Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
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我们感谢S.Shuman提供哺乳动物封顶酶cDNA。这项工作部分得到了大堪萨斯城社区基金会海伦·纳尔逊医学研究基金的资助。 本手稿的原始数据可以从 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 的 Stowers 原始数据存储库访问。

1. 人工伸长复合物和Pol II行走的组装
<ol><li>在磁珠上固定含有3'生物锡分子的非模板DNA寡聚物的1nmol。 注:可以提前完成以下步骤,为将来的实验做准备。本协议中使用的所有寡核苷酸序列均位于表1中。RNA寡聚物用5'-三磷酸修饰合成。<ol>
<li>将 200 μL 的磁珠 (10 mg/mL) 加入低蛋白结合 1.5 mL 管中,然后放在磁性机架上 2 分钟。</li>
		<li>当管位于磁性机架上时,从管中取出液体,...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

通过使用高度纯化的酶系统,可以大大促进研究,以解剖与Pol II伸长复合物耦合的事件,如RNA处理和转录伸长本身的调节。建立这种酶系统可能具有挑战性。Pol II 的启动子依赖转录至少需要五个一般转录因子。准备和储存这些因素可能需要数月时间;因此,在这个过程中的速率限制步骤往往只是准备在试管中重组基础转录所需的转录因子。
在本文中,我们描述了对以前开发的方法的?...

Eukaryotic信使RNA(mRNA)合成是一个精细的生化过程,涉及通过RNA聚合酶II合成未加工的前体RNA和加工前体RNA以产生成熟的mRNA。RNA的封盖、拼接和聚化处理步骤主要以共同转录的形式进行。Pol II 伸长复合体作为脚手架,用于招募和协调许多RNA处理酶的活动。因此,我们对成熟真核子病mRNA生成方式的最终理解将严重依赖实验系统的开发,以便对伸长复合体和调节负责共转录封顶、拼接和多吸收的酶。
毫不奇怪,这种实验系统的开发是困难的。一个主要障碍是Pol II转录本身的显著复杂性,只需通过Pol II体外重建基础转录,至少需要一组五个一般转录启动因子:TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH1.此外,在体外重组任何类型的受监管的Pol II转录需要一套更大的转录因子和共子调节器。因此,一个主要目标是开发更简单的实验系统,以便重组适合研究Pol II转录和RNA处理功能耦合的活性Pol II伸长复合物。
一种用于重组活性Pol II伸长复合物的更简单方法已被证明对拉长Pol II的结构和生化研究,以及最近用于研究共转录RNA处理2,3) 都很有用 ,4,5.在本文中,我们将展示如何有效地利用从纯化的 Pol II 和合成转录气泡制备的 Pol II 伸长复合物来研究新生 Pol II 转录的共转录封顶机制。
封顶是指在新生的Pol II成绩单的5'-三磷酸盐端共价添加5'-角苷"帽"。该上限对于mRNA成熟、传输、翻译和其他过程的后续步骤非常重要6,7。该帽由一种称为封盖酶的酶共同添加到Pol II转录本中。在哺乳动物细胞中,负责冠形酶RNA5'-三磷酸酶和甘宁醇转移酶活性的活性位点包含在单个多肽8中。封顶酶通过与Pol II体上尚未定义的表面相互作用,被招募到Pol II伸长复合体,而Rpb1卡博西终端域(CTD)在其heptapeptideSer5上所覆盖的磷酸化。在伸长复合物中,一旦新生的转录达到至少18个核苷酸的长度,并且从聚合酶RNA退出通道中出现,封顶酶催化添加5'-角苷帽。在封顶反应的第一步,三磷酸酶水解RNA 5'-三磷酸盐,产生5'-双磷酸盐。在第二步中,GTP通过甘胶转移酶水解至GMP,形成GMP封盖酶中间体。最后,甘柳转酶将GMP转移到新生转录本的5'-二磷酸盐端,以产生盖子。
封顶反应的一个显著特征是,共转录封顶(即,与功能Pol II伸长复合物相关的转录的封顶)比自由RNA5,9的封顶更有效。因此,该领域的一个主要问题是,如何通过封盖酶与Pol II伸长复合物的相互作用来实现封盖的这种戏剧性的激活。在此协议中,我们描述了仅使用纯化RNA聚合酶II和人工转录气泡的活性RNA聚合酶II伸长复合物的组装。这些方法允许创建RNA聚合酶II伸长复合物与定义的长度和序列的转录。在最近的一项研究中,我们使用这些定义的RNA聚合酶II伸长复合物作为研究RNA封盖5机制方面的模型。特别是,我们表明:(i)与这些伸长复合物相关的RNA的封顶比自由RNA的封顶效率高100倍以上,(ii)由POL II CTD的TFIIH依赖磷酸化刺激。这里描述的方法原则上可以适应生成基质,用于研究与Pol II伸长复合物相关的其他共转录RNA处理反应。
在该协议的第 1 节中,人工伸长复合物是通过将合成模板链 DNA 寡核苷酸退火到 RNA 寡核苷酸,在其 3'端与模板链 DNA 的大约 9 个核苷酸互补而创建的。然后,Pol II 被加载到 DNA:RNA 复工中。然后,通过添加部分互补、非模板链DNA寡核苷酸,在其3'端贴上生物锡标记(图1和图2A),完成伸长复合物。这些伸长复合物中的POL II扩展RNA寡核苷酸,在添加放射性标记核苷酸的适当组合后,使放射性标记转录转录记录具有定义的长度和序列。此外,使用混合使用轮回去除未结合的核苷酸和进一步添加不同的核苷酸组合,可以"行走"Pol II沿DNA模板的不同位置,并合成确定长度的RNA。然后,RNA在变性尿素-PAGE凝胶中进行纯化并进行电泳。在协议的第2节中,人工伸长复合物用于分析共转录RNA封顶。该示例介绍了 POL II CTD 的 TFIIH 依赖磷酸化对共转录RNA封顶的影响。在本实验中,我们测量共转录封顶的程度,作为封盖酶浓度(每次反应5、15和45纳克)和时间(1、2和4分钟)的函数。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

欧核酸mRNA合成是一个复杂的生化过程,需要通过多亚单位酶RNA聚合酶II将DNA模板转录到前体RNA中,并共同转录前体RNA的封顶和拼接,以形成成熟的mRNA。在mRNA合成过程中,RNA聚合酶II伸长复合物是控制其催化活性的大量转录因子以及产生成熟mRNA的封顶、拼接和3'处理酶的调控目标。由于mRNA合成固有的复杂性,更简单的实验系统能够分离和研究其不同的共转录阶段具有很大的效用。
在本文中,我们描述了一个这样一个简单的实验系统,适用于研究共转录RNA上限。该系统依赖于从纯化聚合酶和人工转录气泡中组装的已定义的RNA聚合酶II伸长复合物。当通过生物浸化DNA固定时,这些RNA聚合酶II伸长复合物提供了一个易于操作的工具,用于解剖共转录RNA封顶和机制,通过该机制,伸长复合物在共转录RNA封顶。我们预计该系统可以适应研究蛋白质或蛋白质复合物的招募和/或组装,在mRNA成熟与RNA聚合酶II伸长复合物耦合的其他阶段中发挥作用。

图2和图3显示了用于通过从不同来源延伸或Pol II来生成含有不同长度转录文的人工伸长复合物的代表性结果反应。图4描述了如何使用这些伸长复合物来测定共转录CTD磷酸化依赖性RNA封顶。
图2A是人工伸长复合物中DNA和RNA分子的图。图2B...

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Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

在这里,我们描述了RNA聚合酶II(Pol II)伸长复合物的组装,只需要短的合成DNA和RNA寡核苷酸和纯化Pol II。这些复合物可用于研究与 Pol II 伸长复合体相关的转录记录的基本机制。

用于分离共转录RNA处理事件的人工RNA聚合酶II伸长复合物

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

在这里，我们建立了一个简单的实验系统，允许重组适合研究Pol II转录和RNA封顶功能耦合的有源Pol II伸长复合物。使用这种方法，只需几个组件就可以轻松组装功能伸长复合物。伸长复合物固定在磁珠上，因此很容易改变反应条件。要固定磁珠上含有生物素的DNA寡头，首先将200微升磁珠加入低蛋白结合1.5毫升管中，然后将磁悬浮管放在磁架上两分钟。当管子在磁架上时，使用移液器将液体从管子中去除，而不会干扰磁珠。要清洗珠子，请从机架上取出管子，并加入一毫升含有三氧化三氧化、EDTA 和氯化钠的洗涤缓冲液。将管子返回到机架。两分钟后，取出洗涤液，再使用同一缓冲液的 200 微升重复洗涤两次。将磁珠重新悬浮在 400 微升 2X 缓冲器中。然后，加入380微升水和20微升10微摩尔非模板生物基化DNA寡糖混合。将管子放在螺母上，在室温下孵育30分钟。之后，使用200微升缓冲液用固定非模板DNA寡糖三次清洗珠子，然后用200微升的储存和稀释缓冲液洗涤三次。将管子在四摄氏度下过夜，用 BSA 完成珠子堵塞。第二天，丢弃溶液，将珠子重新在200微升的储存和稀释缓冲液中，达到5微摩尔的近似DNA浓度，然后用珠子将溶液转移到新管中。为了获得DNA-RNA双面体，在PCR管中准备一个10微升退火组合，其RNA-DNA摩尔比为2比1，如书面协议中所述。将管子放在热循环器中。将程序设置为 45 摄氏度，每次 5 分钟，然后是 12 个周期，每个周期为 2 分钟，从 43 摄氏度开始，每个周期温度降低 2 摄氏度。最后，保持四摄氏度的怠速。要将纯化的RNA聚合酶II加载到DNA-RNA混合物中，在管中将DNA-RNA双性复用的1微升与13微升新鲜准备的聚合酶II缓冲液混合。加入一个纯化RNA聚合酶II微升，轻轻上下移液，用移液器尖端搅拌，不产生气泡。在30摄氏度下孵育管子10分钟。要完成伸长复合物，在14微升非模板DNA缓冲液中加入一微升固定非模板DNA寡糖珠，将15微升混合物加入先前孵化的管子，并在37摄氏度下再孵育10分钟。将样品放在磁性机架上两分钟。用30微升洗涤缓冲液清洗样品一次，以去除未合成的聚合酶II和寡糖。要用RNA 23mer对伸长复合物进行放射性标记，在23微升脉冲缓冲液中加入一个ATP微升和一微升放射性标记的UTP，并将这种混合物添加到洗涤的磁珠中以重新悬浮。孵育反应10分钟，允许合成放射性标记的23mer。将含有100微摩尔ATP和100微摩尔UTP混合物的1.5微升溶液加入3.5微升的追逐缓冲液中，并将混合物加入含有珠子上预组装伸长复合物的管中。再次，孵育管5分钟，追逐所有新生的成绩单到23默。然后，将管子放在磁架上，然后像以前一样清洗，以去除未合并的核苷酸。将样品重新在 30 微升洗涤缓冲液中。要生成具有较长笔录的伸长复合物，请按照以前的程序进行扩展四倍，生成 120 微升洗涤伸长复合物，用于四种反应。标记三个新管 23mer， 25mer 和 29mer.将30微升洗涤的伸长复合物转移到23mer管中，并加入94微升含有蛋白酶K和糖原的停止混合物。将装有其余 90 微升的洗涤伸长复合物的管子放在磁架上两分钟，取出上经剂，并在 BTB 的 90 微升中重新悬浮珠子，并辅以 1.2 微升 ATP 和 CTP。在30摄氏度下孵育10分钟。用90微升洗涤缓冲液洗涤后，将30微升的伸长复合物转移到25mer管中，并加入94微升含有蛋白酶K和糖原的停止混合物。再次，将装有剩余 60 微升伸长复合物的管放在磁架上两分钟。使用 60 微升缓冲液重复 BTB 处理，并辅以 0.8 微升 ATP 和 CTP。在孵育和清洗后，将样品重新用60微升洗涤缓冲液中重新暂停。将30微升从样品转移到29mer管，并加入94微升含有蛋白酶K和糖原的停止混合物。分析变性多丙烯酰胺凝胶上的反应产品。首先，通过放大之前描述的13倍程序，生成含有23mer的洗涤伸长复合物，以获得390微升，用于12次反应和1次额外反应。为了对聚合酶 II CTD 进行磷酸化，将样品放入磁架后去除上经剂，并将珠子重新悬浮在 BTB 的 377 微升中。标注两个新管加 H 和减 H.To 加 H，以每微升 300 纳米的浓度添加转录起始因子 TFIIH 的三微升，并添加 9 微升的存储和稀释缓冲液。将 87 微升的洗涤伸长复合物添加到加 H 管中，在负 H 管中加入 261 微升。孵育管10分钟，用洗涤缓冲液清洗。要执行RNA封顶，在加H管中加入87微升封盖混合物，在负H管中加入261微升以重新暂停。标记四个新管，五加H，五减H，15减H，和45减H，并分配三微升的5，15，或45纳米每微升封盖酶到相应的管。然后，准备12个新管与94微升停止缓冲液。开始第一次封盖反应，将87微升的伸长复合物加入标有5加H.孵化的管中，在30摄氏度的高温块中处理TFIIH。使用秒表对封顶反应进行精确定时。处理多个反应时，每个反应的开始时间应交错。在一、二、四分钟后，将五加反应混合物中的30微升转移到标有一、二和三个含有94微升停止缓冲液的管子上，以停止反应。使用未 TFIIH 处理的伸长复合物，以完全相同的方式继续对剩余减 H 管中的样品进行封顶反应。分析变性多丙烯酰胺凝胶上的反应产品。此处显示了人工伸长复合物中的DNA和RNA分子的图。在人工伸长复合物的组装过程中，使用20个核苷酸的合成RNA寡糖作为RNA底因，在协议的每个连续行走步骤中加入核苷酸，生成23mer、25mer和29mer。比较了不同来源RNA聚合酶II的反应。人工伸长复合物由内源性野生型聚合酶II组装，从大鼠肝脏或裂变酵母中纯化，然后步行产生23默或25默。进行了一项检测，以测量与人工伸长复合物相关的放射性标记记录片的封顶，这些转录物包含23个核苷酸转录本，其端有5个主要三磷酸盐。最后两条通道显示了在TFIIH存在的情况下，用或不带封盖酶孵育的拉长复合物的反应产品。更缓慢和速度较慢的迁移波段分别包含封顶和未封顶的脚本。前 12 条通道显示与拉长复合物相关的与磷酸化或无磷化 CTD 相关的成绩单的封顶。聚合酶 II 和其他酶的活动可能因准备而有所不同，因此有必要通过滴定酶浓度来优化反应条件，以定义最佳水平。安全使用放射性物质和避免污染非常重要。在进行放射性实验时，请务必遵循实验室和研究所指南。

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RNA原位杂交法定量分析小鼠脑切片中的替代前 mRNA 拼接方法

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

哺乳动物系统 CRISPR 指南 RNA 克隆

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

利用南方印迹和聚合酶链反应鉴定小鼠胚胎干细胞的同源重组事件

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

定量细菌中蛋白质-RNA结合的测定

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...