Name: isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas at JoVE.com

Agradecemos a Adam Chicoine en el Centro de Inmunología Humana de Brigham and Women's Flow Core por su ayuda con la clasificación citométrica de flujo. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones sanitarias R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), y K08 AI132723 (L.G.B), y por la Academia Estadounidense de Alergia, Asma e Inmunología (AAAAI) / Alergia Pulmonar Americana Premio a la Enfermedad Respiratoria (N.A.B.), por el Premio de Desarrollo Docente de la Fundación AAAAI (L.G.B.), por el Premio Steven y Judy Kaye Young Innovators (N.A.B.), por el Fondo Joycelyn C. Austen para el Desarrollo Profesional de Mujeres Científicas Médicas (L.G.B.), y por un generosa donación de la familia Vinik (L.G.B.).

Antes de llevar a cabo los siguientes experimentos, asegúrese de que todo el uso y protocolos de cuidado animal sean aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y realizados de acuerdo con la Guíapara el Cuidado y Uso del Consejo Nacional de Investigación Animales de Laboratorio" (8a Edición, 2011) y las directrices de LA ARRIVE. Todos los procedimientos descritos a continuación han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso d...

<ol>
	<li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals.">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li><li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade.">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).</li><li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation.">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li><li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules.">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li><li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit.">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes.">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues.">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube.">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing.">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte.">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li><li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project,+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system.">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice.">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+16A+(TMEM16A)+is+a+Ca2+-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways.">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+Proteases:+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets.">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li><li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain.">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).</li><li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leupeptins,+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes.">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li><li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. , (2018).</li><li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2.">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li><li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells.">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li><li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123,+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor,+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion.">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li></ol>

Encontramos que una combinación de tratamiento de dosis altas durante 40 minutos seguido de un tratamiento corto con papaína (30 min) proporciona un protocolo óptimo para la digestión traqueal y el aislamiento de células de cepillo. Esta combinación evita una digestión extensa y produce el mayor rendimiento de células de cepillo, en comparación con los protocolos alternativos.
Mientras que la digestión pulmonar para extraer células hematopoyéticas se ha basado clásicamente en enzi...

Las células de cepillo pertenecen a una clase de células epiteliales quimiosensoriales caracterizadas por la expresión de receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de receptores de sabor que se encuentra en las células de los paladares. A diferencia de las células de los cogollos de sabor, las células epiteliales quimiosensoriales se dispersan en superficies epiteliales y se conocen como células quimiosensoriales solitarias (SCC) y células microvasas en el epitelio nasal1,2, células de cepillo en la tráquea 3,4, y células de mechón en el intestino5,6. Las células epiteliales que expresan receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de sabor amargo también se encuentran en la uretra7,8 y el tubo auditivo9. Las células del cepillo de las vías respiratorias tienen funciones únicas en las respuestas neurogénicas e inmunitarias. Son células quimiosensoriales productoras de acetilcolina que evocan reflejos respiratorios protectores tras la activación con compuestos amargos y metabolitos bacterianos como las sustancias de observación de quórum10. Las células de cepillo de las vías respiratorias son también la fuente epitelial dominante dela VÍA respiratoria de IL-25, que regula la inflamación del tipo 2 con aeroallos en las vías respiratorias 3.
La caracterización del transcriptoma completo de las células del cepillo de las vías respiratorias inferiores y su respuesta a los estímulos ambientales se ha visto limitada por su bajo número en el epitelio traqueal y un número muy limitado más allá de los grandes bronquios10. Las técnicas utilizadas para el aislamiento de células quimiosensoriales del epitelio intestinal no han dado resultados proporcionalmente altos de la tráquea, posiblemente debido a los contactos íntimos de las células del cepillo traqueal con terminaciones nerviosas10 u otras factores específicos del tejido en la mucosa respiratoria, como la composición de adheridos y proteínas de unión apretada. Informes recientes de aislamiento exitoso de células de cepillo traqueal en números más altos para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula emplearon una incubación de 2 h con papaína o una incubación de 18 h con pronasa11,12. Dado que las incubaciones más largas con enzimas digestivas pueden disminuir la viabilidad celular y alterar el perfil transcripcional de las células de los tejidos digeridos13,esto podría sesgar el análisis comparativo con otras poblaciones epiteliales quimiosensoriales.
Aquí, informamos de un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal para la secuenciación de ARN3. El tratamiento de la tráquea con dosis altas de dosis separa el epitelio de la submucosa. La digestión posterior de la lámina epitelial con papaína permite una excelente recuperación de esta célula estructural.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td>cat# ab5450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC anti-mouse CD326 (EpCAM)&#160; (G8.8)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#118214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC Rat IgG2a, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400511</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#422801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:345px;">Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>cat#A-11055</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Normal Goat IgG</td>
			<td style="width:101px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">cat#AB-108-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#103126</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#101320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Dispase</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">cat# 17105041&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DNase I</td>
			<td style="width:101px;">Sigma&#160;</td>
			<td>cat# 10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:345px;">HEPES-Tyrode&#8217;s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# PY-912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:345px;">Tyrode&#8217;s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter. )</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# BSS-355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# C7352</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Leupeptin trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# L2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Papain from papaya latex</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P3125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P4170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td>
			<td style="width:101px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:136px;">7902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">LSM 800 with Airyscan confocal system&#160;on a&#160;Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:136px;">647465</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Disposable equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">1.5 mL sterile tubes</td>
			<td style="width:101px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:136px;">1157C86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">14-959-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Feather Disposable Scalpel no.12</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Petri dish, 100 x 15 mm Style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sterile cell strainer, 100 &#956;m</td>
			<td style="width:101px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:136px;">cat#22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas

Las células del cepillo traqueal son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas a las que se encuentra para transmitir señales desde el lumen de las vías respiratorias al sistema inmunitario y nervioso. Son parte de una familia de células epiteliales quimiosensoriales que incluyen células de mechón en la mucosa intestinal, células de cepillo en la tráquea, y células quimiosensoriales y microvasas solitarias en la mucosa nasal. Las células quimiosensoriales en diferentes compartimentos epiteliales comparten marcadores intracelulares clave y una firma transcripcional central, pero también muestran una heterogeneidad transcripcional significativa, probablemente reflejo del entorno tisular local. Se requiere aislamiento de las células del cepillo traqueal de las suspensiones de una sola célula para definir la función de estas células epiteliales raras en detalle, pero su aislamiento es difícil, potencialmente debido a la estrecha interacción entre las células del cepillo traqueal y las terminaciones nerviosas o debido a la composición específica de las vías respiratorias de uniones apretadas y adheridas. Aquí, describimos un procedimiento para el aislamiento de las células del cepillo del epitelio traqueal del ratón. El método se basa en una separación inicial del epitelio traqueal de la submucosa, lo que permite una posterior incubación más corta de la lámina epitelial con papaína. Este procedimiento ofrece una solución rápida y conveniente para la clasificación citométrica de flujo y el análisis funcional de células de cepillo traqueal viables.

Este procedimiento se ha implementado con éxito para aislar células de cepillo traqueal para la secuenciación de ARN3. Después del aislamiento de la tráquea y ladigestión del tejido con un protocolo de 2 pasos (Figura 1), las células se recogieron y se mancharon con CD45 etiquetado fluorescentemente y EpCAM después de la exclusión de células muertas con PI. Después de hacer dobletes basados en las características de dispersión hacia adelante y lateral, de...

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Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Las células del cepillo son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas raras que se encuentran en la tráquea de ratón ingenua. Debido a su número limitado, la evaluación ex vivo de su papel funcional en la inmunidad y remodelación de las vías respiratorias es un desafío. Describimos un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal por citometría de flujo.

Aislamiento y evaluación cuantitativa de células de pincel de tráqueas de ratón

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Desarrollamos un procedimiento para el aislamiento de células de cepillo traqueal, raras células epiteliales quimiosensoriales especializadas de ratones reportero fluorescentes de acetiltransferasa de colina. Este método se basa en una separación inicial del epitelio traqueal de la submucosa permitiendo una posterior incubación más corta de la hoja epitelial con papaína. Esto permite una recuperación robusta de las células del cepillo traqueal y se ha utilizado con éxito para el aislamiento y el análisis transcripcional de las células del cepillo mediante la secuenciación del ARN.La incubación prolongada con enzimas digestivas puede disminuir la viabilidad celular y alterar el perfil transcripcional de las células aisladas de los tejidos. Aquí separamos el epitelio traqueal con dispase y posteriormente lo incubamos con papaína durante un corto período de tiempo produciendo altos rendimientos de células de cepillo viables. Nuestro método puede contribuir a estudios del epitelio de las vías respiratorias superiores.El mismo protocolo se puede aplicar a aislar las células del cepillo de otros sitios de la mucosa, como el tejido nasal. La demostración de nuestra técnica altamente reproducible permitirá a los científicos de pares aislar e investigar más a fondo las células del cepillo traqueal. Para comenzar este procedimiento, agregue disase y DNase I a PBS a las concentraciones finales mostradas aquí para preparar la solución de digestión dispase.Asegúrese de que el polvo dispase esté completamente disuelto antes de calentar la solución en un baño de agua a 37 grados centígrados. A continuación, agregue un 5% de FBS inactivado por calor a DMEM para preparar una solución de detención. Para preparar el tampón Tyrode I, agregue papaína y L-cisteína al tampón de HEPES Tyrode sin calcio.Para preparar el tampón Tyrode II, añada leupeptina al tampón de HEPES Tyrode sin calcio a una concentración de dos microlitros por mililitro. Para preparar el tampón FACS, utilice la solución de sal equilibrada de Hank sin calcio, magnesio y rojo fenol complementado con dos EDTA mililares y 2%FBS. Después de eutanasiar el ratón, utilice agujas de calibre 21 para fijarlo en una placa quirúrgica en la posición supina con extremidades superiores e inferiores extendidas.Rocíe el pelaje con 70% de etanol para desinfectar el área. Usando fórceps rectos, levante la piel y el pelaje del abdomen y use tijeras diseccionentas para hacer una incisión en el centro. Usando las tijeras, separe la piel del tejido subcutáneo del abdomen a la mandibula.Mientras sostiene el tejido subcutáneo con los fórceps, haga una pequeña incisión con las tijeras en el centro de la pared abdominal. A continuación, abra el peritoneo con una incisión en forma de V. Usando los fórceps, mueva suavemente el intestino delgado hacia un lado.Localiza la aorta abdominal y la vena cava y haz una incisión con las tijeras diseccionantes para permitir una rápida exsanguinación. Localice el diafragma. Usando una aguja de calibre 18, haz una abertura en el diafragma justo debajo del esternón para desinflar los pulmones.Usando tijeras de disección rectas puntiagudas afiladas, corte a lo largo de la base de las costillas para separar cuidadosamente el diafragma de la caja torácica. Utilice los fórceps para levantar el extremo expuesto del esternón y cortar el esternón longitudinalmente desde la base de la caja torácica hasta el cuello. Utilice tijeras rectas cortas para hacer una incisión cervical central y separar los dos lóbulos de la glándula submandibular.Después de esto, utilice un par de fórceps de alta precisión de punto fino para eliminar cuidadosamente el tejido conectivo circundante y el timo que cubre la carina. Diseccionar la tráquea libre separando primero el extremo proximal a nivel de la epiglotis y luego diseccionando el extremo distal a nivel de la bifurcación de la tráquea. Localice la epiglotis y corte la tráquea longitudinalmente de la epiglotis a la carina.Para comenzar, coloque la tráquea en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 750 microlitros de solución de digestión dispasa precalentada a 37 grados centígrados. Cubra el tubo con papel de aluminio para reducir la exposición a la luz directa e incubar en una coctelera a 200 RPM y a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, agregue 750 microlitros de DMEM con 5%FBS para detener la reacción y colocar el tubo sobre hielo.Transfiera la tráquea a un plato de Petri. Orientar la tráquea con el lado epitelial hacia arriba. La tráquea diseccionada longitudinalmente tiene una forma semicilíndrica mantenida por los anillos cartilaginosos.El epitelio está en la superficie cóncava. Usando fórceps rectos, ata el área de epiglotis de la tráquea al plato Petri y usa un bisturí de desecho de tamaño 22 para raspar el epitelio de la tráquea. La capa epitelial se separará como una hoja translúcida.Usa el bisturí para picar el epitelio y transfiere la capa epitelial a un tubo de dos mililitros. Enjuague el plato Petri con 750 microlitros de Tyrode I buffer y transfieralo al tubo que contiene la capa epitelial. Cubra el tubo con papel de aluminio para reducir la exposición a la luz directa e incubar a 37 grados Centígrados en una coctelera a 200 RPM durante 30 minutos.A continuación, agregue 750 microlitros de tyrode II tampón frío. Vórtice el tejido digerido vigorosamente durante 20 a 30 segundos. Usando una jeringa unida a una aguja de calibre 18, triturar el homogeneato 10 veces.Después de esto, cambie a una aguja de calibre 21 y triturar de 10 a 20 veces más. Filtrar las células a través de un colador de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue el búfer FACS frío a una relación volumétrica de 30 a uno.Centrifugar a 350 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en tampón FACS frío. Transfiera esta suspensión a un tubo de poliestireno de 12 por 75 milímetros.Centrifugar de nuevo a 350 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 microlitros de tampón FACS. A continuación, agregue un microlitro de anticuerpos de bloqueo de CD1632 antiratón para bloquear la unión no específica e incubar en hielo durante 15 minutos.A continuación, agregue anticuerpos en los controles de isotipo respectivos como se describe en el protocolo de texto. Incubar sobre hielo durante 45 minutos mientras está protegido de la luz directa. Después de esto, agregue 4,5 mililitros de tampón FACS frío y mezcle.Centrífuga a 350 g y a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 microlitros de tampón FACS frío. Añadir yoduro de propidio inmediatamente antes de la clasificación citométrica de flujo.En este estudio, las células de cepillo traqueal de chAT eGFP ratones reportero fluorescentes de acetilcolina se aíslan con éxito para la secuenciación de ARN. Las células se identifican a partir de escombros por ángulo de dispersión hacia adelante y hacia un lado. Las dobles se excluyen utilizando la altura y la anchura de dispersión hacia delante y la altura y anchura de dispersión lateral.Los dobletes son las celdas que tienen valores de ancho altos. Dentro de las células individuales, las células vivas se identifican como la población que es negativo de yoduro propidium. Dentro de las células individuales vivas, las células bajas a negativas CD45 se identifican en función del control de isotipo.Dentro de las células negativas bajas CD45, las células positivas de EpCAM que también son positivas de eGFP en el canal FITC son la población de células de cepillo. Los números celulares del cepillo se alteran por la exposición a metabolitos microbianos y protozoos y, por lo tanto, reflejan la variabilidad de la microbiota institucional. Por lo tanto, sugerimos estimar el número de células de cepillo por microscopía de fluorescencia para medir el número esperado de células aisladas del cepillo por clasificación citométrica de flujo.Asegúrese de separar correctamente la capa epitelial de la tráquea a medida que determina los rendimientos de las células aisladas del cepillo. Las células aisladas del cepillo traqueal se pueden utilizar en una amplia gama de ensayos como la secuenciación de ARN, el cultivo celular y el análisis funcional.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivación de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De células madre embrionarias de ratón

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Aislamiento de células de Sertoli y peritubulares Las células de testículos de ratas

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...