Name: isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas at JoVE.com

Nous remercions Adam Chicoine au Brigham and Women's Human Immunology Center Flow Core pour son aide au tri cytométrique du débit. Ce travail a été soutenu par National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), et K08 AI132723 (L.G.B), et par l'American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), par le Prix de perfectionnement des facultés de la Fondation AAAAI (L.G.B.), par le Prix Steven et Judy Kaye des jeunes innovateurs (N.A.B.), par le Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), et par un don généreux de la famille Vinik (L.G.B.).

Avant de mener les expériences suivantes, assurez-vous que tous les protocoles et utilisation des soins aux animaux sont approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (CCIO) et exécutés conformément au «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8e Édition, 2011) et les directives ARRIVE. Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Brig...

<ol>
	<li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals.">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li><li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade.">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).</li><li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation.">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li><li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules.">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li><li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit.">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes.">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues.">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube.">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing.">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte.">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li><li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project,+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system.">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice.">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+16A+(TMEM16A)+is+a+Ca2+-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways.">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+Proteases:+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets.">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li><li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain.">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).</li><li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leupeptins,+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes.">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li><li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. , (2018).</li><li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2.">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li><li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells.">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li><li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123,+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor,+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion.">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li></ol>

Nous avons constaté qu'une combinaison du traitement de dispase de haut-dose pendant 40 min suivi d'un traitement court de papain (30 min) fournit un protocole optimal pour la digestion trachéale et l'isolement de cellules de brosse. Cette combinaison évite la digestion étendue et produit le rendement le plus élevé des cellules de brosse, comparéaux aux protocoles alternatifs.
Tandis que la digestion de poumon pour extraire les cellules hématopoïétiques a classiquement compté sur le...

Les cellules de brosse appartiennent à une classe de cellules épithéliales chimiosensorielles caractérisées par l'expression des récepteurs amers de goût et des machines de transduction de récepteur de goût trouvées dans les cellules de papetor de goût. Contrairement aux cellules des bourgeons gustatifs, les cellules épithéliales chimiosensorielles sont dispersées dans des surfaces épithéliales et sont appelées cellules chimiosensorielles solitaires (SCC) et cellules microvilleuses dans l'épithélium nasal1,2, cellules de brosse dans la trachée 3,4, et les cellules de touffe dans l'intestin5,6. Les cellules épithéliales exprimant les récepteurs amers de goût et les machines de transduction de goût amer se trouvent également dans l'urètre7,8 et le tube auditif9. Les cellules de brosse de voie aérienne ont des fonctions uniques dans les réponses neurogènes et immunisées de voie aérienne. Ce sont des cellules chimiosensorielles productrices d'acétylcholine qui évoquent des réflexes respiratoires protecteurs lors de l'activation avec des composés amers et des métabolites bactériens comme les substances de détection de quorum10. Les cellules de brosse de voie aérienne sont également la source épithéliale dominante de voie aérienne deLIL-25, qui règle l'inflammation de type 2 aéroallergen-obtenue dans les voies respiratoires 3.
La caractérisation de la transcriptome complète des cellules inférieures de brosse de voie aérienne et de leur réponse aux stimulus environnementaux a été limitée par leurs nombres bas dans l'épithélium trachéal et nombre très limité au-delà des grandes bronches10. Les techniques utilisées pour l'isolement des cellules chimiosensorielles de l'épithélium intestinal n'ont pas donné des nombres proportionnellement élevés de la trachée, peut-être en raison des contacts intimes des cellules trachéales de brosse avec des terminaisons nerveuses10 ou autre facteurs spécifiques aux tissus dans la muqueuse respiratoire, comme la composition des adhérents et des protéines de jonction serrées. Les rapports récents de l'isolement réussi des cellules trachéales de brosse dans des nombres plus élevés pour l'analyse de séquençage d'ARN simple de cellules ont employé une incubation de 2 h avec le papain ou une incubation de 18 h avec pronase11,12. Puisque de plus longues incubations avec des enzymes digestives peuvent diminuer la viabilité de cellules et modifier le profil transcriptionnel des cellules des tissus digérés13,ceci pourrait biaiser l'analyse comparative avec d'autres populations épithéliales chimiosensorielles.
Ici, nous rapportons une méthode pour l'isolementdes cellules trachéales de brosse pour le séquençage d'ARN 3. Le traitement de la trachée avec le dispase de haut-dose sépare l'épithélium du submucosa. La digestion ultérieure de la feuille épithéliale avec la papaine permet une excellente récupération de cette cellule structurelle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td>cat# ab5450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC anti-mouse CD326 (EpCAM)&#160; (G8.8)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#118214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC Rat IgG2a, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400511</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#422801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:345px;">Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>cat#A-11055</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Normal Goat IgG</td>
			<td style="width:101px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">cat#AB-108-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#103126</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#101320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Dispase</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">cat# 17105041&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DNase I</td>
			<td style="width:101px;">Sigma&#160;</td>
			<td>cat# 10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:345px;">HEPES-Tyrode&#8217;s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# PY-912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:345px;">Tyrode&#8217;s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter. )</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# BSS-355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# C7352</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Leupeptin trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# L2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Papain from papaya latex</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P3125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P4170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td>
			<td style="width:101px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:136px;">7902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">LSM 800 with Airyscan confocal system&#160;on a&#160;Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:136px;">647465</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Disposable equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">1.5 mL sterile tubes</td>
			<td style="width:101px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:136px;">1157C86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">14-959-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Feather Disposable Scalpel no.12</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Petri dish, 100 x 15 mm Style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sterile cell strainer, 100 &#956;m</td>
			<td style="width:101px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:136px;">cat#22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas

Les cellules trachéales de brosse sont des cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques prêtes à transmettre des signaux du lumen de voie aérienne au système immunitaire et nerveux. Ils font partie d'une famille de cellules épithéliales chimiosensorielles qui comprennent des cellules tuft dans la muqueuse intestinale, des cellules de brosse dans la trachée, et des cellules chimiosensorielles et microvilleuses solitaires dans la muqueuse nasale. Les cellules chimiosensorielles dans différents compartiments épithélial partagent des marqueurs intracellulaires clés et une signature transcriptionnelle de noyau, mais montrent également l'hétérogénéité transcriptionnelle significative, reflétant probablement l'environnement local de tissu. L'isolement des cellules trachéales de brosse des suspensions simples de cellules est exigé pour définir la fonction de ces cellules épithéliales rares en détail, mais leur isolement est provocant, potentiellement dû à l'interaction étroite entre des cellules trachéales de brosse et des terminaisons nerveuses ou en raison de la composition spécifique aux voies aériennes des jonctions serrées et adhérentes. Ici, nous décrivons une procédure pour l'isolement des cellules de brosse de l'épithélium trachéal de souris. La méthode est basée sur une séparation initiale de l'épithélium trachéal de la submucosa, permettant une incubation plus courte ultérieure de la feuille épithéliale avec du papain. Cette procédure offre une solution rapide et pratique pour le tri cytométrique de flux et l'analyse fonctionnelle des cellules viables de brosse trachéale.

Cette procédure a été mise en œuvre avecsuccès pour isoler les cellules trachéales de brosse pour le séquençage d'ARN 3. Après l'isolement de la trachée et la digestion du tissu avec un protocole en deux étapes (figure1), les cellules ont été rassemblées et tachées avec le CD45 fluorescent et l'EpCAM après exclusion des cellules mortes avec PI. Après avoir sorti les doublets en fonction des caractéristiques de diffusion vers l'avant et latérales, no...

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Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Les cellules de brosse sont les cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques rares trouvées dans la trachée naïve de souris. En raison de leur nombre limité, l'évaluation ex vivo de leur rôle fonctionnel dans l'immunité de voie aérienne et le remodelage est provocante. Nous décrivons une méthode pour l'isolement des cellules trachéales de brosse par cytométrie de flux.

Isolement et évaluation quantitative des cellules de brosse de La souris trachée

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Nous avons développé une procédure pour l’isolement des cellules trachéales de brosse, des cellules épithéliales chimiosensoryes spécialisées rares des souris fluorescentes d’acétyltransferase de choline. Cette méthode est basée sur une séparation initiale de l’épithélium trachéal de la submucosa permettant une incubation plus courte suivante de la feuille épithéliale avec la papaïne. Ceci permet la récupération robuste des cellules trachéales de brosse et a été avec succès employé pour l’isolement et l’analyse transcriptionnelle des cellules de brosse par séquençage d’ARN.Une longue incubation avec des enzymes digestives peut diminuer la viabilité cellulaire et modifier le profil transcriptionnel des cellules isolées des tissus. Ici, nous séparons l’épithélium trachéal avec le dispase et l’incuber par la suite avec de la papaïne pendant une courte période de temps produisant des rendements élevés de cellules de brosse viables. Notre méthode peut contribuer aux études de l’épithélium supérieur des voies respiratoires.Le même protocole peut être appliqué à isoler les cellules de brosse d’autres sites muqueux tels que les tissus nasaux. La démonstration de notre technique hautement reproductible permettra aux pairs scientifiques d’isoler et d’étudier plus en détail les cellules des broussailles trachées. Pour commencer cette procédure, ajouter dispase et DNase I à PBS aux concentrations finales montrées ici pour préparer la solution de digestion dispase.Assurez-vous que la poudre de dispase est complètement dissoute avant de réchauffer la solution dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 5 % de FBS inactivé par la chaleur au DMEM pour préparer une solution d’arrêt. Pour préparer le tampon Tyrode I, ajouter la papaïne et la L-cystéine à la mémoire tampon de HEPES Tyrode sans calcium.Pour préparer le tampon Tyrode II, ajouter la leupeptine au tampon de HEPES Tyrode sans calcium à une concentration de deux microlitres par millilitre. Pour préparer le tampon FACS, utilisez la solution de sel équilibré de Hank sans calcium, magnésium et phénol rouge complété par deux millimolaires EDTA et 2%FBS. Après avoir euthanasié la souris, utilisez des aiguilles de calibre 21 pour la fixer sur une planche chirurgicale en position supine avec des extrémités supérieures et inférieures étendues.Vaporiser la fourrure de 70 % d’éthanol pour assainir la région. À l’aide de forceps droits, soulevez la peau et la fourrure de l’abdomen et utilisez des ciseaux disséquants pour faire une incision au centre. À l’aide des ciseaux, séparer la peau du tissu sous-cutané de l’abdomen à la mandibula.Tout en tenant le tissu sous-cutané avec les forceps, faire une petite incision avec les ciseaux au centre de la paroi abdominale. Ensuite, ouvrez le péritoine avec une incision en forme de V. À l’aide des forceps, déplacez doucement l’intestin grêle sur le côté.Localiser l’aorte abdominale et le véna cava et faire une incision avec les ciseaux disséquants pour permettre une exsanguination rapide. Localiser le diaphragme. À l’aide d’une aiguille de calibre 18, faire une ouverture dans le diaphragme juste en dessous du sternum pour dégonfler les poumons.À l’aide de ciseaux pointus et pointus disséquants, couper le long de la base des côtes pour séparer soigneusement le diaphragme de la cage thoracique. Utilisez les forceps pour soulever l’extrémité exposée du sternum et couper le sternum longitudilement de la base de la cage thoracique au cou. Utilisez de courts ciseaux droits pour faire une incision cervicale centrale et séparer les deux lobes de la glande submandibulaire.Après cela, utilisez une paire de forceps de haute précision point fin pour enlever soigneusement le tissu conjonctif environnant et le thymus au-dessus de la carina. Disséquer la trachée libre en séparant d’abord l’extrémité proximale au niveau de l’épiglotte, puis en disséquant l’extrémité distale au niveau de la bifurcation de la trachée. Localiser l’épiglotte et couper la trachée longituditinement de l’épiglotte à la carina.Pour commencer, placez la trachée dans un tube de 1,5 millilitre contenant 750 microlitres de solution de digestion dispase préchauffé à 37 degrés Celsius. Couvrir le tube de papier d’aluminium pour réduire l’exposition à la lumière directe et incuber sur un shaker à 200 RPM et à température ambiante pendant 40 minutes. Ajouter ensuite 750 microlitres de DMEM avec 5% de FBS pour arrêter la réaction et placer le tube sur la glace.Transférer la trachée dans une boîte de Pétri. Orientez la trachée avec le côté épithélial face vers le haut. La trachée longitudicieusement disséquée a une forme semi-cylindrique maintenue par les anneaux cartilagineux.L’épithélium est sur la surface concave. À l’aide de forceps droits, attachez la zone épiglotte de la trachée à la boîte de Pétri et utilisez un scalpel d’élimination de taille 22 pour gratter l’épithélium de la trachée. La couche épithéliale se séparera sous forme de feuille translucide.Utilisez le scalpel pour émincer l’épithélium et transférer la couche épithéliale dans un tube de deux millilitres. Rincez la boîte de Pétri avec 750 microlitres de tampon Tyrode I et transférez-la dans le tube contenant la couche épithéliale. Couvrir le tube de papier d’aluminium pour réduire l’exposition à la lumière directe et incuber à 37 degrés Celsius sur un shaker à 200 RPM pendant 30 minutes.Ajouter ensuite 750 microlitres de tampon tyrode II froid. Vortex le tissu digéré vigoureusement pendant 20 à 30 secondes. À l’aide d’une seringue fixée à une aiguille de calibre 18, triturer l’homogénéité 10 fois.Après cela, passer à une aiguille de calibre 21 et triturer 10 à 20 fois de plus. Filtrer les cellules à travers une passoire de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter le tampon FACS froid à un rapport volumétrique de 30 pour un.Centrifugeuse à 350 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans le tampon FACS froid. Transférer cette suspension dans un tube de polystyrène de 12 par 75 millimètres.Centrifugeuse à nouveau à 350 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 100 microlitres de tampon FACS. Ensuite, ajoutez un microlitre d’anticorps anti-souris CD1632 bloquant pour bloquer la liaison non spécifique et incuber sur la glace pendant 15 minutes.Ajoutez ensuite des anticorps dans les contrôles d’isotype respectifs tels que décrits dans le protocole de texte. Incuber sur la glace pendant 45 minutes tout en étant protégé de la lumière directe. Après cela, ajouter 4,5 millilitres de tampon FACS froid et mélanger.Centrifugeuse à 350 fois g et à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 300 microlitres de tampon FACS froid. Ajouter l’iodure de propidium immédiatement avant le tri cytométrique d’écoulement.Dans cette étude, les cellules trachéales de brosse de ChAT eGFP souris fluorescentes de reporter d’acétylcholine sont avec succès isolées pour le séquençage d’ARN. Les cellules sont identifiées à partir de débris par angle de dispersion avant et latéral. Les doublets sont exclus en utilisant la hauteur et la largeur de dispersion avant et la hauteur et la largeur latérales de dispersion.Les doublets sont les cellules qui ont des valeurs de largeur élevées. Dans les cellules individuelles, les cellules vivantes sont identifiées comme la population qui est propidium iodure négatif. Dans les cellules individuelles vivantes, les cellules faibles à négatives CD45 sont identifiées en fonction du contrôle de l’isotype.Dans les cellules à faible négatif CD45, les cellules positives EpCAM qui sont également positives eGFP dans le canal FITC sont la population de cellules de brosse. Les nombres de cellules de broussailles sont modifiés par l’exposition aux métabolites microbiens et aux protozoaires et reflètent donc la variabilité du microbiote institutionnel. Par conséquent, nous suggérons d’estimer le nombre de cellules de brosse par microscopie de fluorescence pour évaluer le nombre prévu de cellules isolées de brosse par le tri cytométrique d’écoulement.Assurez-vous de bien séparer la couche épithéliale de la trachée car elle détermine les rendements des cellules de brosse isolées. Les cellules isolées de brosse trachéale peuvent être employées dans un large éventail d’analyses telles que le séquençage d’ARN, la culture cellulaire et l’analyse fonctionnelle.

Research

JoVE Journal

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