Name: isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas at JoVE.com

Vi takker Adam Chicoine ved Brigham og Women ' s Human immunologi Center Flow Core for hans hjelp med flyt analytiske sortering. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), og K08 AI132723 (L. G. B), og ved American Academy av allergi, astma, og immunologi (AAAAI)/American lunge allergisk Åndedretts sykdom Award (N.A.B.), av AAAAI Foundation fakultet Development Award (L.G.B.), av Steven og Judy Kaye Young innovatører Award (N.A.B.), av Joycelyn C. Austen Fund for karriereutvikling av kvinner lege forskere (L.G.B.), og av en sjenerøs donasjon av Vinik familien (L.G.B.).

Før du gjennomfører følgende eksperimenter, må du sørge for at alle dyr pleie bruk og protokoller er godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) og utført i samsvar med National Research Council ' s "guide for omsorg og bruk av Forsøksdyr " (8th Edition, 2011) og kommer retningslinjene. Alle prosedyrene som er beskrevet nedenfor, er gjennomgått og godkjent av den institusjonelle dyre omsorgen og bruks komitéen ved Brigham and Women ' s Hospital.
<p class="jov...

<ol>
	<li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals.">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li><li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade.">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).</li><li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation.">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li><li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules.">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li><li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit.">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes.">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues.">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube.">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing.">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte.">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li><li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project,+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system.">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice.">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+16A+(TMEM16A)+is+a+Ca2+-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways.">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+Proteases:+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets.">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li><li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain.">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).</li><li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leupeptins,+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes.">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li><li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. , (2018).</li><li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2.">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li><li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells.">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li><li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123,+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor,+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion.">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li></ol>

Vi fant at en kombinasjon av høy dose dispase behandling for 40 min etterfulgt av en kort Papain behandling (30 min) gir en optimal protokoll for tracheal fordøyelsen og pensel celle isolasjon. Denne kombinasjonen unngår omfattende fordøyelsen og gir den høyeste avkastningen av pensel celler, sammenlignet med alternative protokoller.
Mens lunge fordøyelsen å trekke blodkreft celler har klassisk lettelse på milde fordøyelsesenzymer som kollagenase IV15, isolasjo...

Brush celler tilhører en klasse av chemosensory epitelceller karakterisert ved uttrykk for bitter smak reseptorer og smaken reseptoren Transduction maskiner som finnes i smak knopp celler. I motsetning til smak knopp celler, er chemosensory epitelceller spredt i epitel overflater og er referert til som enslig chemosensory celler (SCCs) og microvillous celler i nese epitel1,2, pensel celler i luftrøret 3,4, og tuft celler i tarmen5,6. Epitelceller uttrykker bitter smak reseptorer og bitter smak Transduction maskiner er også funnet i urinrøret7,8 og hørbar tube9. Luftveis pensel celler har unike funksjoner i neurogenic og immun luftveis responser. De er acetylkolin-produserende chemosensory celler som fremkalle beskyttende åndedretts reflekser ved aktivering med bitre forbindelser og bakterielle metabolitter som quorum-sensing stoffer10. Luftveis pensel celler er også den dominerende luftveisepitel kilden til IL-25, som regulerer aeroallergen-elicited type 2 betennelse i luftveiene3.
Karakterisering av full transcriptome av nedre luftveis pensel celler og deres reaksjon på miljømessige stimuli er begrenset av deres lave tall i tracheal epitel og svært begrenset tall utover den store bronkiene10. Teknikker som brukes for isolering av chemosensory celler fra tarm epitel har ikke gitt proporsjonalt høye tall fra luftrøret, muligens på grunn av intime kontakter av tracheal pensel celler med nerve avslutninger10 eller andre vev-spesifikke faktorer i luftveiene mucosa som sammensetningen av adherens og tette veikryss proteiner. Nylige rapporter om vellykket isolering av tracheal pensel celler i høyere tall for enkelt celle RNA sekvensering analyse ansatt enten en 2 h inkubasjons med Papain eller en 18 h inkubasjons med pronase11,12. Siden lengre incubations med fordøyelsesenzymer kan redusere celle levedyktighet og endre transcriptional profil av celler fra fordøyd vev13, dette kan bias sammenlignende analyse med andre chemosensory epitel populasjoner.
Her rapporterer vi en metode for isolering av tracheal pensel celler for RNA sekvensering3. Behandling av luftrøret med høy dose dispase skiller epitel fra submukosa. Senere fordøyelse av epitel arket med Papain gir utmerket utvinning av denne strukturelle cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td>cat# ab5450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC anti-mouse CD326 (EpCAM)&#160; (G8.8)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#118214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC Rat IgG2a, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400511</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#422801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:345px;">Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>cat#A-11055</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Normal Goat IgG</td>
			<td style="width:101px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">cat#AB-108-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#103126</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#101320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Dispase</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">cat# 17105041&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DNase I</td>
			<td style="width:101px;">Sigma&#160;</td>
			<td>cat# 10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:345px;">HEPES-Tyrode&#8217;s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# PY-912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:345px;">Tyrode&#8217;s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter. )</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# BSS-355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# C7352</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Leupeptin trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# L2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Papain from papaya latex</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P3125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P4170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td>
			<td style="width:101px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:136px;">7902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">LSM 800 with Airyscan confocal system&#160;on a&#160;Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:136px;">647465</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Disposable equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">1.5 mL sterile tubes</td>
			<td style="width:101px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:136px;">1157C86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">14-959-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Feather Disposable Scalpel no.12</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Petri dish, 100 x 15 mm Style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sterile cell strainer, 100 &#956;m</td>
			<td style="width:101px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:136px;">cat#22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas

Tracheal pensel celler er kolinerge chemosensory epitelceller klar til å overføre signaler fra luftveiene lumen til immun-og nervesystemet. De er en del av en familie av chemosensory epitelceller som inkluderer tuft celler i tarmslimhinnen, pensel celler i luftrøret, og ensom chemosensory og microvillous celler i neseslimhinnen. Chemosensory celler i forskjellige epitel rom dele nøkkel intracellulære markører og en kjerne transcriptional signatur, men også vise betydelige transcriptional heterogenitet, sannsynligvis reflektert i det lokale vevet miljøet. Isolering av tracheal pensel celler fra enkelt celle suspensjoner er nødvendig for å definere funksjonen til disse sjeldne epitelceller i detalj, men deres isolasjon er utfordrende, potensielt på grunn av tett samspill mellom tracheal pensel celler og nerve avslutninger eller på grunn av luftveis spesifikk sammensetning av stramme og adherens knutepunkter. Her beskriver vi en prosedyre for isolering av pensel celler fra mus tracheal epitel. Metoden er basert på en innledende separasjon av tracheal epitel fra submukosa, noe som åpner for en etterfølgende kortere inkubasjons av epitel arket med Papain. Denne prosedyren tilbyr en rask og praktisk løsning for flyt analytiske sortering og funksjonell analyse av levedyktige tracheal pensel celler.

Denne prosedyren er implementert for å isolere tracheal pensel celler for RNA-sekvensering3. Etter isolering av luftrøret og fordøyelsen av vevet med en 2-trinns protokoll (figur 1), ble celler samlet og farget med fluorescensmerkete-merket CD45 og EpCAM etter utelukkelse av døde celler med PI. Etter gating ut doublets basert på fremover og side scatter egenskaper, definerte vi pensel celler som lav/negativ for CD45, positiv for EpCAM og positiv for eGFP (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas at JoVE.com

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Pensel celler er sjeldne kolinerge chemosensory epitelceller funnet i naiv mus luftrøret. På grunn av sine begrensede tall, er ex vivo evaluering av deres funksjonelle rolle i luftveiene immunitet og remodeling utfordrende. Vi beskriver en metode for isolering av tracheal pensel celler ved flyt flowcytometri.

Isolasjon og kvantitativ evaluering av Brush celler fra mus Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Vi utviklet en prosedyre for isolering av trakeal børsteceller, sjeldne spesialiserte kjemosensoriske epitelceller fra kolin acetyltransferase fluorescerende reporter mus. Denne metoden er basert på en innledende separasjon av trakeal epitel fra submucosa som tillater en påfølgende kortere inkubasjon av epitelarket med papain. Dette gir robust gjenvinning av trakeal børsteceller og har blitt brukt til isolasjon og transkripsjonsanalyse av penselceller ved RNA-sekvensering.Lang inkubasjon med fordøyelsesenzymer kan redusere celle levedyktigheten og endre transkripsjonsprofilen til celler isolert fra vev. Her skiller vi trakeal epitelet med dispase og inkuberer det deretter med papain i kort tid som produserer høye utbytter av levedyktige børsteceller. Vår metode kan bidra til studier av øvre luftveisepitel.Den samme protokollen kan brukes til å isolere penselceller fra andre slimhinnesteder som nesevev. Demonstrasjon av vår svært reproduserbare teknikk vil tillate peer forskere å isolere og undersøke trakeal børsteceller ytterligere. For å begynne denne prosedyren, legg dispase og DNase I til PBS ved de endelige konsentrasjonene som vises her for å forberede den dispase fordøyelsesløsningen.Pass på at dispasepulveret er fullstendig oppløst før du varmer opp oppløsningen i et vannbad ved 37 grader Celsius. Deretter legger du til 5 % varmeaktivert FBS til DMEM for å lage en stoppeløsning. For å forberede Tyrode I-bufferen, tilsett papain og L-cystein til HEPES Tyrodes buffer uten kalsium.For å klargjøre Tyrode II-bufferen, tilsett leupeptin til HEPES Tyrodes buffer uten kalsium i en konsentrasjon på to mikroliter per milliliter. For å forberede FACS-bufferen, bruk Hanks balanserte saltløsning uten kalsium, magnesium og fenolrød supplert med to millimolar EDTA og 2%FBS. Etter euthanizing musen, bruk 21 gauge nåler for å fikse det på et kirurgisk bord i liggende stilling med utvidede øvre og nedre ekstremiteter.Spray pelsen med 70% etanol for å rense området. Bruk rette tang, løft huden og pelsen i magen og bruk dissekering saks for å gjøre et snitt i midten. Ved hjelp av saksen, skille huden fra det subkutane vevet fra magen til mandibula.Mens du holder det subkutane vevet opp med tangene, gjør et lite snitt med saksen i midten av bukveggen. Deretter åpner du bukhinnen med et V-formet snitt. Bruk tangen til å forsiktig flytte tynntarmen til siden.Finn abdominal aorta og vena cava og gjør et snitt med disseksjon saks for å tillate rask exsanguination. Finn membranen. Bruk en 18 gauge nål, gjør en åpning i membranen like under brystbenet for å deflate lungene.Ved hjelp av skarp spiss rett dissekering saks, kutt langs bunnen av ribbeina for å forsiktig skille membranen fra brystkassen. Bruk tangen til å løfte den eksponerte enden av brystbenet og kutte brystbenet langsgående fra bunnen av brystkassen til nakken. Bruk kort rett saks for å lage et sentralt cervical snitt og skille de to fliker av submandibulær kjertel.Etter dette, bruk et par fine punkt høy presisjon tang for å forsiktig fjerne det omkringliggende bindevevet og thymus overliggende carina. Dissekere luftrøret gratis ved først å skille den proksimale enden på nivået av epiglottis og deretter dissekere den distale enden på nivået av bifurcation av luftrøret. Finn epiglottis og kutte luftrøret langsgående fra epiglottis til carina.Til å begynne med, legg luftrøret i et 1,5 milliliter rør som inneholder 750 mikroliter dispase fordøyelsesløsning forhåndsvarmet til 37 grader Celsius. Dekk røret med aluminiumsfolie for å redusere eksponeringen for direkte lys og inkubere på en shaker ved 200 RPM og ved romtemperatur i 40 minutter. Tilsett deretter 750 mikroliter DMEM med 5% FBS for å stoppe reaksjonen og plassere røret på is.Overfør luftrøret til en petriskål. Orienter luftrøret med epitelsiden vendt opp. Den langsgående dissekerte luftrøret har en semi-sylindrisk form som vedlikeholdes av bruskvævringene.Epitelet er på den konkave overflaten. Bruk rette tang, tether epiglottis området av luftrøret til Petri parabolen og bruke en størrelse 22 avhending skalpell for å skrape epitelet av luftrøret. Epitellaget vil skilles som et gjennomsiktig ark.Bruk skalpellen til å hakke epitelet og overføre epitellaget til et to milliliter rør. Skyll petriskålen med 750 mikroliter tyrode I-buffer og overfør dette til røret som inneholder epitellaget. Dekk røret med aluminiumsfolie for å redusere eksponeringen for direkte lys og inkuber ved 37 grader Celsius på en shaker ved 200 RPM i 30 minutter.Tilsett deretter 750 mikroliter kald Tyrode II-buffer. Vortex det fordøyde vevet kraftig i 20 til 30 sekunder. Bruk en sprøyte festet til en 18 gauge nål, triturate homogenatet 10 ganger.Etter dette bytter du til en 21 gauge nål og triturate 10 til 20 flere ganger. Filtrer cellene gjennom en 100 mikrometersil i et 50 milliliter konisk rør. Legg til kald FACS-buffer med et volumetrisk forhold på 30 til én.Sentrifuge på 350 ganger g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i kald FACS buffer. Overfør denne suspensjonen til et 12 med 75 millimeter polystyrenrør.Sentrifuge igjen på 350 ganger g og på fire grader Celsius i 10 minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 100 mikroliter facs buffer. Deretter legger du til en mikroliter anti-mus CD1632 blokkerende antistoff for å blokkere ikke-spesifikk binding og inkubere på is i 15 minutter.Legg deretter til antistoffer i de respektive isotypekontrollene som beskrevet i tekstprotokollen. Inkuber på is i 45 minutter mens den er beskyttet mot direkte lys. Etter dette legger du til 4,5 milliliter kald FACS-buffer og bland.Sentrifuge på 350 ganger g og ved fire grader Celsius. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 300 mikroliter kald FACS buffer. Tilsett propidiumjodid umiddelbart før strømning cytometrisk sortering.I denne studien er trakealbørsteceller fra ChAT eGFP acetylkolin fluorescerende reportermus vellykket isolert for RNA-sekvensering. Celler identifiseres fra rusk av fremover og side scatter vinkel. Doublets er utelukket ved hjelp av fremover scatter høyde og bredde og side scatter høyde og bredde.Doublets er cellene som har høy bredde verdier. Innenfor enkeltcellene identifiseres de levende cellene som populasjonen som er propidiumjodid negativ. I de levende enkeltcellene identifiseres CD45-filen med lav til negative celler basert på isotypekontrollen.Innenfor CD45 lave negative celler er EpCAM-positive celler som også er eGFP-positive i FITC-kanalen populasjonen av penselceller. Penselcellenumrene endres ved eksponering for mikrobielle metabolitter og protozoer og reflekterer derfor variasjonen til institusjonell mikrobiota. Derfor vil vi foreslå å estimere antall penselceller ved fluorescensmikroskopi for å måle det forventede antallet isolerte penselceller ved flytcytokmetrisk sortering.Pass på å skille epitellaget i luftrøret riktig, da det bestemmer utbyttet av isolerte penselceller. De isolerte trakealbørstecellene kan brukes i et bredt spekter av analyser som RNA-sekvensering, cellekultur og funksjonell analyse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Mouse Lung dendrittiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering og karakterisering av dendrittiske celler og makrofager fra musen Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ vurdering av Cell Migration ved Phagokinetic Track Motilitet Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av Lymfocytter fra Mouse kjønnsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolering av Double Negative αβ T celler fra nyre

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Avledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Fra Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolering av Sertoli celler og Peritubular Celler fra Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...