линейной ДНК шаблон24,25было обнаружено, несовместимыми с V. natriegens извлекает9. Кроме того в то время как увеличение концентрации линейной ДНК шаблон может позволить более высокую урожайность белка, его быстрой деградации в сырой сотовый экстракт по-прежнему будет серьезной проблемой.
Решение для преодоления линейный шаблон деградации ДНК может быть дополнить реакций клетки бесплатный шаблон мРНК, образующиеся в vitro транскрипция линейной ДНК. С другой стороны использование битор РНКазы обеспечивает существенную защиту от деградации мРНК Стенограмма и заметных белка урожай может быть получен в формате бесплатно сотовый реакция 10 мкл (Рисунок 5AB). Клонирование линейной ДНК в круговой шаблон через TA перевязки, клонирование TOPO, Золотые ворота Ассамблеи или другие методы рекомбинации может использоваться для обхода шаблон деградации. Тем не менее дальнейшее подходы для ингибирование активности нуклеиназы будет необходимо для эффективного белков с помощью линейной ДНК шаблона.
На сегодняшний день, были предложены несколько различных подходов для подготовки сырой экстракт для свободных клеток белка выражение9,10,11,26. В разработке этого протокола, мы стремились максимизировать доступность пользователей, снизить общую стоимость и сведения к минимуму времени шаги. К примеру высоким содержанием белка урожая достигается с помощью простой двухэтапный процесс sonication центрифугирования и не требует клеток гомогенизаторы, длительные диализа шаги или реакция стока. Это просто выполнить в течение короткого времени и не требует высокого уровня знаний лаборатории. Таким образом это может помочь облегчить ячейки свободного выражения в качестве стандарта для трансляционного академических исследований и проектирования промышленных процессов.
Этот протокол расширяет инструментарий для расследования и полезности V. natriegens, организм-модель с уникальными биологическими свойствами. Высокую урожайность белка может быть достигнуто путем использования полу - или полностью непрерывной свободной ячейки реакций, для регенерации энергии, снабжении аминокислоты, и удаление отходов3,5,27. Кроме того инженерные одичал тип V. natriegens производить DNAse - или РНКазы недостаточным штаммов, устранение пагубных и конкурирующие метаболических и выражение дополнительных tRNAs может значительно повысить производство белков в Эта система28,29. Как мы разгадать биологии, лежащие в основе его быстрый рост, дальнейшее развитие систем V. natriegens свободных клеток может ускорить биопродукции возможности и позволить надежное выражение терапевтического пептидов, малые молекулы и синтетические материалы.

Синтез белков, клеток бесплатная является универсальным и экономичным методом для выражения ценные белки и пептиды1,2,3,4. Исторически синтез белков, клеток бесплатно была выполнена с помощью кишечной палочки выражение систем; Однако был недавний всплеск в использовании альтернативных, -модель организмов с Роман свойствами в качестве шасси для свободных клеток выражение5,6,,78,9 , 10 , 11 , 12. организмы с уникальными метаболические профили являются первоочередными кандидатами альтернативных систем свободных клеток кишечной палочки . Например морской бактерией Vibrio natriegens является самым быстрорастущим всех известных организмов с наблюдаемыми удвоение время менее чем 10 минут13. Это получил V. natriegens значительное внимание как возникающих микробной хост для исследований и биотехнологии14,,1516,17,18. Учитывая, что быстрый прирост V. natriegens были связаны с высоким уровнем синтеза белка и метаболические эффективность19,20,21, использование ее клеточными для клеток бесплатно синтез может значительно расширить инструментарий для быстрой белок производства и высокопроизводительного скрининга.
Недавно, клетки бесплатно V. natriegens выражение системы была продемонстрирована, который способен производить супер папку GFP (sfGFP) в концентрациях > 260 мкг/мл в 3 h с T7 промоутер9. Общая цель разработки этого метода было предоставить пользователям весьма доступными, экономически эффективным, воспроизводимые и высокоурожайных свободных клеток белка выражение системы, которая может быть подготовлен с использованием общих лабораторное оборудование в короткий промежуток времени. Этот протокол использует 1 Л культур в колбах, трясти, лизис клеток, пульс sonication и мелкие партии реакции в формате 96 - или 384-Ну чтобы максимизировать распараллеливания и скрининг пропускную способность. Длинные, устойчивый белков стало возможным благодаря добавок 3-phosphoglyceric кислоты (3-PGA)22,8,источник энергии23. После успешного завершения этот протокол, пользователь будет иметь возможность выразить желаемого белка или извлечь набор белков в формате свободной ячейки с использованием V. natriegens сырой клеток.
Начиная от глицерина запас, V. natriegens сырой клеточных экстрактов готовятся из клеток, собирают в оптической плотности на 600 Нм (600OD) 1.0. 1 Л культура даст около 2−3 мл экстракт, который является достаточным для более чем 800 свободной ячейки реакций на 25% сырой сотовый экстракт. Белки могут быть выражены с помощью плазмида ДНК, линейной ДНК или шаблон мРНК; Однако линейная ДНК шаблон деградации эндогенного nucleases остается основным недостатком при использовании системы дикого типа V. natriegens сотовый бесплатно9. Начиная от V. natriegens культур, белка для нисходящие приложения может быть достиган одного пользователя в 1−2 суток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

Морских бактерией Vibrio natriegens получил большое внимание как возникающих микробной хост для биотехнологии из-за ее быстрые темпы роста. Это общий протокол описан для подготовки V. natriegens сырой клеточных экстрактов с использованием общего лабораторного оборудования. Этот высокий уступая протокол был специально оптимизирован для доступа пользователя и снижение стоимости. Синтез белков, клеток бесплатно (СЛТ) может осуществляться в малых масштабах 10 мкл пакетного реакции в формате 96 - или 384-Ну и можно воспроизвести дает концентрации > 260 мкг/мл супер папки GFP (sfGFP) в течение 3 ч. в целом, сырой сотовый экстракт подготовка и СЛТ может быть достигнуто в 1−2 суток одним пользователем. Этот протокол может быть легко интегрированы в существующие трубопроводы синтез белков для облегчения достижения в био производство и синтетической биологии приложений.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Ячейки свободного выражения системы являются мощными и экономически эффективных инструментов для высок объём синтез и проверка важных белков. Здесь мы описываем подготовку системы выражение протеина, клетки бесплатно, с помощью Vibrio natriegens для быстрого белок производства с использованием плазмида ДНК, линейной ДНК и мРНК шаблон.

Ячейки бесплатно белка выражение с использованием быстро растущих бактерией Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Наш протокол для клеточного экспрессии белка использует очень активный сырой экстракт из быстро растущей бактерии Vibrio natriegens, который готовится с использованием простого и эффективного по времени двухстугового процесса центрифугации соникации. Подготовка экстракта сырых клеток и синтез белка без клеток могут быть достигнуты в течение одного-двух дней одним пользователем, что позволяет легко интегрировать этот метод в трубопроводы для биопроизводства или применения синтетической биологии. Чтобы начать мыть один миллилитр ночь Vibrio natriegens культуры центрифугирования его в центрифуге скамейке на 10, 600 раз г в течение одной минуты.Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы, и повторно в один миллилитр свежих средств LB-V2. Привить один миллилитр промывают ночь культуры в один литр свежих LB-V2 роста средств массовой информации в автоклав четырехлитровый сбит с толку Erlenmeyer колбу со стерильной крышкой для достижения от одной до одной тысячи разбавления рациона. Выращиваем культуру при 30 градусах Цельсия при тряске до 225 об/мин.Используйте спектрофотометр для мониторинга культур OD 600. А когда он достигает 1,0 плюс-минус 0,2 урожая, культура центрифугирует ее в двух 500-миллилитровых трубках по 3500 раз г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, а затем высовывает на лед. Аспирировать супернатант и обрабатывать гранулы немедленно.Перед началом процедуры лиза клетки охладить свежеприготовленный S30 лиза буфер рН 7,7 примерно до четырех градусов по Цельсию, Используйте 10 миллилитров этого холодного буфера S30 лиза, чтобы вновь приостановить все гранулы в результате того же одного литра культуры. И перенесите подвеску на 50-миллилитровую трубку. Центрифуга этой суспензии на 3500 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, а затем аспирировать супернатант, не нарушая гранулы и поместить его на лед.Работая в холодной комнате добавить 500 микролитров холодного буфера S30 лиза к грануле в 50-миллилитровой трубке, помещенной на лед. Используйте широкий наконечник пипетки, чтобы повторно использовать гранулы и тщательно перенести его в двухми миллилитровую трубку также на льду. Для того, чтобы производить очень активные сырые экстракты, мы должны убедиться, что клетки не более разбавленной буфером S30, но имеют достаточно жидкости для эффективной sonication.Заполните 600-миллилитровый стакан со льдом и поместите двухми миллилитровый держатель трубки поверх льда. Вихрь трубки кратко гомогенизировать клетки. Флик, чтобы удалить любые клетки на дне крышки, и поместить в трубку держатель с крышкой открытым.Нижний наконечник sonicator в клеточной подвеске в трубке, так что он находится только под жидкой поверхностью. Подготовь настройку sonication с помощью звукового и зонда диаметром 1/8 дюйма. Установите звуковой на частоте 20 килогерц и 50%амплитуды.Импульс-на время 10 секунд, и импульс-время от 60 секунд. Запустите протокол звуковой связи импульса в течение трех циклов. А затем центрифуга сырой экстракт клеток в 16000 раз г в течение 30 до 45 минут при четырех градусах по Цельсию, пока лисейс не освободится от любого клеточного мусора.Визуальное осматривание лиза клеток по мере того, как происходит звуковое воздействие, имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы звуковое воздействие работало так, как ожидалось. Работа в холодной комнате aliquot 50 микролитров в результате supernatants на новые двухми миллилитровые трубки убедившись, что не беспокоить гранулы. Чтобы флэш заморозить эти сырые экстракты клеток место труб в трубку держатель с погружением строки прилагается и погрузиться в двойку, содержащую жидкий азот и проверить, если замороженные.Для выполнения клеточного экспрессии белка с помощью шаблона ДНК оттепель 10X энергетическое решение мастер смеси, 4X аминокислоты мастер смесь aliquots, и шаблон ДНК при комнатной температуре. Затем удалите полимеразу T7 РНК и запасы ингибитора РНКзы из морозильной камеры минус 20 градусов по Цельсию и поместите на лед. После того, как шаблон ДНК, 10X энергетическое решение мастер смеси, и 4X аминокислоты мастер смесь разморожена, место на льду.Подготовьте микс мастера реакции без клеток, добавив каждый компонент в точном порядке к двухми миллилитровой трубке на льду, и аккуратно щелкнуть трубку после каждого добавления к мастер-миксу. Удалить Vibrio natriegens сырой клетки лишат из минус 80 градусов по Цельсию морозильник и место на льду в течение 10 до 20 минут, пока оттаял. Добавьте соответствующий объем разморожевания экстракта сырой клетки в микс без клеток и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.Для выполнения конечной точки клеточной свободной экспрессии белка с помощью термоциклера, сначала добавьте 10 микролитров клеточной реакции мастер смесь на колодец нижней части 96-хорошо ПЦР пластины убедившись, что смешивать мастер смесь, стряхивая трубку мягко между каждой передачи на пластину ПЦР. Центрифуга пластины на 1000 раз g в течение 10 секунд, чтобы объединить любой мастер смеси, которые, возможно, застряли в стороны скважин. А затем запечатать колодцы с клеем пластины, чтобы предотвратить испарение.Поместите пластину в термоциклер при 26 градусах Цельсия с нагретой крышкой при 105 градусах по Цельсию. После инкубации реакций в пластине ПЦР в течение как минимум трех часов, выраженные белки могут быть очищены, количественно и использованы для процессов вниз по течению. Для мониторинга клеточного экспрессии белка кинетики с помощью пластины считыватель пипетки 10 микролитров на колодец клеточной реакции мастер смесь в нижней части черного 384-ну анализ пластины с четкими стеклянными днами.И запечатать скважины с четким клеем пластины, чтобы предотвратить испарение. Поместите анализную пластину в считыватель пластин, установленный на уровне 26 градусов по Цельсию и инкубировать в течение трех-шести часов при мониторинге соответствующих флуоресцентных возбуждения / выбросов длин волн, соответствующих выраженному белку. Система экспрессии без клеток, описанная в этом протоколе, достигает наилучших результатов с помощью плазмидного шаблона ДНК, который дает значительно большее количество белка, чем такое же количество линейной ДНК, как показано на конечной точке и кинетических анализах.мРНК, генерируемая транскрипционными реакциями in vitro, также может быть использована, но требуется большее количество мРНК. На урожайность белка существенно повлияла концентрация ионов магния и калия. В оптимизированных условиях оптимальная концентрация ионов магния была установлена на уровне 3,5 миллимолара, а для иона калия - 80 миллимоля.Таким образом, отклонения от этих оптимальных концентраций ионов могут привести к снижению способности этой системы выражения производить значительные урожаи белков. Важно, чтобы все реагенты на льду или работать в холодихой как можно больше. Кроме того, надлежащее и полное звуковое око решающее значение для успеха этого протокола.Следуя этому протоколу, пользователи будут иметь возможность выражать белки в формате высокой пропускной способности, которые могут быть использованы для очистки и проверки на активность различных белков. Этот метод демонстрирует использование новых организмов с уникальными свойствами для свободного от клеток выражения. Vibrio natriegens является галофильной быстрорастущей бактерией, которая может предложить уникальные условия для выражения белков или малых молекул, ранее не изученных в установленных модельных организмах.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Инкапсуляция Бесклеточные транскрипции и трансляции в машинный Пузырьки, для построения клеточных Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Пломбируемая Femtoliter палата массивы для сотового без биологии

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Изучение белка функции и роль Altered экспрессии белка с помощью интерференции антител и трехмерных реконструкций

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

Метод для выращивания био memristors от миксомицеты

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Высокопроходичная идентификация сопротивления Pseudomonas syringae pv. Помидор в томате с использованием рассеять рассаду наводнение

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Подготовка белка Производство синтетических клеток с использованием клеток бесплатные бактериальные экстракты, липосомы и эмульсии передачи

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...