Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

نشكر س. شومان على توفير الانزيم اتلاف الثدييات cDNA. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بمنحة لمعهد أبراج للبحوث الطبية من صندوق هيلين نيلسون للبحوث الطبية في مؤسسة مجتمع مدينة كانساس الكبرى.  يمكن الوصول إلى البيانات الأصلية التي تستند إليها هذه المخطوطة من مستودع البيانات الأصلية في Stowers في http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. الجمعية من مجمعات استطالة الاصطناعية وبولس الثاني المشي
<ol><li>تعطيل 1 نمول من القلة الحمض النووي غير قالب تحتوي على جزيء البيوتين 3 'على الخرز المغناطيسي. ملاحظة: يمكن إجراء الخطوات التالية مسبقاً للتحضير للتجارب المستقبلية. وترد في الجدول 1جميع تسلسلات القلة المستخد?...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

يمكن تسهيل الدراسات التي تسعى إلى تشريح الأحداث إلى جانب مجمع استطالة Pol II مثل معالجة الحمض النووي الريبي وتنظيم استطالة النص نفسه إلى حد كبير باستخدام نظام إنزيم عالي النقاء. إنشاء مثل هذه النظم الإنزيم يمكن أن يكون تحديا. ويتطلب النسخ المعتمد على المروج من قبل الشرطة الثانية خمسة عوامل ع...

Eukaryotic رسول RNA (mRNA) التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة التي تنطوي على توليف الحمض النووي الريبي السلائف غير المجهزة من قبل الحمض النووي الريبي البليمرالثاني وتجهيز الحمض النووي الريبي السلائف لإنتاج mRNA ناضجة. يتم تنفيذ خطوات معالجة RNA من السد، الربط، وpolyadenyly إلى حد كبير co-transcriptionally. يعمل مجمع استطالة Pol II كسقالة تقوم بتجنيد وتنسيق أنشطة العديد من إنزيمات معالجة الحمض النووي الريبي. وبالتالي، فإن فهمنا النهائي لكيفية توليد mRNAs eukaryotic ناضجة سوف تعتمد بشكل كبير على تطوير النظم التجريبية للسماح تشريح الآليات البيوكيميائية الكامنة وراء التوظيف في مجمع استطالة و تنظيم الإنزيمات المسؤولة عن الجمع بين النسخ، الربط، وpolyadenylation.
وليس من المستغرب أن يكون تطوير هذه النظم التجريبية صعبا. وكان أحد العوائق الرئيسية هو التعقيد الملحوظ للنسخ السياسي الثاني نفسه حيث يتطلب ببساطة إعادة تشكيل النسخ القاعدي من قبل بولس الثاني في المختبر مجموعة دنيا من خمسة عوامل بدء النسخ العامة: TFIIB، TFIID، TFIIE، TFIIF، وTFIIH 1- وعلاوة على ذلك، فإن إعادة تشكيل أي نوع من النسخ الخاضع للتنظيم في المختبر يتطلب مجموعة أكبر من عوامل النسخ والجهات التنظيمية المشتركة. وهكذا، كان أحد الأهداف الرئيسية هو تطوير نظم تجريبية أبسط تسمح بإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة المناسبة للتحقيقات في الاقتران الوظيفي للنسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي.
وقد ثبت أن إحدى هذه الطرق الأبسط لإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة مفيدة للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية للفترة التي تمد فيها Pol II، وفي الآونة الأخيرة، للتحقيق في معالجة الحمض النووي الريبي النسخي المشترك2و3 ،4،5. في هذه المقالة، نبين كيف يمكن استخدام مجمعات استطالة Pol II المعدة من الفقاعات المنقّدة من Pol II والنسخ الاصطناعية بشكل فعال للتحقيق في الآليات الكامنة وراء وضع حد أقصى للنسخ المشترك لنصوص بولس الثانية الوليدة.
يشير الحد الأقصى إلى إضافة "غطاء" 5'-guanosine إلى نهاية 5'-ثلاثي الفوسفات من النصوص الوليدة Pol II. الحد الأقصى مهم للخطوات اللاحقة من النضج mRNA، والنقل، والترجمة، وغيرها من العمليات6،7. يتم إضافة الغطاء بشكل مشترك إلى نسخ بول الثاني بواسطة إنزيم يشار إليه باسم إنزيم السد. في خلايا الثدييات ، يتم احتواء المواقع النشطة المسؤولة عن أنشطة RNA 5'-triphosphatase وguanylyl transferase من إنزيم السد داخل ببتيد واحد8. يتم تجنيد إنزيم السد إلى مجمع استطالة بول الثاني من خلال التفاعلات مع الأسطح التي لم يتم تعريفها بعد على الجسم بول الثاني والمجال Rpb1 كاربوكسي المحطة الطرفية (CTD) فوسفوريلاتيد على Ser5 من البعيبتيدات5. في مجمع استطالة، يحفز إنزيم السد إضافة غطاء 5'-guanosine بمجرد أن يصل النص الوليد إلى طول لا يقل عن 18 نيوكليوتيدات وخرج من قناة خروج الحمض النووي الريبي البوليمر. في الخطوة الأولى من رد الفعل السد، وtriphosphatase تحلل الحمض النووي الريبي 5'-ثلاثي الفوسفات لإنتاج 5'-ثنائي الفوسفات. في الخطوة الثانية، يتم تحلل GTP إلى GMP بواسطة transferase guanylyl، وتشكيل إنزيم GMP-السد المتوسطة. وأخيراً، ينقل guanylyl transferase GMP إلى نهاية 5'-ثنائي الفوسفات من النص الوليد لإنتاج الغطاء.
وهناك سمة ملحوظة من رد الفعل متوجا هو أن تغطية النسخ المشترك (أي، وضع حد أقصى للنصوص المرتبطة بمجمعات استطالة Pol II الوظيفية) هو أكثر كفاءة بكثير من الحد الأقصى من RNAالحرة 5،9. وهكذا، كان السؤال الرئيسي في هذا المجال كيف يتم تحقيق هذا التنشيط الدرامي للتغطية من خلال تفاعلات إنزيم السد مع مجمع استطالة Pol II. في هذا البروتوكول نصف التجمع من المجمعات الاتطالية RNA الثاني النشط باستخدام فقط تنقية RNA بولميراز الثاني وفقاعات النسخ الاصطناعي. تسمح هذه الطرق بإنشاء مجمعات استطالة RNA polymerase II مع نصوص ذات طول وتسلسل محددين. في دراسة حديثة، استخدمنا هذه المجمعات الميرليمرة الثانية تعريف الحمض النووي الريبي كنموذج للتحقيق في جوانب آليات RNA متوجا5. وعلى وجه الخصوص، أظهرنا أن '1' الحد الأقصى لRNA المرتبط بهذه المجمعات الاستطالة كان أكثر من 100 أضعاف أكثر كفاءة من الحد الأقصى للRNA الحرة و '2' تم تحفيزه من قبل الفسفور المعتمد على TFIIH من CTD Pol II. ويمكن من حيث المبدأ تكييف النهج الموصوف هنا لتوليد ركائز لدراسة ردود الفعل الأخرى لمعالجة الحمض النووي الريبي المشترك المرتبطة بمجمع استطالة Pol II.
في القسم 1 من هذا البروتوكول، يتم إنشاء مجمعات استطالة اصطناعية عن طريق صلب قالب اصطناعي حبلا الحمض النووي oligonucleotide إلى oligonucleotide RNA التي هي مكملة في 3'-نهاية إلى ما يقرب من 9 النيوكليوتيدات من الحمض النووي حبلا قالب. ثم يتم تحميل Pol II على الحمض النووي: RNA دوبلكس. ثم يتم الانتهاء من مجمع استطالة بإضافة تكميلية جزئيا، غير قالب حبلا الحمض النووي oligonucleotide التي وصفت مع البيوتين في 3'-نهاية (الشكل1 والشكل 2A). يتم توسيع oligonucleotide RNA من قبل بول الثاني في هذه المجمعات استطالة لجعل النصوص ذات العلامات الراديوية من طول محدد وتسلسل على إضافة تركيبات مناسبة من النيوكليوتيدات ذات العلامات الراديوية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مزيج من الإذاج لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة وإضافة أخرى من تركيبات مختلفة من النيوكليوتيدات، يمكن للمرء أن "يمشي" Pol II إلى مواقف مختلفة على طول قالب الحمض النووي وتوليف الحمض النووي الريبي من أطوال محددة. ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي وإخضاعه للكتروفوريس في المواد الهلامية اليوريا PAGE denaturing. في القسم 2 من البروتوكول، يتم استخدام مجمعات استطالة اصطناعية لتحليل تغطية الحمض النووي الريبي النسخي المشترك. وقدم المثال تدابير تأثير الفسفورية المعتمدة على TFIIH من CTD Pol II على الرنا النسخي المشترك السد. في هذه التجربة، نقوم بقياس مدى الكبة النسخية المشتركة كدالة لتركيز إنزيم السد (5 و15 و45 نانوغرام لكل رد فعل) والوقت (1 و2 و4 دقيقة).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

Eukaryotic mRNA التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة تتطلب نسخ من قالب الحمض النووي الريبي في الحمض النووي الريبي السلائف من قبل متعددة subunit إنزيم RNA بولميراز الثاني وco-transcriptional السد والربط من الحمض النووي الريبي السلائف لتشكيل mRNA ناضجة. أثناء توليف mRNA، فإن مجمع استطالة الميرنا ً الثاني هو هدف للتنظيم من خلال مجموعة كبيرة من عوامل النسخ التي تتحكم في نشاطه الحفاز، فضلاً عن الأنزيمات المتوجة، والربط، و3'-المعالجة التي تخلق الميرنا الناضجة. وبسبب التعقيد المتأصل في توليف الحمض النووي الريبي، فإن النظم التجريبية الأبسط التي تمكن من العزلة والتحقيق في مختلف مراحلها النسخية المشتركة لها فائدة كبيرة.
في هذه المقالة، ونحن نصف واحد من هذا النظام التجريبي بسيطة مناسبة للتحقيق في تغطية RNA النسخ المشترك. يعتمد هذا النظام على مركبات استطالة RNA Polymerase II المحددة التي تم تجميعها من البلمرة النقية وفقاعات النسخ الاصطناعية. عندما شلت عن طريق الحمض النووي biotinylated، هذه المجمعات الانياطي الحمض النووي الريبي الثاني توفر أداة يمكن المناوية بسهولة لتشريح الحمض النووي الريبي النسخي المشترك السد والآليات التي المجندين مجمع استطالة وينظم الانزيم السد خلال [ك-كّوأيشنل] [رنا] يغطّي. ونحن نتوقع أن يتم تكييف هذا النظام لدراسة التوظيف و / أو تجميع البروتينات أو مجمعات البروتين مع أدوار في مراحل أخرى من نضج mRNA إلى جانب مجمع استطالة الحمض النووي الريبي الثاني.

ويبين الشكلان 2 و3 ردود فعل نتيجة تمثيلية تستخدم لتوليد مجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على نسخ من أطوال مختلفة عن طريق تمديد أو النص الثاني من مصادر مختلفة. يصور الشكل 4 كيف يمكن استخدام هذه المجمعات استطالة لفحص co-transcriptional CTD الفسفور تعت?...

Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events (Video) | JoVE

هنا، ونحن نصف الجمعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (بول الثاني) المجمعات استطالة تتطلب فقط الحمض النووي الاصطناعية قصيرة وoligonucleotides الحمض النووي الريبي وتنقية بول الثاني. وهذه المجمعات مفيدة لدراسة الآليات التي تقوم عليها المعالجة المشتركة للنسخ من النصوص المرتبطة بمجمع استطالة بولس الثاني.

الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

هنا ، أنشأنا نظامًا تجريبيًا بسيطًا يسمح بإعادة تشكيل مجمعات الاستطالة النشطة في Pol II المناسبة للتحقيق في الاقتران الوظيفي لنسخة Pol II ومواعيد الحمض النووي الريبي الريبي. مع هذا الأسلوب، يمكن تجميع مجمعات إطالة وظيفية بسهولة مع عدد قليل من المكونات. يتم شل مجمعات الاستطالة على الخرز المغناطيسي ، لذلك من السهل تغيير ظروف التفاعل.لشل تثبيت oligo الحمض النووي التي تحتوي على البيوتين على الخرز المغناطيسي، أولا إضافة 200 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي إلى انخفاض البروتين ملزمة أنبوب 1.5 ملليلتر، ومن ثم وضع الأنبوب على رف المغناطيسي لمدة دقيقتين. بينما الأنبوب على الرف المغناطيسي، واستخدام ماصة لإزالة السائل من أنبوب دون إزعاج الخرز. لغسل الخرز، وإزالة أنبوب من الرف، وإضافة ملليلتر واحد من العازلة غسل تحتوي على تريس هيدروكلوريد، EDTA، وكلوريد الصوديوم.أعيدي الأنبوب إلى الحامل. بعد دقيقتين، وإزالة محلول الغسيل، وتكرار يغسل مرتين أكثر باستخدام 200 ميكرولترات من نفس المخزن المؤقت. resuspend الخرز المغناطيسي في 400 ميكرولترات من 2X العازلة.ثم، إضافة 380 ميكرولترات من المياه و 20 ميكرولترات من 10 ميكرومولار غير قالب الحمض النووي القلوي المخلاط لخلط. ضع الأنبوب على المجنة، ويحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بغسل الخرز بـ OLigo الحمض النووي غير المُشلّم ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثم ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من التخزين والتخزين المؤقت.تخزين الأنبوب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لإنهاء حجب الخرز مع BSA. في اليوم التالي ، تخلص من الحل ، قم بإعادة بناء الخرز في 200 ميكرولترات من التخزين والتخزين العازلة ، للوصول إلى تركيز الحمض النووي التقريبي من خمسة ميكرومولار ، ومن ثم نقل الحل مع الخرز إلى أنبوب جديد. للحصول على الحمض النووي-RNA دوبلوج، إعداد مزيج 10 ميكرولتر الصلب في أنبوب PCR مع نسبة RNA-RNA-RNA-000 RNA-RNA- RNA- rna-lar، كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.ضع الأنبوب في دورة حرارية. تعيين البرنامج إلى 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، تليها 12 دورة من دقيقتين لكل منهما، بدءا من 43 درجة مئوية وخفض درجة الحرارة بمقدار درجتين مئويتين في الدورة الواحدة. وأخيرا، يبقيه خاملا عند أربع درجات مئوية.لتحميل RNA تنقية البوليميراز الثاني على الحمض النووي الريبي الهجين, مزيج ميكرولتر واحد من الحمض النووي DNA-RNA دوبليكس مع 13 ميكرولترات من البوليميراز الثاني الاحتياطية الطازجة في أنبوب. إضافة ميكرولتر واحد من البوليميراز RNA المنقى الثاني، ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا والتحريك مع طرف ماصة، دون إدخال فقاعات. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق في 30 درجة مئوية.لإكمال مجمع الممدنة ، إضافة ميكرولتر واحد من الخرز القلة الحمض النووي غير قالب غير مُشلّم إلى 14 ميكرولترات من مخزن الحمض النووي غير القالبي، وإضافة خليط 15 ميكرولتر إلى الأنبوب المحتضن سابقًا، واحتضانه لمدة 10 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية. ضع العينة على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين. غسل العينة مرة واحدة مع 30 ميكرولترات من العازلة غسل لإزالة البوليميراز غير مدمج الثاني و oligos.إلى radiolabel مجمعات الاستطالة مع RNA 23mers، إضافة ميكرولتر واحد من ATP وميكرلتر واحد من UTP المشع إلى 23 ميكرولترات من العازلة نبض، وإضافة هذا الخليط إلى الخرز المغناطيسي غسلها إلى resuspend. احتضان رد فعل لمدة 10 دقائق للسماح لتركيب 23mers radiolabeled. إضافة 1.5 microliters من الحل الذي يحتوي على 100 مجهر ATP و 100 ميكرومولار UTP مزيج إلى 3.5 ميكرولترات من المخزن المؤقت مطاردة، وإضافة الخليط إلى أنبوب يحتوي على مجمعات الممستوءة مسبقا على الخرز.مرة أخرى ، احتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق لمطاردة جميع النصوص الوليدة في 23mers. ثم، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي، واغسل كما كان يحدث سابقاً لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة. Resuspend العينة في 30 ميكرولترات من العازلة الغسيل.لتوليد مجمعات الممدود مع نصوص أطول، اتبع الإجراءات السابقة، وتوسيع نطاق أربعة أضعاف لتوليد 120 ميكرولترات من مجمعات المغاسل غسلها لأربعة ردود فعل. تسمية ثلاثة أنابيب جديدة 23mer، 25mer، و 29mer. نقل 30 ميكرولترات من مجمعات الإطالة غسلها إلى أنبوب 23mer، وإضافة 94 ميكرولترات من مزيج وقف تحتوي على البروتينات K والجليكوجين.ضع الأنبوب الذي يحتوي على 90 ميكرولترات المتبقية من مجمعات الاستطالة المغسولة على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين ، وإزالة السوبر ، والخرز resuspend في 90 ميكرولتر من BTB تكمل مع 1.2 ميكرولترات من ATP وCTP. احتضان لمدة 10 دقائق في 30 درجة مئوية. بعد الغسيل مع 90 ميكرولترات من العازلة الغسيل، ونقل 30 ميكرولترات من مجمعات الاستحمام إلى أنبوب 25mer، وإضافة 94 ميكرولترات من مزيج وقف تحتوي على البروتينات K والجليكوجين.مرة أخرى، ضع الأنبوب الذي يحتوي على 60 ميكرولترات المتبقية من مجمعات الاستطالة على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين. كرر العلاج BTB مع 60 ميكرولترات من العازلة تستكمل مع 0.8 ميكرولترات من ATP وCTP. بعد الحضانة والغسيل كما فعلت من قبل، resuspend العينة في 60 ميكرولترات من عازلة الغسيل.نقل 30 ميكرولترers من العينة إلى أنبوب 29mer، وإضافة 94 ميكرولترات من وقف مزيج تحتوي على البروتينات K والجليكوجين. تحليل منتجات التفاعل على هلام البولي أكريلاميد denaturing. أولاً، توليد مجمعات استطالة مغسولة تحتوي على 23مرات عن طريق رفع 13 أضعاف الإجراء الموصوف سابقاً للحصول على 390 ميكرولترات لـ 12 رد فعل وأخرى إضافية.لتنفيذ الفوسفور من البوليميراز الثاني CTD، وإزالة عظمى بعد وضع العينة في الرف المغناطيسي، وإعادة تعليق الخرز في 377 ميكرولترات من BTB. تسمية اثنين من أنابيب جديدة بالإضافة إلى H ونيقص H.To زائد H، إضافة ثلاثة ميكرولترات من عامل بدء النسخ TFIIH في تركيز 300 نانوغرام لكل ميكرولتر، وإلى ناقص H، إضافة تسعة ميكرولترات التخزين وتخفيف العازلة. إضافة 87 ميكرولترات من مجمعات الممدود غسلها إلى أنبوب زائد H و 261 ميكرولترات إلى أنبوب H ناقص.احتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق، وغسل مع عازلة الغسيل. لأداء غطاء الحمض النووي الريبي، إضافة 87 ميكرولترات من المزيج غطاء إلى أنبوب زائد H و 261 ميكرولترات إلى أنبوب H ناقص إلى resuspend. تسمية أربعة أنابيب جديدة، خمسة زائد H، خمسة ناقص H، 15 ناقص H، و 45 ناقص H، والاستغناء عن ثلاثة ميكرولترات من خمسة، 15، أو 45 نانوغرام لكل ميكرولتر تغطية الانزيم في الأنابيب المقابلة.ثم، وإعداد 12 أنابيب جديدة مع 94 ميكرولترات من وقف العازلة. ابدأ أول رد فعل متوج بإضافة 87 ميكرولترات من مجمع التهطال المعالج بـ TFIIH إلى الأنبوب المسمى خمسة زائد H.Incubate عند 30 درجة مئوية في كتلة حرارية. ردود الفعل المتوجة تحتاج إلى أن تكون دقيقة التوقيت باستخدام ساعة توقيت.عند العمل مع ردود فعل متعددة، يجب أن تكون متداخلة مرات البدء لكل رد فعل. بعد دقيقة واحدة أو اثنتين أو أربع دقائق، قم بنقل 30 ميكرولترات من خليط التفاعل الخمس بالإضافة إلى أنابيب تحمل اسم واحد واثنين وثلاثة تحتوي على 94 ميكرولترات من المخزن المؤقت لإيقاف التفاعلات. المضي قدما في تغطية ردود الفعل للعينات في أنابيب ناقص H المتبقية في نفس الطريقة تماما، وذلك باستخدام مجمعات استطالة تعامل دون TFIIH.تحليل منتجات التفاعل على هلام البولي أكريلاميد denaturing. يظهر رسم بياني هنا لجزيئات الحمض النووي والحمض النووي الريبي في مجمعات الإستطالة الاصطناعية. باستخدام أولية الحمض النووي الريبي الاصطناعية من 20 النيوكليوتيدات كما التمهيدي RNA خلال تجميع مجمعات استطالة اصطناعية، تمت إضافة النيوكليوتيدات خلال كل خطوة المشي المتعاقبة للبروتوكول لتوليد 23mer، 25mer، و 29mer.تم مقارنة ردود الفعل باستخدام البوليميراز RNA الثاني من مصادر مختلفة. تم تجميع مجمعات الاستطالة الاصطناعية مع بوليميراز من النوع البرية منقّح من إما كبد الفئران أو الخميرة الانشطارية وسار لتوليد 23مرات أو 25مرات. تم إجراء فحص لقياس وضع حد أقصى للنصوص المشعة المرتبطة بمجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على 23 نسخة من النيوكليوتيدات مع نهاية ثلاثية الفوسفات الخماسية.الممرات الماضيين تظهر منتجات ردود الفعل التي تم احتضان مجمعات الممدود مع أو بدون إنزيم في وجود TFIIH. تحتوي النطاقات المهاجرة الأكثر بطئًا وسرعة أكبر على نسخ مكتوبة ومُتغطى، على التوالي. تظهر الممرات الـ 12 الأولى وضع حد أقصى للنصوص المرتبطة بمجمعات التهطال مع CTD الفوسفورية أو غير الفوسفورية.قد تختلف أنشطة البوليميراز الثاني والإنزيمات الأخرى من الإعدادية إلى الإعدادية ، لذلك من الضروري تحسين ظروف التفاعل عن طريق المعايرة تركيزات الإنزيم لتحديد المستويات المثلى. من المهم استخدام المواد المشعة بأمان وتجنب التلوث. يرجى التأكد من اتباع المبادئ التوجيهية المختبرية والمعهد عند إجراء التجارب مع النشاط الإشعاعي.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX (Video) | JoVE

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen (Video) | JoVE

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein (Video) | JoVE

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA (Video) | JoVE

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing (Video) | JoVE

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay (Video) | JoVE

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity (Video) | JoVE

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems (Video) | JoVE

كريسبر دليل الحمض النووي الريبي استنساخ الثدييات بالأنظمة

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction (Video) | JoVE

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria (Video) | JoVE

اختبار لتحديد كمية البروتين-RNA الربط في البكتيريا

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...