Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Vi takker S. Shuman for at give den pattedyrs capping enzym cDNA. Dette arbejde blev delvist støttet af et tilskud til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelsons medicinske forskningsfond ved Greater Kansas City community Foundation.  Oprindelige data underliggende dette manuskript kan tilgås fra Stowers oprindelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. samling af kunstige elongation komplekser og Pol II Walking
<ol><li>Immobilize 1 nmol af ikke-Template DNA oligo indeholdende et 3 ' biotin molekyle på magnetiske perler. Bemærk: følgende trin kan gøres på forhånd for at forberede sig til fremtidige eksperimenter. Alle oligo-sekvenser, der anvendes i denne protokol, er angivet i tabel 1. RNA-oligoer syntetiseres med 5 '-trifosfat modifikationer.<ol>
<li>Tilsæt 200 μL magnetiske perler (10 mg/mL) til en lav-proteinbinding ...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

Undersøgelser, der har til formål at dissekere hændelser koblet til pol II-forlængelse, såsom RNA-behandling og regulering af selve transskriptionen, kan i høj grad lettes ved brug af et stærkt renset enzym system. Opsætning af sådanne enzymsystemer kan være udfordrende. Promotor-afhængig transkription af Pol II kræver mindst fem generelle transkriptionsfaktorer. Det kan tage måneder at forberede og lagre disse faktorer. Derfor er den sats-begrænsende trin i denne proces er ofte blot forbereder kadre af tra...

Eukaryotic Messenger RNA (mRNA) syntese er en udførlig biokemisk proces, der involverer syntese af en ubehandlet forløber RNA ved RNA polymerase II og behandling af forløber RNA at give den modne mRNA. RNA behandling trin af capping, splicing, og polyadenylering udføres i vid udstrækning Co-transkriptivt. Pol II-elongations komplekset fungerer som et stillads, der rekruter og organiserer aktiviteterne i mange af RNA-forarbejdnings enzymerne. Derfor vil vores ultimative forståelse af, hvordan moden eukaryote mRNAs genereres, være stærkt afhængig af udviklingen af eksperimentelle systemer for at muliggøre dissektion af de biokemiske mekanismer underliggende rekruttering til forlængelse kompleks og regulering af enzymer med ansvar for Co-transkriptional capping, splicing og polyadenylering.
Ikke overraskende har det været vanskeligt at udvikle sådanne forsøgssystemer. En væsentlig hindring har været den bemærkelsesværdige kompleksitet af Pol II-transskription selv, hvor blot rekonstitution af basal transkriptionen ved pol II in vitro kræver et minimumssæt af fem generelle transskriptions Initierings faktorer: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF og TFIIH 1. Desuden kræver en rekonstituerende type reguleret pol II-transkriptionen in vitro et endnu større sæt transkriptionsfaktorer og coregulatorer. Det har således været et vigtigt mål at udvikle enklere forsøgssystemer, der muliggør rekonstitution af aktive pol II-langstrakte komplekser, der egner sig til undersøgelser af den funktionelle kobling af Pol II-transskription og RNA-behandling.
En sådan enklere metode til rekonstitution af aktive pol II-elongations komplekser har vist sig nyttig til strukturelle og biokemiske undersøgelser af langstrakt pol II og for nylig til undersøgelse af co-transkriptional RNA-behandling2,3 ,4,5. I denne artikel viser vi, hvordan pol II-elongations komplekser fremstillet af renset pol II og syntetiske transkriptions bobler kan bruges effektivt til at undersøge de mekanismer, der underliggende Co-transkriptional capping af spirende pol II-udskrifter.
Capping refererer til den kovalente tilsætning af en 5 '-guanosin "Cap" til 5 '-trifosfat enden af spirende pol II udskrifter. Hætten er vigtig for efterfølgende trin af mRNA modning, transport, oversættelse og andre processer6,7. Den fælles landbrugspolitik tilsættes sammen transkriptivt til pol II-udskrifter af et enzym, der betegnes som capping enzym. I pattedyrsceller er aktive steder, der er ansvarlige for RNA 5 '-trifosfatase-og bundne-transferase-aktiviteterne i capping-enzymet, indeholdt i et enkelt polypeptid8. Udjævnings enzymet rekrutteres til pol II-forlængelse gennem interaktioner med endnu ikke definerede overflader på pol II-kroppen og Rpb1 carboxy-Terminal Domain (CTD) fosforyleret på Ser5 af dets heptapeptid gentager5. I forlængelse af forlængelse katalyserer enzymet enzym tilsætning af en 5 '-guanosine hætte, når den spirende afskrift når en længde på mindst 18 nukleotider og er opstået fra polymerase RNA exit Channel. I det første trin af capping reaktionen hydrolyserer trifosfatase RNA 5 '-trifosfat til at give en 5 '-diphosphat. I det andet trin hydrolyseres GTP til GMP af bundne-transferase, der danner en GMP-capping enzym mellemprodukt. Endelig, bundne transferase overfører GMP til 5 '-difosfat enden af den spirende transkriptet til at producere hætten.
Et bemærkelsesværdigt træk ved udjævningen reaktion er, at co-transkriptional capping (dvs. capping af udskrifter forbundet med funktionelle pol II forlængelse komplekser) er langt mere effektiv end capping af frie RNA5,9. Således har et stort spørgsmål i marken været, hvordan denne dramatiske aktivering af capping opnås gennem interaktioner af capping enzym med pol II forlængelse kompleks. I denne protokol beskriver vi samlingen af aktive RNA polymerase II-forlængelse komplekser ved hjælp af kun renset RNA polymerase II og kunstige transkriptionsbobler. Disse metoder tillader oprettelse af RNA polymerase II forlængelse komplekser med transkriptioner af definerede længde og sekvens. I en nylig undersøgelse, vi brugte disse definerede RNA polymerase II forlængelse komplekser som en model for at undersøge aspekter af mekanismerne i RNA capping5. Især viste vi, at (i) capping af RNA associeret med disse forlængelse komplekser var mere end 100-fold mere effektiv end capping af frie RNA og (II) blev stimuleret af TFIIH-afhængige fosforylering af Pol II CTD. Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, kunne i princippet tilpasses til at generere substrater til at studere andre Co-transkriptionelle RNA-behandlingsreaktioner forbundet med pol II-forlængelse.
I afsnit 1 i denne protokol, kunstige forlængelse komplekser er skabt ved udglødning en syntetisk skabelon streng DNA oligonukleotid til en RNA oligonukleotid, der supplerer den 3 '-ende til ca 9 nukleotider af Template streng DNA. Pol II indlæses derefter på DNA: RNA duplex. Forlængelse af forlængelse-komplekset suppleres med et delvist komplementært, ikke-skabelonelt DNA-oligonukleotid, der er mærket med biotin ved 3 '-enden (figur 1 og figur 2a). RNA-oligonukleotid forlænges af Pol II i disse forlængede komplekser for at fremstille radioaktivt mærkede udskrifter af defineret længde og sekvens ved tilsætning af passende kombinationer af radioaktivt mærkede nukleotider. Hertil kommer, ved hjælp af en kombination af skyller til at fjerne uindarbejdet nukleotider og yderligere tilsætning af forskellige kombinationer af nukleotider, kan man "gå" Pol II til forskellige positioner langs DNA-skabelon og syntetisere RNA af definerede længder. RNA renses derefter og udsættes for elektroforese i denaturering af urea-side geler. I afsnit 2 i protokollen, kunstige forlængelse komplekser anvendes til at analysere Co-transkriptional RNA capping. Eksemplet præsenterede virkningen af TFIIH-afhængig fosforylering af Pol II CTD på Co-transkriptional RNA-capping. I dette eksperiment måler vi omfanget af co-transkriptionelle capping som en funktion af capping enzym koncentration (5, 15 og 45 ng pr. reaktion) og tid (1, 2 og 4 min).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

Eukaryotic mRNA syntese er en kompleks biokemisk proces, der kræver transskription af en DNA-skabelon til en forløber RNA ved multi-subunit enzym RNA polymerase II og co-transkriptional capping og splejsning af forløberen RNA til dannelse af moden mRNA. Under mRNA syntese, RNA polymerase II forlængelse kompleks er et mål for regulering af en stor samling af transkriptionsfaktorer, der styrer sin katalytiske aktivitet, samt capping, splicing, og 3 '-Processing enzymer, der skaber den modne mRNA. På grund af den iboende kompleksitet mRNA syntese, enklere eksperimentelle systemer muliggør isolation og undersøgelse af sine forskellige co-transkriptionelle etaper har stor nytte.
I denne artikel beskriver vi et sådant simpelt eksperimentelt system, som er egnet til at undersøge Co-transkriptional RNA-capping. Dette system er baseret på definerede RNA polymerase II forlængelse komplekser samlet fra renset polymerase og kunstige transkriptionsbobler. Når disse RNA polymerase II-komplekser er immobiliseret via biotinyleret DNA, giver de et let manipulabelt værktøj til dissekering af co-transkriptional RNA-capping og-mekanismer, hvorved forlængelse af langstrakte rekrutte og regulerer capping enzym under Co-transkriptional RNA capping. Vi forventer, at dette system kan tilpasses til at studere rekruttering og/eller samling af proteiner eller protein komplekser med roller i andre stadier af mRNA modning koblet til RNA polymerase II forlængelse kompleks.

Figur 2 og 3 viser repræsentative resultat reaktioner, der anvendes til at generere kunstige langstrakte komplekser, der indeholder udskrifter af forskellig længde ved at udvide eller pol II fra forskellige kilder. Figur 4 viser, hvordan disse forlængelse komplekser kan bruges til at assay Co-transkriptional CTD fosforylering-afhængige RNA capping.
<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Her beskriver vi samlingen af RNA polymerase II (pol II) langstrakte komplekser, der kun kræver korte syntetiske DNA og RNA-oligonukleotider og renset pol II. Disse komplekser er nyttige til at studere mekanismer underliggende Co-transkriptional behandling af udskrifter i forbindelse med pol II forlængelse kompleks.

Kunstige RNA polymerase II forlængede komplekser til dissekering af co-transkriptionelle RNA-behandlings hændelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Her har vi etableret et simpelt eksperimentelt system, der giver mulighed for rekonstitution af aktive Pol II forlængelseskomplekser egnet til at undersøge den funktionelle kobling af Pol II transskription og RNA capping. Med denne metode kan funktionelle forlængelseskomplekser nemt samles med nogle få komponenter. Forlængelseskomplekserne er immobiliseret på magnetiske perler, så det er nemt at ændre reaktionsbetingelserne.For at immobilisere DNA oligo indeholdende biotin på magnetiske perler, først tilføje 200 mikroliter af magnetiske perler til en lav-protein bindende 1,5-milliliter rør, og derefter placere røret på en magnetisk rack i to minutter. Mens røret er på den magnetiske rack, skal du bruge en pipette til at fjerne væsken fra røret uden at forstyrre perlerne. For at vaske perlerne, skal du fjerne røret fra risten, og tilsæt en milliliter vaskebuffer indeholdende Tris-hydrochlorid, EDTA og natriumchlorid.Returner røret til stativet. Efter to minutter fjernes vaskeopløsningen, og vaskerne gentages to gange mere med 200 mikroliter af samme buffer. Opsaltning af de magnetiske perler i 400 mikroliter af 2X buffer.Derefter tilsættes 380 mikroliter vand og 20 mikroliter af 10-mikromolar ikke-skabelon biotinyleret DNA oligo at blande. Anbring røret på en møtrik, og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes perlerne med immobiliseret dna-oligo, der ikke er skabelon, tre gange ved hjælp af 200 mikroliter buffer og derefter tre gange med 200 mikroliter opbevaring og fortyndingsbuffer.Opbevar røret ved fire grader Celsius natten over for at afslutte blokering af perlerne med BSA. Den næste dag kasseres opløsningen, opslæmper perlerne i 200 mikroliter af opbevaring og fortyndingsbuffer for at nå en omtrentlig DNA-koncentration på fem mikromolar, og overfør derefter opløsningen med perlerne til et nyt rør. For at opnå DNA-RNA duplex, forberede en 10-mikroliter glødning mix i en PCR rør med en to-til-en RNA-DNA molar forhold, som beskrevet i den skriftlige protokol.Rørret i en termisk cykelr. Indstil programmet til 45 grader Celsius i fem minutter, efterfulgt af 12 cyklusser på to minutter hver, startende ved 43 grader Celsius og reducere temperaturen med to grader Celsius per cyklus. Endelig holde det tomgang på fire grader Celsius.For at indlæse renset RNA polymerase II på DNA-RNA hybrid, bland en mikroliter AF DNA-RNA duplex med 13 mikroliter frisklavet polymerase II buffer i et rør. Tilsæt en mikroliter af renset RNA polymerase II, og bland ved forsigtigt pipettering op og ned og omrøring med pipettespidsen, uden at indføre bobler. Inkuber røret i 10 minutter ved 30 grader Celsius.For at fuldføre forlængelseskomplekset skal du tilføje en mikroliter af immobiliserede dna-oligoperler, der ikke er skabelon, til 14 mikroliter af ikke-skabelon-DNA-buffer, tilsæt 15-mikroliterblandingen til det tidligere inkuberede rør og inkuber den i yderligere 10 minutter ved 37 grader Celsius. Prøven anbringes på magnetholderen i to minutter. Prøven vaskes én gang med 30 mikroliter vaskebuffer for at fjerne personlig polymerase II og oligos.For at røntgenmærke forlængelseskomplekserne med RNA 23mers skal der tilsættes en mikroliter ATP og en mikroliter af radioaktivt mærket UTP til 23 mikroliter af pulsbuffer, og tilsæt denne blanding til de vaskede magnetiske perler for at resuspendre. Inkuber reaktionen i 10 minutter for at tillade syntese af radioaktivt mærket 23mers. Der tilsættes 1,5 mikroliter opløsning, der indeholder 100 mikromolar ATP og 100-mikromolar UTP-blanding, til 3,5 mikroliter chase buffer, og tilsæt blandingen til røret, der indeholder formonterede langstrakt forlængelseskomplekser på perler.Igen, inkubere røret i fem minutter for at jage alle spirende udskrifter i 23mers. Derefter placere røret på den magnetiske rack, og vask som tidligere for at fjerne unincorporated nukleotider. Prøven opsplites i 30 mikroliter vaskebuffer.For at generere forlængelseskomplekser med længere udskrifter skal du følge de tidligere procedurer og skalere fire gange op for at generere 120 mikroliter af vaskede forlængelseskomplekser for fire reaktioner. Mærk tre nye rør 23mer, 25mer og 29mer. Overfør 30 mikroliter af vaskede forlængelseskomplekser til 23merrøret, og der tilsættes 94 mikroliter stopblanding indeholdende proteinase K og glykogen.Placer røret, der indeholder de resterende 90 mikroliter af vaskede forlængelseskomplekser på den magnetiske rack i to minutter, fjern supernatanten, og resuspenderede perler i 90 mikroliter BTB suppleret med 1,2 mikroliter ATP og CTP. Inkuber i 10 minutter ved 30 grader Celsius. Efter vask med 90 mikroliter af vaskepude overføres 30 mikroliter af forlængelseskomplekser til 25merrøret, og der tilsættes 94 mikroliter stopblanding indeholdende proteinase K og glykogen.Igen, placere røret indeholder de resterende 60 mikroliter af forlængelse komplekser på den magnetiske rack i to minutter. Gentag BTB-behandlingen med 60 mikroliter buffer suppleret med 0,8 mikroliter ATP og CTP. Efter inkubation og vask som gjort før opslæmning prøven i 60 mikroliter af vask buffer.Overfør 30 mikroliter fra prøven til 29merrøret, og der tilsættes 94 mikroliter stopblanding indeholdende proteinase K og glykogen. Analysér reaktionsprodukter på en denaturering af polyacrylamidgel. Først generere vasket forlængelse komplekser, der indeholder 23mers ved at skalere op 13-fold den tidligere beskrevne procedure for at opnå 390 mikroliter for 12 reaktioner og en ekstra.For at udføre fosforylering af polymerase II CTD fjernes supernatanten efter at have placeret prøven i den magnetiske rist og opsbrugt perlerne i 377 mikroliter BTB. Mærke to nye rør plus H og minus H.To plus H, tilsæt tre mikroliter af transskriptionsstartfaktor TFIIH ved koncentrationen af 300 nanogram pr. mikroliter, og til minus H tilsættes ni mikroliter af opbevarings- og fortyndingsbuffer. Der tilsættes 87 mikroliter af de vaskede forlængelseskomplekser til plus H-røret og 261 mikroliter til minus H-røret.Inkuber rørene i 10 minutter, og vask med vaskebuffer. For at udføre RNA-capping tilsættes 87 mikroliter capping mix til plus H-røret og 261 mikroliter til minus H-røret for at resuspendre. Mærke fire nye rør, fem plus H, fem minus H, 15 minus H og 45 minus H, og dispensere tre mikroliter på fem, 15 eller 45 nanogram pr. mikroliterknzym i de tilsvarende rør.Derefter forberede 12 nye rør med 94 mikroliter af stop buffer. Start den første capping reaktion ved at tilføje 87 mikroliter af forlængelse kompleks behandlet med TFIIH til røret mærket fem plus H.Incubate ved 30 grader Celsius i en varmeblok. De capping reaktioner skal være præcist timet ved hjælp af et stopur.Når du arbejder med flere reaktioner, skal starttiderne for hver reaktion forskudt. Efter et, to eller fire minutter overføres 30 mikroliter af fem plusreaktionsblandingen til rør mærket et, to og tre, der indeholder 94 mikroliter stopbuffer, for at stoppe reaktionerne. Fortsætter med capping reaktioner for prøverne i de resterende minus H rør på nøjagtig samme måde, ved hjælp af forlængelse komplekser behandlet uden TFIIH.Analysér reaktionsprodukter på en denaturering af polyacrylamidgel. Her vises et diagram for DNA- og RNA-molekyler i kunstige forlængelseskomplekser. Ved hjælp af den syntetiske RNA oligo af 20 nukleotider som RNA-primer under montering af de kunstige forlængelseskomplekser blev der tilføjet nukleotider under hvert sekventielt trin i protokollen for at generere en 23mer, en 25mer og en 29mer.Reaktioner, der anvendte RNA polymerase II fra forskellige kilder, blev sammenlignet. Kunstige forlængelseskomplekser blev samlet med endogene, vilde polymerase II renset fra enten rottelever eller fissionsgær og gik til at generere 23mers eller 25mers. En analyse blev udført for at måle udjævning af radioaktivt mærkede udskrifter forbundet med kunstige forlængelse komplekser, der indeholder 23 nukleotid udskrifter med en fem-prime tripfosfat ende.De sidste to baner viser produkter af reaktioner, hvor forlængelse komplekser blev inkuberet med eller uden capping enzym i overværelse af TFIIH. Jo langsommere og hurtigere migrerende bands indeholder henholdsvis udjævnede og ikke-udjævnede udskrifter. De første 12 baner viser udjævning af udskrifter forbundet med forlængelse komplekser med enten en fosforyleret eller uphosphorylated CTD.Aktiviteterne i polymerase II og andre enzymer kan variere fra prep til prep, så det er nødvendigt at optimere reaktionsbetingelserne ved at titrere enzymkoncentrationer for at definere optimale niveauer. Det er vigtigt at bruge radioaktivt materiale sikkert og for at undgå forurening. Sørg for at følge retningslinjerne for laboratorie og institut, når du udfører eksperimenter med radioaktivitet.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-medieret Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kvantitative opdagelse af RNA-afhængige RNA Polymerase aktivitet af menneskelige Telomerase Reverse transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down Procedure til identifikation af en længe ikke-kodende RNA RNA mål

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metaboliske mærkning med 4-thiouracil og kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning for pattedyr systemer

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse til kvantificering af protein-RNA-binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...