Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Detta arbete finansierades av National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 och Institutionen för energi DE-FG02-02ER63445. Författarna vill tacka Dr Richard Kohman, Dr. Jenny Tam och Dr. Edgar Goluch för goda råd om att bygga avsnittet protokollet av detta manuskript.

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

DJW, nej, och GMC har lämnat in ett patent med anknytning till detta arbete.

Detta protokoll har optimerats för vildtyp V. natriegens och bakterietillväxt media består av LB kompletteras med V2 salter (Tabell för material). Andra stammar av V. natriegens kan vara likaså odlas för att generera rå cell extrakt för cellfria reaktioner; deras användning kräver dock ytterligare optimering av detta protokoll. Dessutom har detta cellfria protein uttryck system optimerats med 3-phosphoglyceric syra (3-PGA) som den primära energikällan för regenerering. Andra energikällor för regenerering kan användas; optimering av reagenser och kalibrering kommer dock sannolikt att behöva få hög avkastning protein uttryck10,11.
Särskild uppmärksamhet till flera kritiska steg i detta protokoll garanterar maximal extrakt produktivitet för högavkastande cellfria proteinproduktion. Först, rå cell extrakt måste beredas från V. natriegens cellkulturer skördas i en mitten-exponentiell fas av tillväxt. protein avkastning är svårast när kulturer når en OD600 = 1,0 ± 0,2. Även cellfria proteinproduktion är möjligt från celler skördas vid en rad optiska densiteter, har vi tidigare funnit att celler skördas i tillståndet exponentiell tillväxt ger betydligt mer protein9. De observerade effekterna av optisk densitet på råolja cell extrakt prestanda överensstämmer med de som rapporterats för andra cellfria uttryck system härrör från celler odlas i batch kultur villkor1. Eftersom V. natriegens växer i snabb takt, är det viktigt att noga övervaka kulturers optiska densiteter. I allmänhet, förväntas det att V. natriegens kulturer reproducibly bör nå en OD600 1.0 inom 1−1.5 h använder detta protokoll. dock snopen enskilda tillväxt villkor såsom användning av kontra icke-förbryllad kolvar, som påverkar luftning, eller luft kontra vatten ruvningen, som påverkar den hastighet och stabilitet av inkubering temperatur, ändra tillväxt tid. Dessutom är det generellt rekommenderas att kultur minst 250 mL av V. natriegens i en 1 L förbryllad kolv att säkerställa en stor cellpelleten vid skörd för lätt manipulation och överföring. Detta förbättrar avsevärt framgången av rå cell extrahera förberedelse samt ökar den totala volymen av extrakt produceras från en pellet. När du använder mindre skala förberedelse, kan odlingsbetingelser och reagenser justeras på lämpligt sätt. För storskaliga jäsning, kan ytterligare optimering av odlingsbetingelser behövas. Slutligen, för att säkerställa hög proteinhalt avkastning, är det kritiskt att cell pellets behandlas omedelbart efter skörd, eller inom 1−2 dagar lagra vid-80 ° C.
Ordentlig Lys av cellpelleten av puls ultraljudsbehandling är avgörande för framgången av cellfria proteinuttryck och är ofta den svåraste aspekten av detta protokoll för nya användare. Vanligtvis, en väl lyserat pellet kommer att ge en betydande mängd flytande extrakt som är fri från skräp. Extraktet bör vara något trögflytande men kan vara enkelt pipetteras när alikvotering inlagrats rör innan blixten fryser i flytande kväve. Figur 3 illustrerar en representation av en väl lyserat pellet (figur 3A) i jämförelse med en dåligt lyserat pellet (figur 3B) efter det inlägget lysis centrifugeringssteget. En viktig indikation på komplett cellys är en rå cell extrahera totalprotein koncentration > 20 mg / mL som med en totalt protein analysmetod (steg 2.13). Överdriven ultraljudsbehandling eller överdriven uppvärmning av rå cell extraktet skadar det cellulära maskineriet, som inte kan bestämmas utan att utföra en cellfria reaktion. Därför är det mycket fördelaktigt att testa extrakt effektivitet med en kontroll reaktion innan ägna betydande tid och ansträngning till nedströms protein uttryck applikationer. Medan ytterligare optimering kan behövas för olika ultraljudsbehandling utrustning, har puls ultraljudsbehandling stegen som beskrivs varit mycket reproducerbara i våra händer.
Användning av linjära DNA-mall som härrör från PCR-amplifiering, restriktionsenzym sammanfattad eller kommersiella gen syntes kan avsevärt öka kapaciteten för produktion av högt dataflöde och snabba proteiner i cellen-fria uttryck system24. Medan proteinproduktion från PCR-förstärkta linjär mall har påvisats, är avkastningen av dessa reaktioner cirka 13.5-fold lägre jämfört med reaktioner med hjälp av plasmid DNA mall på equimolar nyckeltal9. Detta beror främst på instabiliteten i den linjära DNA-mallen som sannolikt försämras av endogena nukleaser närvarande i V. natriegens rå cell extrakt. Samtidigt lambda phage protein GamS har använts tidigare att skydda linjära DNA mall24,25, konstaterades vara oförenliga med V. natriegens extrakt9. Dessutom, medan öka koncentrationen av linjära DNA-mall kan möjliggöra en högre protein avkastning, kan dess snabb nedbrytning i rå cell extrakt fortfarande ett stort problem.
En lösning till att övervinna linjära DNA mall nedbrytning kan vara att komplettera cellfria reaktioner med mRNA mallen genereras från in vitro-transkription av linjära DNA. Däremot, användningen av en RNase inhibitor erbjuder betydande skydd mot mRNA avskrift nedbrytningen och märkbar protein avkastning kan erhållas i formatet 10 μL cellfria reaktion (figur 5AB). Kloning av linjära DNA i ett cirkulär mall genom TA ligatur, kan TOPO kloning, Golden Gate församlingen eller andra rekombination metoder användas till att kringgå mall nedbrytning. Dock ytterligare blir strategier för hämning av nuclease aktivitet nödvändigt för effektiv proteinuttryck med linjära DNA-mall.
Hittills har har flera olika metoder föreslagits för beredning av råa extrakt för cellfria protein uttryck9,10,11,26. Vid utvecklingen av detta protokoll har försökt vi maximera användaren tillgänglighet, minska totalkostnaden och minimera tidskrävande steg. Exempelvis en proteinrik avkastning uppnås med hjälp av en enkel tvåstegsprocess ultraljudsbehandling-centrifugering, och kräver inte cell Homogenisatorer, långa dialys steg eller avrinning reaktion. Det är enkelt att köra i en kort tidsperiod och kräver inte hög laboratorium kompetens. Således kan det hjälpa underlätta cellfria uttryck som en standard för translationell akademisk forskning och industriell processdesign.
Detta protokoll expanderar toolkit tillgänglig för utredning och nyttan av V. natriegens, en icke-modell organism med unika biologiska egenskaper. Högre protein avkastning kan uppnås genom att anställa semi - eller fullt-kontinuerlig cellfria reaktioner, att möjliggöra energi regenerering, skärande av aminosyror, och avlägsnande av slaggprodukter3,5,27. Dessutom konstruktion av vildtyp V. natriegens att producera DNAS - eller RNAse-brist stammar, borttagning av skadliga och konkurrerande metaboliska vägar och uttryck för ytterligare tRNAs kan kraftigt öka produktionen av proteiner i Detta system28,29. Som vi riva upp biologin bakom sin snabba tillväxt, kan vidareutveckling av V. natriegens cellfria system påskynda bioproduktion funktioner och aktivera robust uttryck för terapeutiska peptider, små molekyler och syntetiska material.

Cellfria proteinsyntesen är en mångsidig och kostnadseffektiv metod för uttrycket av värdefulla proteiner eller peptider1,2,3,4. Historiskt, har cellfria proteinsyntesen utförts med Escherichia coli uttryck system; Det har dock varit en senaste tidens uppgång i med alternativa, icke-modell organismer med nya egenskaper som chassi för cellfria uttryck5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unika metaboliska profiler är främsta kandidaterna som alternativ till E. coli cell-fria system. Till exempel fördubbling Marina bakterien Vibrio natriegens är den snabbast växande alla kända organismer med en observerade tid på mindre än 10 min13. Detta har rönt V. natriegens stor uppmärksamhet som en framväxande mikrobiell värd för forskning och bioteknik14,15,16,17,18. Tanke på att den snabba tillväxten av V. natriegens har kopplats till höga priser av proteinsyntes och metabolisk effektivitet19,20,21, utnyttja dess cellulära maskineriet för cellfria syntes kan avsevärt utvidga toolkit för snabb proteinproduktion och high-throughput screening.
Nyligen, en cell-fri V. natriegens uttryck systemet har påvisats som är kapabel att producera super mapp GFP (sfGFP) vid koncentrationer > 260 μg/ml i 3 h med en T7 Promotorn9. Det övergripande syftet att utveckla denna metod var att ge användarna en mycket tillgänglig, kostnadseffektiva, reproducerbar och högavkastande cellfria protein uttryck systemet som kan framställas med hjälp av gemensamma labbutrustning i en kort tid. Detta protokoll använder tredjeparts 1 L kulturer i skaka kolvarna, cellys genom puls ultraljudsbehandling och småskaliga batch reaktioner i en 96 - eller 384-bra format för att maximera parallelization och screening genomströmning. En lång, ihållande proteinuttryck görs möjligt genom tillskott av 3-phosphoglyceric syra (3-PGA) som en energi källa8,22,23. Efter framgångsrikt avslutat detta protokoll, en användare kommer att ha kapacitet att uttrycka en önskad protein eller uppsättning proteiner i en cell-fria format med V. natriegens rå cell extrahera.
Start från en glycerol lager, V. natriegens rå cell extrakt är beredd från celler skördas på en optisk densitet på 600 nm (OD600) 1.0. En 1 L kultur kommer att ge cirka 2−3 mL extrakt, som är tillräcklig för mer än 800 cellfria reaktioner på 25% rå cell extrakt. Proteiner kan uttryckas med hjälp av plasmid DNA, linjära DNA eller mRNA mallen. linjära DNA mall nedbrytning av endogena nukleaser förblir dock en stor nackdel när du använder vildtyp V. natriegens cell-fria system9. Start från V. natriegens kulturer, kan protein användbar för nedströms tillämpningar uppnås genom en enskild användare i 1−2 heldagar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

Marina bakterien Vibrio natriegens har rönt stor uppmärksamhet som en framväxande mikrobiell värd för bioteknik på grund av sin snabba tillväxt. Ett allmänt protokoll beskrivs för beredning av V. natriegens rå cell extrakt med hjälp av gemensamma laboratorieutrustning. Hög avkastning protokollet har varit särskilt optimerad för användaren tillgänglighet och minskade kostnader. Cellfria proteinsyntesen (CFPS) kan utföras i liten skala 10 μL batch reaktioner i antingen en 96 - eller 384-bra format och reproducibly ger halter av > 260 μg/mL super mapp GFP (sfGFP) i 3 h. övergripande, rå cell extrahera förberedelse och CFPS kan uppnås i 1−2 hela dagar av en enskild användare. Detta protokoll kan enkelt integreras i befintliga proteinsyntes rörledningarna att underlätta framsteg i bio-produktion och syntetisk biologi tillämpningar.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellfria uttryck system är kraftfulla och kostnadseffektiva verktyg för hög genomströmning syntes och screening av viktiga proteiner. Här beskriver vi beredning av cellfria protein uttryck systemet med Vibrio natriegens för snabba proteinproduktion med hjälp av plasmid DNA, linjära DNA och mRNA mall.

Cellfria Protein uttryck med den snabbt växande bakterien Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Vårt protokoll för cell-free protein uttryck utnyttjar mycket aktiv rå extrakt från den snabbt växande bakterien Vibrio natriegens, som är beredd med hjälp av en enkel och tidseffektiv två steg ultraljudsbehandling-centrifugering process. Rå cell extrakt beredning och cell-free proteinsyntes kan uppnås i en till två dagar av en enda användare gör att denna teknik enkelt integreras i rörledningar för bioproduktion eller syntetiska tillämpningar biologi. För att börja tvätta en milliliter av natten Vibrio natriegens kultur genom centrifugering det i en bänkskiva centrifug på 10, 600 gånger g i en minut.Aspirera supernatanten utan att störa pelleten, och resuspend i en milliliter av färskt LB-V2-media. Inokulera en milliliter av tvättade natten kultur i en liter färsk LB-V2 tillväxt media i en autoclaved fyra-liters förbryllad Erlenmeyer kolv med sterilt lock för att uppnå en till ett tusen utspädning ranson. Odla kulturen vid 30 grader Celsius medan du skakar till 225 RPM.Använd en spektrofotometer för att övervaka kulturerna OD 600. Och när den når 1,0 plus eller minus 0,2 skörda kulturen genom centrifugering det i två 500-milliliter rör på 3, 500 gånger g i 20 minuter vid fyra grader Celsius, och sedan placera på is. Aspirera supernatanten och bearbeta pelleten omedelbart.Innan du startar cellen lys förfarande svalna nyberedda S30 lys buffert pH 7,7 till cirka fyra grader Celsius, Använd 10 milliliter av denna kalla S30 lysbuffert att åter avbryta alla pellets som härrör från samma en liters kultur. Och överför fjädring till ett 50-milliliter rör. Centrifugera denna suspension vid 3, 500 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius, och sedan aspirera supernatanten utan att störa pelleten och placera den på is.Arbeta i ett kylrum lägga 500 mikroliter av kall S30 lys buffert till pelleten i 50-milliliter röret placeras på is. Använd en bred bore pipett spets för att återanvända pelleten och försiktigt överföra den till en två-milliliter rör också på is. För att producera mycket aktiva rå extrakt vi måste se till att cellerna inte är över utspädd med S30 buffert, men har tillräckligt med vätska för effektiv ultraljudsbehandling.Fyll en 600-milliliter bägare med is och placera en två-milliliter tubhållare ovanpå isen. Vortexa röret kort för att homogenisera cellerna. Snärta för att ta bort eventuella celler på botten av locket, och placera i rörhållare med locket öppet.Sänk sonicator spets i cellen suspension i röret så att det är precis under vätskeytan. Förbered ultraljudsbehandling set-up med hjälp av en sonicator och sond med en 1/8-tums spets diameter. Ställ sonicator på 20 kilohertz frekvens och 50%amplitud.Puls-på-tid på 10 sekunder, och puls-off tid på 60 sekunder. Kör pulsen ultraljudsbehandling protokollet för tre cykler. Och sedan centrifug crude cell extrakt på 16,000 gånger g i 30 till 45 minuter vid fyra grader Celsius tills lysate är fri från alla cellulära skräp.Visuellt inspektera cell lys som ultraljudsbehandling sker är avgörande för att säkerställa att ultraljudsbehandling har fungerat som förväntat. Arbeta i ett kallt rum aliquot 50 mikroliter av de resulterande supernatanter till nya två-milliliter rör se till att inte störa pelleten. För att blinka frysa dessa råcell extrakt placera rören i ett rör hållare med en doppning sträng bifogas och doppa i ett avkrig som innehåller flytande kväve och kontrollera om fryst.För att utföra cellfria proteinuttryck med hjälp av DNA-mall tina 10X energi lösning master mix, 4X aminosyra master mix alikvoter, och DNA mall vid rumstemperatur. Ta sedan bort T7-RNA-polymeras- och RNAs-hämmarlagren från minus 20 grader Celsius-frysen och placera på is. När DNA-mallen, 10X energilösning master mix, och 4X aminosyra master mix tinas, placera på is.Förbered en cellfri reaktionsmästarblandning genom att lägga till varje komponent i den exakta ordningen till ett två-milliliter rör på is, och snärta försiktigt röret efter varje tillägg till mastermixen. Ta bort Vibrio natriegens råcell lysate från minus 80 grader Celsius frys och placera på is i 10 till 20 minuter tills tinas. Tillsätt lämplig volym av tinat råcellextrakt till den cellfria reaktionsmästarblandningen och blanda försiktigt med hjälp av en pipett.För att utföra endpoint cell-fri protein uttryck med hjälp av termocyklare, först lägga till 10 mikroliter av cell-fri reaktion master mix per brunn av botten av en 96-väl PCR-platta se till att blanda master mix genom att snärta röret försiktigt i mellan varje överföring till PCR plattan. Centrifugera plattan vid 1, 000 gånger g i 10 sekunder för att slå samman någon master mix som kan ha fastnat på sidorna av brunnarna. Och sedan försegla brunnarna med en platta lim för att förhindra avdunstning.Placera plattan i en termocyklare inställd på 26 grader Celsius med ett uppvärmt lock inställt på 105 grader Celsius. Efter inkubation av reaktionerna i PCR-plattan i minst tre timmar, kan uttryckta proteiner renas, kvantifieras och användas för nedströmsprocesser. För att övervaka cellfria proteinuttryck kinetik med hjälp av en tallrik läsare pipett 10 mikroliter per brunn av cell-fri reaktion master mix till botten av en svart 384-brunn assay platta med klart glas bottnar.Och täta brunnarna med en klar platta lim för att förhindra avdunstning. Placera assayplattan i en plattavläsare som är satt vid 26 grader Celsius och inkubera i tre till sex timmar samtidigt som du övervakar lämpliga fluorescerande excitations-/emissionsvåglängder som motsvarar det uttryckta proteinet. Cell-free uttryck system som beskrivs i detta protokoll uppnå bästa resultat med plasmid DNA mall ger betydligt högre mängd protein än samma mängd linjärt DNA som visas av endpoint och kinetiska analyser.mRNA som genereras av in vitro-transkriptionsreaktioner skulle också kunna användas, men högre mängder mRNA krävs. Utbytet av proteinproduktionen påverkades avsevärt av koncentrationen av magnesium och kaliumjoner. Under optimerade förhållanden den optimala magnesium jonkoncentrationen befanns vara 3,5 millimolar och för kaliumjon, 80 millimolar.Således kan avvikelser från dessa optimala jonkoncentrationer resultera i en minskad kapacitet för detta uttryckssystem att producera betydande avkastning av proteiner. Det är viktigt att hålla alla reagenser på is eller arbeta i ett kallt rum så mycket som möjligt. Dessutom är korrekt och fullständig ultraljudsbehandling avgörande för framgången för detta protokoll.Efter detta protokoll användare kommer att ha kapacitet att uttrycka proteiner i en hög genomströmning format, som kan användas för att rena och skärm för aktivitet av många olika proteiner. Denna teknik visar användningen av nya organismer med unika egenskaper för cell-free uttryck. Vibrio natriegens är en halofilisk snabbväxande bakterie som kan erbjuda unika villkor för uttryck av proteiner eller små molekyler som tidigare outforskats i etablerade modellorganismer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av komplexa system Använda Försöks Tillvägagångssätt: Transient Protein Expression i tobak som en fallstudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Förslutningsbar Femtoliter Chamber arrayer för Cellfri biologi

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Studera proteiners funktion och rollen av förändrade proteinuttryck av antikropp Störningar och Tredimensionella Rekonstruktioner

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

En metod för att odla Bio-memristors från Slime Mold

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntesen av infektiös bakteriofager i en E. coli -baserade Cell-free uttryck systemet

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Hög genomströmning Identifiering av resistens mot Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat med plantning Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...