Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

We bedanken S. Shuman voor het leveren van het zoogdier capping enzym cDNA. Dit werk werd deels gesteund door een subsidie aan het Stowers Institute for Medical Research van het Helen Nelson Medical Research Fund bij de Greater Kansas City Community Foundation.  Originele gegevens die aan dit manuscript zijn gelinkt, kunnen worden geraadpleegd vanuit de Stowers Original data repository op http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. assemblage van kunstmatige rek complexen en Pol II Walking
<ol><li>Immobiliseer 1 nmol van non-template DNA oligo met een 3 ' Biotine molecuul op magnetische kralen. Opmerking: de volgende stappen kunnen vooraf worden uitgevoerd om u voor te bereiden op toekomstige experimenten. Alle in dit Protocol gebruikte oligo-sequenties zijn beschikbaar in tabel 1. RNA oligos worden gesynthetiseerd met 5 '-trifosfaat modificaties.<ol>
<li>Voeg 200 μL magnetische kralen (10 mg/mL) toe aan e...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

Studies die zijn gericht op het ontleden van gebeurtenissen gekoppeld aan het Pol II rekcomplex zoals RNA verwerking en regulatie van de transcriptie verlenging zelf kunnen sterk worden vergemakkelijkt door het gebruik van een zeer gezuiverd enzymsysteem. Het opzetten van dergelijke enzym systemen kan een uitdaging zijn. Door de organisator afhankelijke transcriptie van Pol II zijn ten minste vijf algemene transcriptiefactoren vereist. Voorbereiding en inventarisatie van deze factoren kan maanden duren; Vandaar dat de sn...

Eukaryotische boodschapper RNA (mRNA) synthese is een uitgebreid biochemisch proces waarbij synthese van een onverwerkte precursor RNA door RNA polymerase II en verwerking van de precursor RNA om de volwassen mRNA te leveren. De RNA-verwerkingsstappen van capping, splicing en polyadenylering worden grotendeels co-transcriptioneel uitgevoerd. Het Pol II rek complex fungeert als een steiger die de activiteiten van veel van de RNA-verwerkings enzymen aanwerkent en organiseert. Bijgevolg zal ons uiteindelijke begrip van hoe volwassen eukaryotische Mrna's worden gegenereerd, sterk afhangen van de ontwikkeling van experimentele systemen om een dissectie van de biochemische mechanismen die onderliggende rekrutering voor het rek complex te maken en regulatie van enzymen die verantwoordelijk zijn voor co-transcriptionele capping, splicing en polyadenylering.
Het is niet verrassend dat de ontwikkeling van dergelijke experimentele systemen moeilijk is geweest. Een belangrijke belemmering is de opmerkelijke complexiteit van de Pol II-transcriptie zelf, waarbij het simpelweg reconstitueren van basale transcriptie door Pol II in vitro een minimumreeks van vijf algemene transcriptie initiatie factoren vereist: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF en TFIIH 1. Bovendien vereist het reconstitueren van elke vorm van gereguleerde Pol II-transcriptie in vitro een nog grotere reeks transcriptiefactoren en coregulatoren. Zo is een belangrijk doel geweest om eenvoudigere experimentele systemen te ontwikkelen die de reconstitutie van actieve Pol II-rek complexen mogelijk maken, geschikt voor onderzoek naar de functionele koppeling van Pol II-transcriptie en RNA-verwerking.
Een dergelijke eenvoudigere methode voor het reconstitueren van actieve Pol II-rek complexen is nuttig gebleken voor structurele en biochemische studies van het verlengen van Pol II en, meer recentelijk, voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-verwerking2,3 ,4,5. In dit artikel laten we zien hoe Pol II rek complexen bereid uit gezuiverde Pol II en synthetische transcriptie bellen effectief kunnen worden gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de co-transcriptionele capping van ontluikende Pol II transcripten.
Capping verwijst naar de covalente toevoeging van een 5 '-Guanosine "dop" aan de 5 '-trifosfaat einde van ontluikende Pol II transcripten. Het GLB is belangrijk voor de volgende stappen van mRNA rijping, transport, vertaling, en andere processen6,7. Het GLB wordt co-transcriptioneel toegevoegd aan Pol II transcripten door een enzym dat "capping enzyme" wordt genoemd. In zoogdiercellen zijn actieve sites die verantwoordelijk zijn voor de RNA 5 '-trifosfatase en guanylyl transferase-activiteiten van het capping enzym opgenomen in één polypeptide8. Het capping enzym wordt gerekruteerd naar het Pol II rek complex door middel van interacties met nog te definiëren oppervlakken op het Pol II lichaam en de Rpb1 Carboxy-terminale domein (CTD) fosforyleerd op Ser5 van zijn heptapeptide herhalingen5. In het rek complex, het capping enzym katalyseert toevoeging van een 5 '-Guanosine Cap zodra de ontluikende transcriptie bereikt een lengte van ten minste 18 nucleotiden en is voortgekomen uit de polymerase RNA uitgang kanaal. In de eerste stap van de capping reactie hydrolyseert de trifosfatase het RNA 5 '-trifosfaat om een 5 '-difosfaat te leveren. In de tweede stap wordt GTP gehydrolyseerd tot GMP door de guanylyl transferase, die een GMP-capping enzym intermediair vormt. Ten slotte brengt de guanylyl transferase GMP over naar het 5 '-difosfaat einde van de ontluikende transcriptie om het GLB te produceren.
Een opmerkelijk kenmerk van de capping reactie is dat co-transcriptionele capping (d.w.z. het afdekken van transcripten geassocieerd met functionele Pol II-rek complexen) veel efficiënter is dan het afdekken van vrij RNA5,5. Zo is een belangrijke vraag in het veld geweest hoe deze dramatische activering van capping wordt bereikt via interacties van het capping-enzym met het Pol II-rekcomplex. In dit protocol beschrijven we de assemblage van actieve RNA polymerase II rek complexen met alleen gezuiverde RNA polymerase II en kunstmatige transcriptie bubbels. Deze methoden maken het creëren van RNA polymerase II rek complexen met transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie mogelijk. In een recente studie, gebruikten we deze gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen als een model voor het onderzoeken van aspecten van de mechanismen van RNA capping5. In het bijzonder toonden we aan dat (i) het afdekken van RNA in verband met deze rek complexen meer dan 100-voudig efficiënter was dan het afdekken van vrij RNA en (II) werd gestimuleerd door TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD. De hier beschreven aanpak kan in principe worden aangepast om substraten te genereren voor het bestuderen van andere co-transcriptionele RNA-verwerkings reacties die verband houden met het Pol II-rek complex.
In sectie 1 van dit protocol worden kunstmatige rek complexen gemaakt door het gloeien van een synthetisch sjabloononderdeel DNA oligonucleotide op een RNA-oligonucleotide dat complementair is aan 3 '-end tot ongeveer 9 nucleotiden van het template-strand-DNA. Pol II wordt vervolgens op het DNA: RNA duplex geladen. Het rekcomplex wordt vervolgens aangevuld door toevoeging van een gedeeltelijk aanvullend, niet-template-strand-DNA-oligonucleotide dat met biotine wordt aangeduid op 3 '-end (Figuur 1 en Figuur 2a). Het RNA-oligonucleotide wordt door Pol II in deze rek-complexen verlengd om van transcripten van gedefinieerde lengte en sequentie te maken bij toevoeging van geschikte combinaties van van-nucleotiden. Bovendien, met behulp van een combinatie van wassingen te verwijderen van de rechtsgebied nucleotiden en verdere toevoeging van verschillende combinaties van nucleotiden, men kan "lopen" Pol II naar verschillende posities langs de DNA-sjabloon en synthetiseren van RNA van gedefinieerde lengtes. RNA wordt vervolgens gezuiverd en onderworpen aan elektroforese in denaturerende ureum-pagina gels. In sectie 2 van het protocol worden kunstmatige rek complexen gebruikt om co-transcriptionele RNA-capping te analyseren. Het gepresenteerde voorbeeld meet het effect van de TFIIH-afhankelijke fosforylering van de Pol II CTD op co-transcriptionele RNA-capping. In dit experiment meten we de mate van co-transcriptionele capping als een functie van capping enzym concentratie (5, 15 en 45 ng per reactie) en tijd (1, 2 en 4 min).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

Eukaryotische mRNA-synthese is een complex biochemisch proces dat transcriptie van een DNA-template vereist in een precursor RNA door de multi-subunit enzym RNA polymerase II en co-transcriptionele capping en splicing van de precursor RNA om de volwassen mRNA te vormen. Tijdens de mRNA-synthese is het RNA polymerase II rek complex een doelwit voor regulering door een grote verzameling van transcriptiefactoren die de katalytische werking beheersen, evenals de capping, splicing en 3 '-processing enzymen die de volwassen mRNA creëren. Vanwege de inherente complexiteit van mRNA synthese, eenvoudigere experimentele systemen waardoor isolatie en onderzoek van de verschillende co-transcriptionele stadia hebben grote nut.
In dit artikel beschrijven we een dergelijk eenvoudig experimenteel systeem dat geschikt is voor het onderzoeken van co-transcriptionele RNA-capping. Dit systeem is gebaseerd op gedefinieerde RNA polymerase II rek complexen geassembleerd van gezuiverde polymerase en kunstmatige transcriptie bubbels. Wanneer geïmmobiliseerd via biotinyleerd DNA, deze RNA polymerase II rek complexen bieden een gemakkelijk losse tool voor het ontleden van co-transcriptionele RNA capping en mechanismen waarmee de rek complex rekruteert en regelt capping enzym tijdens Co-transcriptionele RNA-capping. We verwachten dat dit systeem kan worden aangepast voor het bestuderen van werving en/of assemblage van eiwitten of eiwitcomplexen met rollen in andere stadia van mRNA-rijping gekoppeld aan het RNA polymerase II-rek complex.

Figuren 2 en 3 vertonen representatieve resultaat reacties die worden gebruikt om kunstmatige rek complexen te genereren met transcripties van verschillende lengtes door uitbreiding of Pol II uit verschillende bronnen. Figuur 4 toont hoe deze rek-complexen kunnen worden gebruikt om co-transcriptionele CTD-fosforylering-afhankelijke RNA-capping te testen.
<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Hier hebben we een eenvoudig experimenteel systeem opgezet dat de reconstructie mogelijk maakt van actieve Pol II-rekcomplexen die geschikt zijn voor het onderzoeken van de functionele koppeling van Pol II-transcriptie en RNA-aftopping. Met deze methode kunnen functionele rekcomplexen eenvoudig worden geassembleerd met slechts een paar componenten. De rekcomplexen zijn geïmmobiliseerd op magnetische kralen, zodat het gemakkelijk is om reactieomstandigheden te veranderen.Om DNA oligo met biotine op magnetische kralen te immobiliseren, voeg je eerst 200 microliter magnetische kralen toe aan een eiwitarme binding van 1,5 milliliter en plaats je de buis vervolgens twee minuten op een magnetisch rek. Terwijl de buis op het magnetische rek, gebruik een pipet om de vloeistof te verwijderen uit de buis zonder verstoring van de kralen. Om de kralen te wassen, verwijder de buis uit het rek, en voeg een milliliter wasbuffer met Tris-hydrochloride, EDTA, en natriumchloride.Breng de buis terug naar het rek. Na twee minuten verwijdert u de wasoplossing en herhaalt u de wasbeurten nog twee keer met 200 microliter van dezelfde buffer. Resuspend de magnetische kralen in 400 microliters van 2X buffer.Voeg vervolgens 380 microliter water en 20 microliter van 10 micromolar niet-sjabloon biotinylated DNA oligo toe om te mengen. Plaats de buis op een nutator, en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Daarna, was de kralen met geïmmobiliseerde niet-sjabloon DNA oligo drie keer met behulp van 200 microliters van buffer en vervolgens drie keer met 200 microliters van opslag en verdunning buffer.Bewaar de buis op vier graden Celsius 's nachts om te eindigen met het blokkeren van de kralen met BSA. De volgende dag, gooi de oplossing, resuspend de kralen in 200 microliters van opslag en verdunning buffer, om een geschatte DNA-concentratie van vijf micromolar te bereiken, en vervolgens de overdracht van de oplossing met de kralen naar een nieuwe buis. Om de DNA-RNA duplex te verkrijgen, moet u een 10-microliter annealing mix in een PCR-buis voorbereiden met een twee-op-een RNA-DNA-molaire verhouding, zoals beschreven in het geschreven protocol.Plaats de buis in een thermische cycler. Stel het programma vijf minuten in op 45 graden Celsius, gevolgd door 12 cycli van elk twee minuten, beginnend bij 43 graden Celsius en het verlagen van de temperatuur met twee graden Celsius per cyclus. Tot slot, houd het stationair op vier graden Celsius.Om gezuiverde RNA polymerase II op de DNA-RNA hybride te laden, mengt u één microliter DNA-RNA duplex met 13 microliters van vers bereide polymerase II buffer in een buis. Voeg een microliter gezuiverde RNA polymerase II toe en meng door zachtjes op en neer te pipetten en te roeren met de pipetpunt, zonder bellen te introduceren. Broed de buis 10 minuten in bij 30 graden Celsius.Om het rekcomplex te voltooien, voegt u een microliter van geïmmobiliseerde niet-sjabloon DNA-oligokralen toe aan 14 microliter van niet-sjabloon-DNA-buffer, voegt u het mengsel van 15 microliter toe aan de eerder geïncmobileerde buis en ontcunelijk het nog 10 minuten bij 37 graden Celsius. Plaats het monster twee minuten op het magneetrek. Was het monster één keer met 30 microliter wasbuffers om ongeordende polymerase II en oligo's te verwijderen.Om de rekcomplexen met RNA 23mers te radiolabelen, voeg je één microliter ATP en één microliter radioactief gelabelde UTP toe aan 23 microliters pulsbuffer, en voeg dit mengsel toe aan de gewassen magnetische kralen om opnieuw op te stellen. Broed de reactie gedurende 10 minuten om de synthese van radiogelabelde 23mers mogelijk te maken. Voeg 1,5 microliter oplossing toe met 100 micromolar ATP en 100 micromolar UTP-mix tot 3,5 microliter chase buffer en voeg het mengsel toe aan de buis met voorgemonteerde langwerpcomplexen op kralen.Nogmaals, broeden de buis voor vijf minuten om alle ontluikende transcripties jagen in 23mers. Plaats vervolgens de buis op het magnetische rek en was zoals eerder werd gedaan om niet-opgenomen nucleotiden te verwijderen. Resuspend het monster in 30 microliter van wasbuffer.Om rekcomplexen met langere transcripties te genereren, volg je de vorige procedures en schaal je viervoudig op om 120 microliters van gewassen rekcomplexen te genereren voor vier reacties. Label drie nieuwe buizen 23mer, 25mer en 29mer. Breng 30 microliter gewassen rekcomplexen over naar de 23mer buis en voeg 94 microliter stopmix toe met proteinase K en glycogeen.Plaats de buis met de resterende 90 microliter gewassen rekcomplexen gedurende twee minuten op het magnetische rek, verwijder de supernatant en zet kralen opnieuw op in 90 microliter BTB, aangevuld met 1,2 microliter ATP en CTP. Incubeer gedurende 10 minuten bij 30 graden Celsius. Breng na het wassen met 90 microliter wasbuffers 30 microliter rekcomplexen over naar de 25mer buis en voeg 94 microliter stopmix toe met proteinase K en glycogeen.Nogmaals, plaats de buis met de resterende 60 microliters van rekcomplexen twee minuten op het magnetische rek. Herhaal de BTB-behandeling met 60 microliter buffer aangevuld met 0,8 microliter ATP en CTP. Na incubatie en wassen zoals eerder gedaan, resuspend het monster in 60 microliters van wasbuffer.Breng 30 microliter van het monster naar de 29mer buis, en voeg 94 microliter van stop mix met proteinase K en glycogeen. Analyseer reactieproducten op een denaturering polyacrylamide gel. Ten eerste, genereren gewassen rekcomplexen met 23mers door het opschalen van 13-voudige de procedure eerder beschreven om 390 microliters te verkrijgen voor 12 reacties en een extra.Om fosforylatie van polymerase II CTD uit te voeren, verwijdert u de supernatant na het plaatsen van het monster in het magnetische rek en resuspend de kralen in 377 microliter van BTB. Label twee nieuwe buizen plus H en min H.To plus H, voeg drie microliters van transcriptie initiatie factor TFIIH bij de concentratie van 300 nanogram per microliter, en tot min H, voeg negen microliters van opslag en verdunning buffer. Voeg 87 microliter van de gewassen rekcomplexen toe aan de plus H-buis en 261 microliters aan de minus H-buis.Incubeer de buizen gedurende 10 minuten en was met wasbuffer. Om RNA-aftopping uit te voeren, voegt u 87 microliter aftoppingsmix toe aan de plus H-buis en 261 microliters aan de minus H-buis om opnieuw te worden opgetrokken. Label vier nieuwe buizen, vijf plus H, vijf min H, 15 min H en 45 min H, en geef drie microliters van vijf, 15 of 45 nanogram per microliter aftoppingenzym in de overeenkomstige buizen.Bereid vervolgens 12 nieuwe buizen met 94 microliter stopbuffer. Start de eerste aftopping reactie door het toevoegen van 87 microliters van rekcomplex behandeld met TFIIH aan de buis gelabeld vijf plus H.Incubate op 30 graden Celsius in een warmteblok. De aftopping reacties moeten precies worden getimed met behulp van een stopwatch.Bij het werken met meerdere reacties moeten de begintijden voor elke reactie worden gespreid. Na een, twee of vier minuten, overdracht 30 microliter van de vijf plus reactie mengsel naar buizen gelabeld een, twee, en drie met 94 microliter stop buffer om de reacties te stoppen. Ga verder met het afdekken van reacties voor de monsters in de resterende minus H-buizen op precies dezelfde manier, met behulp van rekcomplexen behandeld zonder TFIIH.Analyseer reactieproducten op een denaturering polyacrylamide gel. Een diagram wordt hier getoond voor DNA- en RNA-moleculen in kunstmatige rekcomplexen. Met behulp van de synthetische RNA oligo van 20 nucleotiden als de RNA primer tijdens de assemblage van de kunstmatige rekcomplexen, werden nucleotiden toegevoegd tijdens elke opeenvolgende loopstap van het protocol om een 23mer, een 25mer en een 29mer te genereren.Reacties met RNA polymerase II uit verschillende bronnen werden vergeleken. Kunstmatige rekcomplexen werden geassembleerd met endogene polymerase II van het wildtype gezuiverd uit rattenlever of splijtingsgist en liepen om 23mers of 25mers te genereren. Een test werd uitgevoerd om aftopping van radiogelabelde transcripties in verband met kunstmatige rek complexen met 23 nucleotide transcripten met een vijf-prime triphosfate einde te meten.De laatste twee rijstroken tonen de producten van reacties waarbij rekcomplexen werden geïncubeerd met of zonder aftoppingsenzym in aanwezigheid van TFIIH. De meer langzaam en sneller migrerende banden bevatten afgetopte en niet-afgetopte transcripties, respectievelijk. De eerste 12 rijstroken tonen aftopping van transcripties in verband met rekcomplexen met een fosforyleerde of onfosforylated CTD.Activiteiten van polymerase II en andere enzymen kunnen variëren van prep tot prep, dus het is noodzakelijk om reactieomstandigheden te optimaliseren door enzymconcentraties te titreren om optimale niveaus te definiëren. Het is belangrijk om radioactief materiaal veilig te gebruiken en besmetting te voorkomen. Zorg ervoor dat u uw laboratorium- en instituutsrichtlijnen volgt bij het doen van experimenten met radioactiviteit.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR gids RNA klonen voor zoogdieren systemen

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...