Name: cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Bu eser Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler 1U01GM110714-01 ve bölümü enerji DE-FG02-02ER63445 tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam ve Dr. Edgar Goluch bu el yazması Protokolü bölümünde inşa üzerinde faydalı tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases.">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Henrich, E., Hein, C., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates.">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li><li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+high+yielding+streptomyces&#8208;based+cell&#8208;free+protein+synthesis+system.">Establishing a high yielding streptomyces&#8208;based cell&#8208;free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li><li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool.">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).</li><li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements.">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).</li><li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements.">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li><li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System.">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li><li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens.">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li><li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens.">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).</li><li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria.">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li><li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+natriegens,+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes.">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li><li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology.">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li><li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens,+a+new+genomic+powerhouse.">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487 (2016).</li><li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+in+Vibrio+natriegens.">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088 (2017).</li><li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes.">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Llamosas, H., Castro, L., Bl&#225;zquez, M. L., D&#237;az, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory.">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).</li><li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens.">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li><li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology.">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li><li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis.">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system.">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation.">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).</li><li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors.">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li><li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts.">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li></ol>

DJW, Hayır, ve GMC bu işle ilgili bir patent Filed under.

Bu iletişim kuralı, vahşi tipli natriegens V. ve V2 tuzları (Malzemeler tablo) ile desteklenmiş LB oluşan Bakteriyel büyüme medya için en iyi duruma getirilmiş. Natriegens V. diğer suşların ham hücre özleri hücre-alerjik reaksiyonlar için oluşturmak için benzer şekilde kültürlü; Ancak, bunların kullanımı bu protokol ek optimizasyonu gerektirir. Ayrıca, bu boş hücre proteini ifade sistem 3-phosphoglyceric asit (3-PGA) birincil enerji rejenerasyon kaynağı olarak kullanarak optimize edilmiştir. Diğer enerji yenilenme kaynakları kullanılabilir; Ancak, reaktifler ve Kalibrasyon duruma getirilmesi büyük olasılıkla yüksek verimli protein ifade10,11almak için gerekli olacaktır.
Bu iletişim kuralı birkaç kritik adım belirli dikkat maksimal özü verimlilik için yüksek verimli sağlayacak cep-Alerjik protein üretim. İlk olarak, ham hücre özü natriegens V. hücre kültürleri-üstel büyüme; aşamasında hasat üzerinden hazırlanan gerekir protein verimidir maksimal kültürler bir OD600 ulaştığınızda = 1.0 ± 0.2. Boş hücre protein üretim optik yoğunlukları bir mesafeden hasat hücrelerden mümkün olmakla birlikte, daha önce bir üstel büyüme durumda hasat hücreleri önemli ölçüde daha fazla protein9verim bulduk. Ham hücre özü performans gözlenen optik yoğunluk etkilerini formüllerdekilerle tutarlı toplu kültür koşulları1' yetiştirilen hücrelerden elde edilen diğer ifade boş hücre sistemleri bildirdi. Natriegens hızlı bir oranda yetişir çünkü kültürler optik yoğunluğunu yakından izlemek için önemlidir. Genel olarak, bu natriegens V. kültürler tekrarlanarak 1.0 bu iletişim kuralını kullanan 1−1.5 h içinde bir OD600 ulaştırılması gerekmektedir bekleniyor; Ancak, kullanımı gibi bireysel büyüme koşullarına karşı şişeler sigara şaşkın hangi etkiler havalandırma veya hava hızı ve istikrar, kuluçka sıcaklık etkiler, su kuluçka karşı büyüme zaman değiştirebilir, şaşkın. Ayrıca, genellikle büyük hücreli Pelet hasat kolayca idare ve transferi, emin olmak için natriegens bir 1 L şaşkın şişesi içinde en az 250 mL kültür için önerilir. Bu ham hücre özü hazırlık hem de özü hacmi bir Pelet üretilen artar başarısı büyük ölçüde artırır. Daha küçük ölçekli hazırlık kullanırken, kültür koşulları ve Kimyasalları uygun şekilde ayarlanabilir. Büyük ölçekli fermantasyon için daha fazla kültür koşulları duruma getirilmesi gerekli olabilir. Son olarak, yüksek protein verim sağlamak için bu hücre topakları hemen sonra hasat veya-80 ° C'de saklama 1−2 gün içinde işlenir önemlidir
Hücre Pelet darbe sonication tarafından uygun lizis boş hücre proteini ifade başarısı için çok önemlidir ve sık sık yeni kullanıcılar için bu protokolü en zor olanıdır. Genellikle, bir de lysed Pelet enkaz serbest olduğundan sıvı ekstresinin önemli bir cilt ortaya çıkarır. Özü biraz yapışkan olmalı ama ne zaman daha önce sıvı azot içinde buz gibi flaş depolama içine aliquoting Tüpler kolayca pipetted. Şekil 3 de lysed Pelet (şekil 3A) gösterimi sonrası lizis Santrifüjü adımdan sonra bir kötü lysed Pelet (şekil 3B) ile karşılaştırıldığında gösteriyor. Bir büyük tam hücre lizis ham hücre ayıklamak toplam protein konsantrasyonu > 20 mg / toplam protein tahlil (Adım 2.13) tarafından belirlenen mL göstergesidir. Aşırı sonication ya da aşırı ısınma ham hücre ekstresinin bir boş hücre tepki gerçekleştirmeden belirlenemiyor hücresel makine zarar verir. Böylece, özü verimlilik aşağı akım protein ifade uygulamaları için önemli ölçüde zaman ve çaba ithaf önce bir denetim tepki ile test etmek son derece faydalıdır. Ek optimizasyon farklı sonication ekipmanları için gerekli olsa da, darbe sonication merdiven tanımlamak son derece bizim ellerimizde tekrarlanabilir olmuştur.
PCR güçlendirme, restriksiyon enzimi Özet veya ticari gen sentez türetilmiş doğrusal DNA şablon kullanımı için boş hücre ifade sistemleri24yüksek üretilen iş ve hızlı protein üretim kapasitesi önemli ölçüde artırabilir. Protein üretim PCR güçlendirilmiş doğrusal şablondan göstermiştir, bu tepkiler verim iken yaklaşık 13.5-fold alt plazmid kullanarak tepkiler DNA şablon ekimolar oranları9ile karşılaştırıldığında. Bu öncelikle endojen nükleaz V. natriegens ham hücre hulâsa içinde mevcut tarafından bozulmuş olma ihtimali olan doğrusal DNA şablonu istikrarsızlık kaynaklanmaktadır. Protein GamS daha önce doğrusal DNA şablon24,25korumak için kullanılmıştır lambda fajının V. natriegens ile uyumlu olmadığı için9ayıklar bulundu. Ayrıca, doğrusal DNA şablonu konsantrasyonunu artırmak için daha yüksek bir protein verim izin iken, onun hızlı bozulma ham hücre özü hala büyük bir sorun olacak.
Doğrusal DNA şablon bozulması üstesinden gelmek için bir çözüm boş hücre reaksiyonları ile tüp bebek doğrusal DNA transkripsiyon oluşturulan mRNA şablonunu ek olarak olabilir. Öte yandan, bir RNase inhibitörü kullanımı mRNA transkript düşmesine karşı önemli koruma sağlar ve kayda değer protein verimleri 10 μL boş hücre tepki biçimi (5A rakamB) elde edilebilir. Döngüsel şablonda TA ligasyonu ile doğrusal DNA'sı klonlama, TOPO klonlama, Golden Gate derleme veya diğer rekombinasyon yöntemleri şablon bozulması aşmak için kullanılabilir. Yine de, daha fazla yaklaşımlar nükleaz aktivitesinin inhibisyonu için doğrusal DNA şablonu kullanarak verimli protein ifade için gerekli olacaktır.
Bugüne kadar birkaç farklı yaklaşım boş hücre proteini ifade9,10,11,26için ham özü hazırlanması için önerilmiştir. Bu iletişim kuralı geliştirirken, kullanıcı erişilebilirlik en üst düzeye çıkarmak, toplam maliyeti azaltmak ve zaman alıcı adımlar en aza indirmek için çalıştı. Örneğin, bir yüksek protein verim bir basit işlemdir sonication Santrifüjü kullanarak elde edilir ve hücre homogenizers, uzun diyaliz adımları veya axım tepki gerektirmez. Kısa bir süre içinde yürütmek basit ve yüksek düzey laboratuvar uzmanlık gerektirmez. Böylece, boş hücre ifade translasyonel akademik araştırma ve endüstriyel süreç tasarımı için bir standart olarak kolaylaştıracak yardımcı olabilir.
Bu iletişim kuralı alet elde edilebilir için soruşturma ve natriegens V., benzersiz biyolojik özelliklere sahip bir model olmayan organizma yarar genişletir. Yüksek protein verim elde enerji rejenerasyon için izin vermek için yarı - veya tamamen-sürekli boş hücre reaksiyonları istihdam ederek amino asitler ve atık ürünlerin3,5,27kaldırılması resupplying. Ayrıca, Dnaz veya RNAse eksik suşları üretmek için vahşi tipli natriegens V. mühendislik, zararlı ve rakip metabolik yollar kaldırılması ve ek tRNA ifade büyük proteinlerin üretimini geliştirmek Bu sistem28,29. Biz hızlı büyümesini temel Biyoloji çözmek gibi daha fazla natriegens V. boş hücre sistemlerinin geliştirilmesi bioproduction yetenekleri hızlandırmak ve tedavi peptidler, küçük moleküller ve sentetik sağlam ifade etkinleştirmek malzemeler.

Boş hücre protein sentezi değerli proteinler veya peptidler1,2,3,4bir ifade için çok yönlü ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Tarihsel olarak, boş hücre protein sentezi Escherichia coli ifade sistemleri kullanılarak yapılmıştır; Ancak, ortada bir son dalgalanma alternatif, Sigara model organizmalar yeni özelliklere sahip kasa ifade boş hücre5için,6,7,8,9 kullanarak , 10 , 11 , 12. benzersiz metabolik profilleri ile organizmalar E. coli boş hücre sistemleri alternatif olarak Başbakan adayları vardır. Örneğin, en hızlı büyüyen bir gözlenen ile tüm bilinen organizmaların Vibrio natriegens olduğunu deniz bakteri saat 10 dk13az iki katına. Bu araştırma ve biyoteknoloji14,15,16,17,18için gelişmekte olan bir mikrobiyal konağı olarak natriegens V. büyük ilgi topladı vardır. Natriegens hızlı büyüme oranına sahip verilen bu protein sentezi ve boş hücre için onun hücresel makine harnessing metabolik verimliliği19,20,21, yüksek oranda bağlantılı olmuştur sentez toolkit hızlı protein üretimi ve yüksek üretilen iş tarama için önemli ölçüde genişleyebilir.
Son zamanlarda, bir-boş hücre V. natriegens ifade sistem gösterdi süper klasör GFP (sfGFP) olarak T7 organizatörü93 h > 260 μg/mL konsantrasyonlarda üretme yeteneğine sahip olan. Bu yöntem geliştirme genel amacı ortak laboratuar ekipmanları zaman kısa bir miktarda kullanılarak hazırlanan son derece erişilebilir, maliyet-etkin, tekrarlanabilir ve yüksek verimli boş hücre proteini ifade sistem sunmak için yapıldı. Bu iletişim kuralını kullanan sallamak şişeler 1 L kültürlerde, hücre lizis darbe sonication ve küçük ölçekli toplu tepkileri parallelization ve filtreleme verimi en üst düzeye çıkarmak için bir 96 - veya 384-da biçiminde tarafından. Uzun, sürekli protein ifade tarafından 3-phosphoglyceric asit (3-PGA) takviyesi bir enerji kaynağı8,22,23mümkün olmaktadır. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlayan, üzerine bir kullanıcı istenen bir protein hızlı yeteneğine sahip veya proteinlerin natriegens V. ham hücre kullanarak boş hücre biçiminde ayıklayabilirsiniz.
Gliserol stoktan başlayarak, V. natriegens ham hücre özleri 600 optik bir yoğunluk, hasat hücrelerden hazırlanır nm (OD600) 1.0. 1 L kültür yaklaşık 2−3 mL % 25 ham hücre özü itibariyle 800'den fazla boş hücre reaksiyonları için yeterlidir ekstresinin ortaya çıkarır. Proteinler plazmid DNA, doğrusal DNA veya mRNA şablonu kullanarak ifade edilebilir; Ancak, doğrusal DNA şablon bozulması endojen enzimler tarafından vahşi tip natriegens V. -boş hücre sistemi9kullanırken büyük bir dezavantaj kalır. Natriegens kültürler başlayarak, protein aşağı akım uygulamalarda kullanılabilir tek bir kullanıcı tarafından 1−2 tam gün içinde elde edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Black Assay Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30129300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate Adhesives</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD)</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10127965001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask - 4L</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10-194-100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol solution - 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>42816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pJL1-sfGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>69496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus Maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>1050121000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator and CL-18 probe with a &#8539;-inch tip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Solution (pH 8.0) - 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA from E. coli MRE 600</td>
			<td>Sigma/Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#39;-triphosphate - 100 mM</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens

Vibrio natriegens deniz bakteri için biyoteknoloji, hızlı büyüme hızı nedeniyle ortaya çıkan bir mikrobiyal konağı olarak büyük ilgi topladı vardır. Genel bir protokol natriegens V. ham hücre özleri ortak labaratuar donanımları kullanarak hazırlanması için tanımlanır. Bu yüksek verimli iletişim kuralı özellikle oldu kullanıcı erişilebilirlik için en iyi duruma getirilmiş ve düşük maliyeti. Boş hücre protein sentezi (CFPS) küçük ölçekli 10 μL toplu tepkiler bir 96 - veya 384-iyi biçimde yapılabilir ve tekrarlanarak > 260 μg/mL süper klasör GFP (sfGFP) 3 h. içinde konsantrasyonları genel olarak verimleri, ham hücre ayıklamak hazırlık ve CFPS 1−2 tam gün içinde tek bir kullanıcı tarafından elde edilebilir. Bu iletişim kuralı gelişmeler biyo-üretim ve sentetik Biyoloji uygulamaları kolaylaştırmak için protein sentezi boru hatları mevcut kolayca bütünleştirilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens at JoVE.com

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

İfade boş hücre sistemleri yüksek üretilen iş sentezi ve önemli protein testi ile taranması için maliyet-etkin ve güçlü araçlardır. Burada, Vibrio natriegens plazmid DNA, doğrusal DNA ve mRNA şablonunu kullanarak hızlı protein üretimi için kullanılan boş hücre proteini ifade sistemin hazırlanması açıklayın.

Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

Hücresiz protein ekspresyonu için protokolümüz, basit ve zaman tasarruflu iki aşamalı sonication-santrifüj işlemi kullanılarak hazırlanan hızlı büyüyen vibrio natriegens bakterisinden son derece aktif ham ekstresi kullanır. Ham hücre ekstresi hazırlama ve hücre içermeyen protein sentezi tek bir kullanıcı tarafından bir ila iki gün içinde elde edilerek bu tekniğin biyoprodüksiyon veya sentetik biyoloji uygulamaları için boru hatlarına kolayca entegre edilmesi sağlanabilir. Bir gecede Vibrio natriegens kültürünün bir mililitre yıkama başlamak için bir dakika için 10, 600 kez g bir tezgah üstü santrifüj onu santrifüj tarafından.Pelet rahatsız etmeden supernatant aspire, ve taze LB-V2 medya bir mililitre resuspend. Bir mililitre yıkanmış gece kültürünü bir litre taze LB-V2 büyüme ortamına otoklavlı dört litrelik bir otoklavlı Erlenmeyer şişesinde aşılayarak steril kapaklı bire bir seyreltme istihkakı elde edin. 225 RPM sallayarak 30 santigrat derece kültür büyümek.OD 600 kültürlerini izlemek için bir spektrofotometre kullanın. Ve 1.0 artı veya eksi 0.2'ye ulaştığında kültürü, 500 mililitrelik iki tüphalinde 3, 500 kez g'de santrifüj ederek 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca hasat edin ve sonra buza yerleştirin. Supernatant aspire ve pelet hemen işlem.Hücre lisis prosedürüne başlamadan önce serin taze hazırlanmış S30 lysis tampon pH 7.7 yaklaşık dört santigrat derece, Aynı litre kültürden kaynaklanan tüm peletleri yeniden askıya almak için bu soğuk S30 lysis tampon10 mililitre kullanın. Ve süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bu süspansiyonu 3, 500 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin ve sonra peleti bozmadan süpernatantı aspire edin ve buza yerleştirin.Soğuk bir odada çalışmak, buz üzerine yerleştirilen 50 mililitrelik tüpteki pelete 500 mikrolitre soğuk S30 lysis tamponu ekleyin. Peleti yeniden askıya almak için geniş bir pipet ucu kullanın ve dikkatlice buz üzerinde de iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Çok aktif ham özler üretmek için biz hücrelerin Üzerinde S30 tampon ile seyreltilmiş olmadığından emin olmak gerekir, ama verimli sonication için yeterli sıvı var.600 mililitrelik bir kabı buzla doldurun ve buzun üzerine iki mililitrelik bir tüp tutucu yerleştirin. Hücreleri homojenize etmek için tüpü kısa bir süre girdaplayın. Kapağın altındaki hücreleri çıkarmak için hareket ettirin ve kapağı açık tüp tutucuya yerleştirin.Tüpteki hücre süspansiyonuna alt sonicator ucu, böylece sıvı yüzeyin hemen altındadır. Sonication kurulum bir sonicator ve 1/8-inç uç çapı ile sonda kullanarak hazırlayın. Sonicator'u 20 kilohertz frekansında ve %50 genlikte ayarlayın.10 saniyelik nabız süresi ve 60 saniyelik nabız-kapama süresi. Üç döngü için darbe sonication protokolünü çalıştırın. Ve sonra 16,000 kez g'de 4 santigrat derecede 4 derecede santrifüj ham hücre ekstresi.Sonication gerçekleşir gibi görsel olarak hücre lysis incelenmesi sonication beklendiği gibi çalıştı sağlamak için önemlidir. Soğuk bir odada çalışan aliquot 50 mikrolitre yeni iki mililitrelik tüpler için ortaya çıkan supernatants pelet rahatsız değil emin olun. Flaş dondurma kAlıntılar bu ham hücre özleri bağlı bir daldırma dize ile bir tüp tutucu içine tüpler yerleştirin ve sıvı azot içeren bir dewar içine batırın ve dondurulmuş olup olmadığını kontrol edin.DNA şablonu 10X enerji çözeltisi ana karışımı, 4X amino asit ana karışımı aliquots ve oda sıcaklığında DNA şablonu kullanarak hücresiz protein ifadesi gerçekleştirmek için. Daha sonra T7 RNA polimeraz ve RNae inhibitör stoklarını eksi 20 santigrat derecelik dondurucudan çıkarın ve buza yerleştirin. DNA şablonu, 10X enerji çözeltisi ana karışımı ve 4X amino asit ana karışımı çözülür, buz üzerinde yer.Buz üzerinde iki mililitrelik bir tüp için doğru sırada her bileşeni ekleyerek bir hücre içermeyen reaksiyon ana karışımı hazırlayın ve yavaşça ana karışımı her ek sonra tüp flick. Vibrio natriegens ham hücre lisate eksi 80 derece santigrat dondurucu ve çözülene kadar 10 ila 20 dakika buz üzerinde yerleştirin çıkarın. Çözülmüş ham hücre ekstresinin uygun hacmini hücre içermeyen reaksiyon ana karışımına ekleyin ve pipet kullanarak hafifçe karıştırın.Termocycler kullanarak uç nokta hücresiz protein ekspresyonu gerçekleştirmek için, ilk olarak 96 kuyulu BIR PCR plakanın alt kısmındaki hücresiz reaksiyon ana karışımının 10 mikrolitresini ekleyin ve tüpü PCR plakasına her transfer arasında hafifçe hareket ettirerek ana karışımı karıştırın. 1, 000 kez g 10 saniye boyunca kuyu kenarlarına sıkışmış olabilir herhangi bir ana karışımı havuz için plaka santrifüj. Ve sonra buharlaşmayı önlemek için bir tabak yapıştırıcı ile kuyumühür.Plakayı, 105 santigrat derece ısıtılmış bir kapak seti ile 26 santigrat derecede bir termocycler setine yerleştirin. PCR plakasındaki reaksiyonları en az üç saat kuluçkaya yatırdıktan sonra, ifade edilen proteinler saflaştırılabilir, ölçülebilir ve akış aşağı prosesleri için kullanılabilir. Bir plaka okuyucu pipet içip kullanarak hücre içermeyen protein ekspresyonu kinetik izlemek için 10 mikrolitre hücre içermeyen reaksiyon ana karışımı net cam dipleri ile siyah 384-iyi andsay plaka altına.Ve buharlaşmayı önlemek için açık bir plaka yapıştırıcı ile kuyumühür. İfade edilen proteine karşılık gelen uygun floresan uyarma/emisyon dalga boylarını izlerken, yüz sayma plakasını 26 santigrat derece ye ayarlanmış bir plaka okuyucusuna yerleştirin ve üç ila altı saat kuluçkaya yatırın. Bu protokolde tanımlanan hücresiz ifade sistemi, plazmid DNA şablonu ile en iyi sonuçları elde ederek, uç nokta ve kinetik tahlillerle gösterilen aynı miktardan daha yüksek miktarda protein verir.in-vitro transkripsiyon reaksiyonları tarafından oluşturulan mRNA da kullanılabilir, ancak daha yüksek miktarda mRNA gereklidir. Protein üretiminin verimi magnezyum ve potasyum iyonlarının konsantrasyonundan önemli ölçüde etkilenmiştir. Optimize edilmiş koşullar altında optimal magnezyum iyon konsantrasyonu bulundu 3.5 milimolar ve potasyum iyon için, 80 milimolar.Bu nedenle, bu optimal iyon konsantrasyonlarından sapmalar, bu ifade sisteminin önemli protein verimleri üretme kapasitesinin azalmasına neden olabilir. Tüm reaktifleri buzda tutmak veya mümkün olduğunca soğuk bir odada çalışmak önemlidir. Ayrıca, uygun ve tam sonication bu protokolün başarısı için önemlidir.Bu protokolü takiben kullanıcılar proteinleri yüksek iş itfa formatında ifade etme kapasitesine sahip olacaklar, bu da birçok farklı proteinin aktivitesini arındırmak ve taramak için kullanılabilir. Bu teknik, hücresiz ifade için benzersiz özelliklere sahip yeni organizmaların kullanımını göstermektedir. Vibrio natriegens daha önce kurulmuş model organizmalarda keşfedilmemiş proteinler veya küçük moleküllerin ekspresyonu için benzersiz koşullar sunabilir bir halofilik hızlı büyüyen bakteridir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Hücre-serbest Biyoloji yapışmalı femtoliter Odası Diziler

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

Bio-memristors sümük kalıp üzerinden büyüyen bir yöntem

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Pseudomonas syringae pv Direnci yüksek-Throughput Tanımlama. Fide Sel Asası Kullanarak Domates

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...