Name: isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas at JoVE.com

Ringraziamo Adam Chicoine al Brigham and Women's Human Immunology Center Flow Core per il suo aiuto con lo smistamento citometrico del flusso. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), e K08 AI132723 (L.G.B), e dall'American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), del Premio AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), dello Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), del Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), e di un generosa donazione da parte della famiglia Vinik (L.G.B.).

Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che tutti gli usi e i protocolli per la cura degli animali siano approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e siano eseguiti in accordo con la "Guida per la cura e l'uso di Laboratory Animals" (8a edizione 2011) e le linee guida DI ARRIVE. Tutte le procedure descritte di seguito sono state riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Brigham and Women's Hospital.
<p ...

<ol>
	<li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals.">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li><li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade.">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).</li><li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation.">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li><li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules.">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li><li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit.">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes.">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues.">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube.">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing.">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte.">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li><li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project,+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system.">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice.">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+16A+(TMEM16A)+is+a+Ca2+-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways.">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+Proteases:+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets.">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li><li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain.">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).</li><li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leupeptins,+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes.">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li><li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. , (2018).</li><li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2.">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li><li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells.">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li><li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123,+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor,+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion.">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li></ol>

Abbiamo scoperto che una combinazione di trattamento dispase ad alta dose per 40 min seguita da un breve trattamento papaina (30 min) fornisce un protocollo ottimale per la digestione tracheale e l'isolamento delle cellule pennello. Questa combinazione evita una digestione estesa e produce la massima resa di celle pennello, rispetto ai protocolli alternativi.
Mentre la digestione polmonare per estrarre le cellule ematopoietiche ha classicamente invocato enzimi digestivi lievi come collagenae I...

Le cellule pennello appartengono a una classe di cellule epiteliali chemiosensoriali caratterizzate dall'espressione di recettori del gusto amaro e dal meccanismo di trasduzione del recettore del gusto presente nelle cellule delle papille gustative. A differenza delle cellule epiteliali chemiosensoriali, le cellule epiteliali chemiosensoriali sono sparse in superfici epiteliali e sono indicate come cellule chemiosensoriali solitarie (SCC) e cellule microvinili nell'epitelio nasale1,2, cellule pennello nel trachea 3,4, e cellule di ciuffo nell'intestino5,6. Le cellule epiteliali che esprimono recettori del gusto amaro eil meccanismo di trasduzione amara si trovano anche nell'uretra 7,8 e nel tubo uditivo9. Le cellule pennello delle vie aeree hanno funzioni uniche nelle risposte neurogeniche e immunitarie delle vie aeree. Sono cellule chemiosensoriali che producono acetilcolina che evocano riflessi respiratori protettivi dopo l'attivazione con composti amari e metaboliti batterici come sostanze di quorum-sensing10. Le cellule pennello delle vie aeree sono anche la fonte epiteliale delle vie aeree di IL-25, che regola l'infiammazione di tipo 2 aeroallergened nelle vie respiratorie3.
La caratterizzazione del trascrittoma completo delle cellule pennello delle vie aeree inferiori e la loro risposta agli stimoli ambientali è stata limitata dal loro basso numero nell'epitelio tracheale e da un numero molto limitato oltre il grande bronchi10. Le tecniche utilizzate per l'isolamento delle cellule chemiosensoriali dall'epitelio intestinale non hanno prodotto numeri proporzionalmente elevati dalla trachea, probabilmente a causa dei contatti intimi delle cellule pennello tracheale con terminazioni nervose10 o altro fattori specifici del tessuto nella mucosa respiratoria come la composizione di aderesi e proteine di giunzione strette. Recenti rapporti di isolamento riuscito delle cellule pennello tracheale in numero maggiore per l'analisi di sequenziamento di RNA a singola cellula hanno impiegato un'incubazione di 2 h con papaina o un'incubazione di 18 h con prosiano11,12. Poiché incubazioni più lunghe con enzimi digestivi possono diminuire la vitalità cellulare e alterare il profilo trascrizionale delle cellule dai tessuti digeriti13, questo potrebbe bias comparativa analisi con altre popolazioni epiteliali chemiosensoriali.
Qui, segnaliamo un metodo per l'isolamento delle cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell'RNA3. Il trattamento della trachea con dispase ad alto dosaggio separa l'epitelio dalla submucosa. La successiva digestione del foglio epiteliale con papaina consente un eccellente recupero di questa cellula strutturale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td>cat# ab5450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC anti-mouse CD326 (EpCAM)&#160; (G8.8)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#118214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC Rat IgG2a, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400511</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#422801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:345px;">Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>cat#A-11055</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Normal Goat IgG</td>
			<td style="width:101px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">cat#AB-108-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#103126</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#101320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Dispase</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">cat# 17105041&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DNase I</td>
			<td style="width:101px;">Sigma&#160;</td>
			<td>cat# 10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:345px;">HEPES-Tyrode&#8217;s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# PY-912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:345px;">Tyrode&#8217;s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter. )</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# BSS-355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# C7352</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Leupeptin trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# L2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Papain from papaya latex</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P3125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P4170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td>
			<td style="width:101px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:136px;">7902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">LSM 800 with Airyscan confocal system&#160;on a&#160;Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:136px;">647465</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Disposable equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">1.5 mL sterile tubes</td>
			<td style="width:101px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:136px;">1157C86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">14-959-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Feather Disposable Scalpel no.12</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Petri dish, 100 x 15 mm Style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sterile cell strainer, 100 &#956;m</td>
			<td style="width:101px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:136px;">cat#22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas

Le cellule pennello tracheali sono cellule epiteliali colinergiche pronte a trasmettere segnali dal lume delle vie aeree al sistema immunitario e nervoso. Fanno parte di una famiglia di cellule epiteliali chemiosensoriali che includono cellule del ciuffo nella mucosa intestinale, cellule pennello nella trachea, e cellule chemiosensoriali solitarie e microvillous nella mucosa nasale. Le cellule chemiosensoriali in diversi compartimenti epiteliali condividono marcatori intracellulari chiave e una firma trascrizionale di base, ma mostrano anche una significativa eterogeneità trascrizionale, probabilmente riflettente dell'ambiente del tessuto locale. L'isolamento delle cellule del pennello tracheale dalle sospensioni a cella singola è necessario per definire in dettaglio la funzione di queste rare cellule epiteliali, ma il loro isolamento è impegnativo, potenzialmente a causa della stretta interazione tra le cellule del pennello tracheale e le terminazioni nervose o a causa della composizione specifica delle vie aeree di giunzioni strette e aderenti. Qui, descriviamo una procedura per l'isolamento delle cellule pennello dall'epitelio tracheale del topo. Il metodo si basa su una separazione iniziale dell'epitelio tracheale dalla sottomucosa, consentendo una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Questa procedura offre una soluzione rapida e conveniente per lo smistamento citometrico del flusso e l'analisi funzionale delle cellule pennello tracheale vitali.

Questa procedura è stata implementata con successo per isolare le cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell'RNA3. Dopo l'isolamento della trachea e la digestione del tessuto con un protocollo in 2 fasi (Figura 1), le cellule sono state raccolte e macchiate con CD45 ed EpCAM con etichettaflua fluorescente dopo l'esclusione delle cellule morte con PI. Dopo aver creato doppietti in base alle caratteristiche di dispersione in avanti e laterale, abbiamo de...

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Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Le cellule pennello sono rare cellule epiteliali colinergiche chesidiche che si trovano nella trachea del topo ingenuo. A causa del loro numero limitato, la valutazione ex vivo del loro ruolo funzionale nell'immunità e nel rimodellamento delle vie aeree è impegnativa. Descriviamo un metodo per l'isolamento delle cellule del pennello tracheale dalla citometria di flusso.

Isolamento e valutazione quantitativa delle celle pennello dalle trachea del topo

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Abbiamo sviluppato una procedura per l'isolamento delle cellule a pennello tracheali, rare cellule epiteliali chemiosenoriali specializzate da topi reporter fluorescenti acetiltransferasi colina. Questo metodo si basa su una separazione iniziale dell'epitelio tracheale dalla sottomucosa che consente una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Ciò consente un robusto recupero delle celle a pennello tracheale ed è stato utilizzato con successo per l'isolamento e l'analisi trascrizionale delle cellule pennello mediante sequenziamento dell'RNA.La lunga incubazione con enzimi digestivi può ridurre la vitalità cellulare e alterare il profilo trascrizionale delle cellule isolate dai tessuti. Qui separiamo l'epitelio tracheale con la dispasi e successivamente lo incubamo con la papaina per un breve periodo di tempo producendo alte rese di cellule di pennello vitali. Il nostro metodo può contribuire agli studi sull'epitelio delle vie aeree superiori.Lo stesso protocollo può essere applicato all'isolamento delle cellule pennello da altri siti mucosi come il tessuto nasale. La dimostrazione della nostra tecnica altamente riproducibile consentirà agli scienziati pari di isolare e indagare ulteriormente le cellule del pennello tracheale. Per iniziare questa procedura, aggiungere la dispasi e la DNasi I al PBS alle concentrazioni finali qui mostrate per preparare la soluzione di digestione della dispasi.Assicurarsi che la polvere dispasi sia completamente sciolta prima di riscaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere quindi FBS inattivato al 5% a DMEM per preparare una soluzione di arresto. Per preparare il tampone Tyrode I, aggiungere papaina e L-cisteina al tampone di HEPES Tyrode senza calcio.Per preparare il tampone Tyrode II, aggiungere la leupeptina al tampone di HEPES Tyrode senza calcio ad una concentrazione di due microlitri per millilitro. Per preparare il tampone FACS, utilizzare la soluzione di sale bilanciato di Hank senza calcio, magnesio e rosso fenolo integrata con due EDTA millimolare e 2%FBS. Dopo aver eutanasiato il mouse, utilizzare aghi calibro 21 per fissarlo su una scheda chirurgica in posizione supina con estremità superiore e inferiore estese.Spruzzare la pelliccia con il 70% di etanolo per sanificare l'area. Usando le forcette dritte, sollevare la pelle e la pelliccia dell'addome e utilizzare forbici sezionanti per fare un'incisione al centro. Usando le forbici, separare la pelle dal tessuto sottocutaneo dall'addome alla mandibula.Tenendo il tessuto sottocutaneo con le forcep, fare una piccola incisione con le forbici al centro della parete addominale. Quindi aprire il peritoneo con un'incisione a forma di V. Usando le forcep, spostare delicatamente l'intestino tenue di lato.Individuare l'aorta addominale e la vena cava e fare un'incisione con le forbici dissezionanti per consentire una rapida dissanguamento. Individuare il diaframma. Usando un ago calibro 18, fai un'apertura nel diaframma appena sotto lo sterno per sgonfiare i polmoni.Utilizzando forbici dritte affilate, tagliare lungo la base delle costole per separare accuratamente il diaframma dalla gabbia toracica. Utilizzare le forcep per sollevare l'estremità esposta dello sterno e tagliare lo sterno longitudinalmente dalla base della gabbia toracica al collo. Utilizzare forbici corte dritte per fare un'incisione cervicale centrale e separare i due lobi della ghiandola sottomandibolare.Successivamente, utilizzare un paio di forcelle ad alta precisione a punto fine per rimuovere con cura il tessuto connettivo circostante e il timo sovrascrivono la carena. Sezionare la trachea libera separando prima l'estremità prossimale a livello dell'epiglottide e poi sezionando l'estremità distale a livello della biforcazione della trachea. Individuare l'epiglottide e tagliare la trachea longitudinalmente dall'epiglottide alla carena.Per iniziare, posizionare la trachea in un tubo da 1,5 millilitri contenente 750 microlitri di soluzione di digestione della dispasi pre-riscaldati a 37 gradi Celsius. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta e incubare su uno shaker a 200 giri/min e a temperatura ambiente per 40 minuti. Quindi aggiungere 750 microlitri di DMEM con 5%FBS per interrompere la reazione e posizionare il tubo sul ghiaccio.Trasferire la trachea in una piastra di Petri. Orientare la trachea con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. La trachea sezionata longitudinalmente ha una forma semicilindrica mantenuta dagli anelli cartilaginei.L'epitelio si trova sulla superficie concava. Utilizzando le forcette dritte, incollare l'area dell'epiglottide della trachea alla piastra di Petri e utilizzare un bisturi di smaltimento di dimensioni 22 per raschiare l'epitelio dalla trachea. Lo strato epiteliale si separerà come foglio traslucido.Utilizzare il bisturi per tritare l'epitelio e trasferire lo strato epiteliale in un tubo da due millilitri. Risciacquare la piastra di Petri con 750 microlitri di tampone Tyrode I e trasferirlo nel tubo contenente lo strato epiteliale. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta e incubare a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri/min per 30 minuti.Quindi aggiungere 750 microlitri di tampone Tyrode II freddo. Vortice vigorosamente il tessuto digerito per 20-30 secondi. Utilizzando una siringa attaccata a un ago calibro 18, triturare l'omogeneato 10 volte.Successivamente, passare a un ago calibro 21 e triturare da 10 a 20 volte in più. Filtrare le celle attraverso un colino da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere il buffer FACS freddo con un rapporto volumetrico di 30 a uno.Centrifuga a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet nel tampone FACS freddo. Trasferire questa sospensione su un tubo di polistirolo da 12 per 75 millimetri.Centrifugare di nuovo a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Aggiungere quindi un microlitro di anticorpo bloccante CD1632 anti-mouse per bloccare il legame non specifico e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.Quindi aggiungere anticorpi nei rispettivi controlli isotipo come delineato nel protocollo di testo. Incubare sul ghiaccio per 45 minuti mentre è protetto dalla luce diretta. Dopo questo, aggiungere 4,5 millilitri di tampone FACS freddo e mescolare.Centrifuga a 350 volte g e a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 300 microlitri di tampone FACS freddo. Aggiungere lo ioduro di propidio immediatamente prima dell'ordinamento citometrico del flusso.In questo studio, le cellule a pennello tracheali dei topi reporter fluorescenti acetilcolina ChAT eGFP sono isolate con successo per il sequenziamento dell'RNA. Le cellule sono identificate dai detriti dall'angolo di dispersione avanti e laterale. I doppietti sono esclusi utilizzando l'altezza e la larghezza di dispersione in avanti e l'altezza e la larghezza della dispersione laterale.I doppietti sono le celle con valori di larghezza elevata. All'interno delle singole cellule, le cellule vive sono identificate come la popolazione che è propidio ioduro negativo. All'interno delle singole cellule vive, le cellule da basse a negative del CD45 sono identificate in base al controllo dell'isotipo.All'interno delle cellule negative basse CD45, le cellule positive EpCAM che sono anche eGFP positive nel canale FITC sono la popolazione di cellule pennello. I numeri delle cellule spazzolate sono alterati dall'esposizione a metaboliti microbici e protozoi e quindi riflettono la variabilità del microbiota istituzionale. Pertanto, suggeriamo di stimare il numero di celle a pennello mediante microscopia a fluorescenza per misurare il numero previsto di celle di pennello isolate mediante smistamento citometrico del flusso.Assicurarsi di separare correttamente lo strato epiteliale della trachea in quanto determina le rese delle cellule di pennello isolate. Le celle a pennello tracheale isolate possono essere utilizzate in un'ampia gamma di saggi come il sequenziamento dell'RNA, la coltura cellulare e l'analisi funzionale.

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