Name: isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas at JoVE.com

Vi tackar Adam Chicoine vid Brigham and Women ' s Human immunologi Center Flow Core för hans hjälp med Flow kors sortering. Detta arbete stöddes av nationella institut för hälso bidrag R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), och K08 AI132723 (L. G. B), och av American Academy of allergi, astma och immunologi (AAAAI)/American lung allergisk Respiratorisk sjukdom Award (N.A.B.), av AAAAI Foundation fakultet Development Award (L.G.B.), av Steven och Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), av Joycelyn C. Austen fonden för karriärutveckling av kvinnliga läkare forskare (L.G.B.), och av en generös donation av familjen Vinik (L.G.B.).

Innan du utför följande experiment, se till att all användning av djuromsorg och alla protokoll är godkända av den institutionella djurvårds-och användnings kommittén (IACUC) och utförs i enlighet med det nationella forskningsrådets vägledning för skötsel och användning av Försöksdjur " (8: e upplagan, 2011) och riktlinjerna för Anländ. Alla procedurer som beskrivs nedan har granskats och godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Brigham and ...

<ol>
	<li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals.">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li><li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade.">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).</li><li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation.">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li><li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules.">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li><li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit.">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes.">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues.">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube.">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li><li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing.">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li><li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes.">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li><li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte.">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li><li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project,+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system.">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice.">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition.">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+16A+(TMEM16A)+is+a+Ca2+-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways.">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+Proteases:+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets.">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li><li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain.">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).</li><li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leupeptins,+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes.">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li><li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps.">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. , (2018).</li><li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2.">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li><li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells.">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li><li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123,+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor,+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion.">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li></ol>

Vi fann att en kombination av hög dos dispas behandling för 40 min följt av en kort papain behandling (30 min) ger ett optimalt protokoll för trakealnedbrytning och borste cell isolering. Denna kombination undviker omfattande nedbrytning och ger den högsta avkastningen av pensel celler, jämfört med alternativa protokoll.
Medan lung nedbrytning för att extrahera hematopoietiska celler har klassiskt förlitade sig på milda matsmältningsenzymer som kollagenase IV15</su...

Pensel celler tillhör en klass av chemosensoriska epitelceller som kännetecknas av uttrycket av bitter smak receptorer och smak receptor signaltransduktion maskiner finns i smaken bud celler. Till skillnad från smak bud celler, chemosensoriska epitelceller är utspridda i epitelial ytor och kallas solitära kemosensoriska celler (SCCS) och microvillous celler i nasala epitelet1,2, pensel celler i luftstrupen 3,4, och tofs celler i tarmen5,6. Epitelceller som uttrycker bitter smak receptorer och bitter smak signaltransduktion maskiner finns också i urinröret7,8 och auditiva röret9. Luftvägarna borste celler har unika funktioner i neurogena och immun luftvägarna svar. De är acetylkolin-producerande chemosensoriska celler som framkallar skyddande respiratoriska reflexer vid aktivering med bitter föreningar och bakteriella metaboliter som kvorum-Sensing ämnen10. Luftvägarna borst celler är också den dominerande luftvägarna epitelial källa av IL-25, som reglerar aeroallergen-framkallade typ 2 inflammation i luftvägarna3.
Karakterisering av hela transkriptome av nedre luftvägarna pensel celler och deras svar på miljömässiga stimuli har begränsats av deras låga antal i trakealepitelet och mycket begränsat antal bortom den stora bronkerna10. Tekniker som används för isolering av chemosensoriska celler från tarmens epitel har inte gett proportionellt höga siffror från luftstrupen, möjligen på grund av intima kontakter luftrör pensel celler med nervändar10 eller andra vävnads-specifika faktorer i luftvägarna slemhinnan såsom sammansättningen av anhängare och snäva knutpunkt proteiner. Nyligen rapporter om framgångsrik isolering av trakealborst celler i högre antal för Single cell RNA sekvenserings analys anställd antingen en 2 h inkubation med papain eller en 18 h inkubering med pronase11,12. Eftersom längre inkuberingar med matsmältningsenzymer kan minska cellernas lönsamhet och förändra den transkriptionella profilen hos celler från smält vävnader13, detta kan bias jämförande analys med andra kemosensoriska epiteliala populationer.
Här rapporterar vi en metod för isolering av trakealborst celler för RNA-sekvensering3. Behandling av luftstrupen med hög dos dispas separerar epitelet från submucosa. Efterföljande nedbrytning av epitelial ark med papain möjliggör utmärkt återhämtning av denna strukturella cell.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td>cat# ab5450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC anti-mouse CD326 (EpCAM)&#160; (G8.8)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#118214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">APC Rat IgG2a, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400511</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#422801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:345px;">Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>cat#A-11055</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Normal Goat IgG</td>
			<td style="width:101px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">cat#AB-108-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#103126</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#400627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td style="width:101px;">Biolegend</td>
			<td style="width:136px;">cat#101320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Dispase</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">cat# 17105041&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DNase I</td>
			<td style="width:101px;">Sigma&#160;</td>
			<td>cat# 10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:345px;">HEPES-Tyrode&#8217;s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# PY-912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:345px;">Tyrode&#8217;s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 &#181;m filter. )</td>
			<td style="width:101px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:136px;">cat# BSS-355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# C7352</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Leupeptin trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# L2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Papain from papaya latex</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P3125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">cat# P4170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td>
			<td style="width:101px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:136px;">7902</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">LSM 800 with Airyscan confocal system&#160;on a&#160;Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:136px;">647465</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Disposable equipment</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">1.5 mL sterile tubes</td>
			<td style="width:101px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:136px;">1157C86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">14-959-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:345px;">Feather Disposable Scalpel no.12</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Petri dish, 100 x 15 mm Style</td>
			<td style="width:101px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Sterile cell strainer, 100 &#956;m</td>
			<td style="width:101px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:136px;">cat#22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantitative evaluation of brush cells from mouse tracheas

Tracheal pensel celler är kolinerga kemosensoriska epitelceller redo att överföra signaler från luftvägslumen till immunförsvaret och nervsystemet. De är en del av en familj av chemosensoriska epitelceller som inkluderar tofs celler i tarmslemhinnan, pensel celler i luftstrupen, och ensamma chemosensoriska och microvillous celler i nässlemhinnan. Chemosensoriska celler i olika epiteliala fack dela viktiga intracellulära markörer och en kärna transkriptionella signatur, men också visa betydande transkriptionella heterogenitet, sannolikt reflekterande av den lokala vävnads miljön. Isolering av trakealborst celler från enstaka cellsuspensioner krävs för att definiera funktionen av dessa sällsynta epitelceller i detalj, men deras isolering är utmanande, potentiellt på grund av den nära interaktionen mellan trakealborst celler och nervändar eller på grund av luftvägsspecifika sammansättningen av snäva och anhängare korsningar. Här beskriver vi ett förfarande för isolering av pensel celler från mus trakeal epitel. Metoden är baserad på en första separation av trakeal epitel från submucosa, vilket möjliggör en efterföljande kortare inkubation av epitelial blad med papain. Detta förfarande erbjuder en snabb och bekväm lösning för flödescytometrisk sortering och funktionell analys av livskraftiga trakealborst celler.

Denna procedur har genomförts framgångsrikt för att isolera trakeal pensel celler för RNA-sekvensering3. Efter isolering av luftstrupen och nedbrytning av vävnaden med en 2-stegs protokoll (figur 1), celler samlades in och färgas med fluorescerande-märkta CD45 och EpCAM efter uteslutning av döda celler med PI. Efter gating ut dubletter baserat på framåt och sida scatter egenskaper, definierade vi pensel celler som låg/negativ för CD45, positivt för EpCAM ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas at JoVE.com

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Pensel celler är sällsynta kolinerga kemosensoriska epitelceller som finns i den naiva mus luftstrupen. På grund av deras begränsade antal, ex vivo utvärdering av deras funktionella roll i luftvägarna immunitet och Remodeling är utmanande. Vi beskriver en metod för isolering av trakealborst celler med flödescytometri.

Isolering och kvantitativ utvärdering av pensel celler från mus Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Vi utvecklat ett förfarande för isolering av trakeal pensel celler, sällsynta specialiserade chemosensory epitelial celler från kolin acetyltransferas fluorescerande reporter möss. Denna metod är baserad på en inledande separation av luftstrupe epitel från submucosa möjliggör en efterföljande kortare inkubation av epitelplåten med papain. Detta möjliggör robust återvinning av trakeal pensel celler och har framgångsrikt använts för isolering och transkriptional analys av penselceller av RNA sekvensering.Lång inkubation med matsmältningsenzymer kan minska cellernas livskraft och förändra transkriptionella profilen för celler som isolerats från vävnader. Här separerar vi luftstrupepitelet med dispase och inkuberar därefter det med papain under en kort tid som producerar höga utbyten av livskraftiga borstceller. Vår metod kan bidra till studier av övre luftvägarna epitel.Samma protokoll kan tillämpas på att isolera penselceller från andra slemhinnan platser såsom nasal vävnad. Demonstration av vår mycket reproducerbara teknik kommer att tillåta peer forskare att isolera och ytterligare undersöka trakeal pensel celler. För att börja detta förfarande, tillsätt dispase och DNase I till PBS vid de slutliga koncentrationerna som visas här för att förbereda dispase digestion lösning.Se till att dispase pulvret är helt upplöst innan du värmer upp lösningen i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Därefter lägger du till 5 %värme-inaktiverad FBS till DMEM för att förbereda en stopplösning. För att förbereda Tyrode I buffert, lägga papain och L-cystein till HEPES Tyrode buffert utan kalcium.För att förbereda Tyrode II-bufferten, tillsätt leupeptin till HEPES Tyrodes buffert utan kalcium vid en koncentration av två mikroliter per milliliter. För att förbereda FACS-bufferten använder du Hanks Balanced Salt Solution utan kalcium, magnesium och fenolrött kompletterat med två millimolar EDTA och 2%FBS. Efter euthanizing musen, använd 21 gauge nålar för att fixa det på en kirurgisk styrelse i ryggläge med utökade övre och nedre extremiteterna.Spraya pälsen med 70%etanol för att sanera området. Använda raka tångar, lyft huden och pälsen i buken och använda dissekera sax för att göra ett snitt i mitten. Använd saxen, separera huden från den subkutana vävnaden från buken till mandibulan.Medan du håller upp den subkutana vävnaden med tärna, gör ett litet snitt med saxen i mitten av bukväggen. Öppna sedan peritoneum med ett V-format snitt. Med hjälp av tentarna, flytta försiktigt tunntarmen åt sidan.Lokalisera buken aorta och vena cava och göra ett snitt med dissekera saxen för att möjliggöra snabb exsanguination. Lokalisera membranet. Med hjälp av en 18 gauge nål, gör en öppning i membranet strax under bröstbenet för att tömma lungorna.Med hjälp av vassa spetsiga rakt dissekera sax, skär längs basen av revbenen för att noggrant separera membranet från bröstkorgen. Använd kraftknaget för att lyfta den exponerade änden av bröstbenet och skär bröstbenet i längsled från basen av bröstkorgen till halsen. Använd kort rak sax för att göra en central halsinfektion och separera de två lober av submandibular körtel.Efter detta, använd ett par fina punkt hög precision tlycer för att försiktigt ta bort den omgivande bindväv och bräss överliggande carina. Dissekera luftstrupen fritt genom att först separera den proximala änden på nivån av struplocket och sedan dissekera den distala änden på nivån för bifurkation av luftstrupen. Lokalisera struplocket och skär luftstrupen längsgående från struplocket till carina.Till att börja placera luftstrupen i en 1,5 milliliter rör som innehåller 750 mikroliter av dispase matsmältningslösning förvuppvade till 37 grader Celsius. Täck röret med aluminiumfolie för att minska exponeringen för direkt ljus och inkubera på en shaker vid 200 RPM och vid rumstemperatur i 40 minuter. Tillsätt sedan 750 mikroliter av DMEM med 5%FBS för att stoppa reaktionen och placera röret på is.Överför luftstrupen till en petriskål. Orientera luftstrupen med epitelsidan uppåt. Den längsgående dissekerade luftstrupen har en halvcylindrisk form som underhålls av de broskiga ringarna.Epitelet är på den konkava ytan. Med hjälp av raka tång, tjudra struplocket området av luftstrupen till Petri-skålen och använda en storlek 22 förfogande skalpell för att skrapa epitel av luftstrupen. Epitelskiktet kommer att separera som ett genomskinligt ark.Använd skalpell för att finhacka epitelet och för över epitelskiktet till ett två milliliterrör. Skölj petriskålen med 750 mikroliter av Tyrode I buffert och överför detta till röret som innehåller epitelskiktet. Täck röret med aluminiumfolie för att minska exponeringen för direkt ljus och inkubera i 37 grader Celsius på en shaker vid 200 RPM i 30 minuter.Tillsätt sedan 750 mikroliter av kall Tyrode II buffert. Vortexa den smälta vävnaden kraftigt i 20 till 30 sekunder. Med hjälp av en spruta fäst vid en 18 gauge nål, triturate homogenatet 10 gånger.Efter detta, byta till en 21 gauge nål och triturate 10 till 20 gånger. Filtrera cellerna genom en 100 mikrometer sil i en 50 milliliter koniska röret. Lägg till kall FACS-buffert vid ett volymetriskt förhållande på 30 till en.Centrifugera vid 350 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i kall FACS-buffert. Överför denna suspension till en 12 med 75 millimeter polystyren rör.Centrifugera igen vid 350 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 100 mikroliter av FACS-buffert. Därefter lägger du till en mikroliter av anti-mus-CD1632-blockerande antikropp för att blockera icke-specifik bindning och inkubera på is i 15 minuter.Lägg sedan till antikroppar i respektive isotyp-kontroller enligt textprotokollet. Inkubera på is i 45 minuter medan skyddas från direkt ljus. Efter detta, tillsätt 4,5 milliliter kall FACS buffert och blanda.Centrifugera vid 350 gånger g och vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 300 mikroliter av kall FACS-buffert. Lägg till propidium iodid omedelbart före flöde cytometrisk sortering.I denna studie, trakeal pensel celler från ChAT eGFP acetylkolin fluorescerande reporter möss framgångsrikt isolerade för RNA sekvensering. Celler identifieras från skräp genom framåt och sida scatter vinkel. Dubbler är undantagna med hjälp av framåt scatter höjd och bredd och sidan scatter höjd och bredd.Dubblerna är de celler som har höga breddvärden. Inom de enstaka cellerna identifieras de levande cellerna som den population som är propidium iodidnegativ. Inom de levande enstaka cellerna identifieras CD45-låg till negativ celler baserat på isotype-kontrollen.Inom de låga negativa CELLERNA CD45 är de EpCAM-positiva celler som också är eGFP-positiva i FITC-kanalen populationen av penselceller. Penselcelltalen ändras genom exponering för mikrobiella metaboliter och protozoer och återspeglar därför variabiliteten hos institutionell mikrobiota. Därför skulle vi föreslå att uppskatta antalet pensel celler genom fluorescens mikroskopi för att mäta det förväntade antalet isolerade pensel celler genom flöde cytometrisk sortering.Se till att ordentligt separera epitelskiktet i luftstrupen eftersom det bestämmer avkastningen av isolerade borstceller. De isolerade trakealborstcellerna kan användas i ett brett spektrum av analyser som RNA-sekvensering, cellodling och funktionsanalys.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolering av Mouse bukhålan celler

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Dendritiska Mouse lungceller

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering och karakterisering av dendritiska celler och makrofager från mus tarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ utvärdering av cellmigration genom Phagokinetic Track Motility analys

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av lymfocyter från mus könsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolering av Double Negative αβ T-celler från njure

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolering av Sertoliceller och peritubulär Celler från Rat Testiklar

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...