Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
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Wir danken S. Shuman für die Bereitstellung des Säugetier-Verschlussenzyms cDNA. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium des Helen Nelson Medical Research Fund der Greater Kansas City Community Foundation an das Stowers Institute for Medical Research unterstützt.  Originaldaten, die diesem Manuskript zugrunde liegen, können über das Stowers Original Data Repository unter http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 abgerufen werden.

1. Montage von Künstlichen Dehnungskomplexen und Pol II Walking
<ol><li>Immobilisieren Sie 1 nmol nicht-template DNA Oligo enthält ein 3' BiotinMolekül auf magnetischen Perlen. HINWEIS: Die folgenden Schritte können im Voraus durchgeführt werden, um sich auf zukünftige Experimente vorzubereiten. Alle in diesem Protokoll verwendeten Oligosequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt. RNA-Oligos werden mit 5'-Triphosphat-Modifikationen synthetisiert.<ol>
<li>Fügen Sie 200 l magnetisch...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

Studien, die Ereignisse, die mit dem Pol II-Dehnungskomplex gekoppelt sind, wie die RNA-Verarbeitung und die Regulation der Transkriptdehnung selbst, sezieren sollen, können durch den Einsatz eines hochgereinigten Enzymsystems erheblich erleichtert werden. Der Aufbau solcher Enzymsysteme kann eine Herausforderung sein. Die durch den Veranstalter abhängige Transkription durch Pol II erfordert mindestens fünf allgemeine Transkriptionsfaktoren. Die Vorbereitung und Lagerung dieser Faktoren kann Monate dauern; Daher ist d...

Die eukaryotische Boten-RNA-Synthese (mRNA) ist ein ausgeklügelter biochemischer Prozess, der die Synthese einer unverarbeiteten Vorläufer-RNA durch RNA-Polymerase II und die Verarbeitung der Vorläufer-RNA umfasst, um die ausgereifte mRNA zu erhalten. Die RNA-Verarbeitungsschritte der Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung werden weitgehend ko-transkriptional durchgeführt. Der Dehnungskomplex Pol II dient als Gerüst, das die Aktivitäten vieler RNA-Verarbeitungsenzyme rekrutiert und orchestriert. Folglich wird unser endgültiges Verständnis, wie ausgereifte eukaryotische mRNAs erzeugt werden, in hohem Maße von der Entwicklung experimenteller Systeme abhängen, um die Zerlegung der biochemischen Mechanismen, die der Rekrutierung zugrunde liegen, an den Dehnungskomplex und Regulierung von Enzymen, die für die kotranskriptionelle Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung verantwortlich sind.
Es überrascht nicht, dass die Entwicklung solcher experimentellen Systeme schwierig war. Ein großes Hindernis war die bemerkenswerte Komplexität der Pol-II-Transkription selbst, bei der die einfache Rekonstituierung der Basaltranskription durch Pol II in vitro einen Mindestsatz von fünf allgemeinen Transkriptionsinitiationsfaktoren erfordert: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF und TFIIH 1. Darüber hinaus erfordert die Wiederherstellung jeglicher Art von regulierter Pol-II-Transkription in vitro einen noch größeren Satz von Transkriptionsfaktoren und Koregulierungen. Ein wichtiges Ziel war es daher, einfachere experimentelle Systeme zu entwickeln, die die Rekonstitution aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe ermöglichen, die für Untersuchungen der funktionellen Kopplung von Pol II Transkription und RNA-Verarbeitung geeignet sind.
Eine derart einfachere Methode zur Rekonstituierung aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe hat sich für strukturelle und biochemische Studien zur Dehnung von Pol II und in jüngerer Zeit für die Untersuchung der kotranskriptionellen RNA-Verarbeitung als nützlich erwiesen2,3 ,4,5. In diesem Artikel zeigen wir, wie Pol II Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Pol II und synthetischen Transkriptionsblasen hergestellt wurden, effektiv genutzt werden können, um die Mechanismen zu untersuchen, die der kotranskriptionsbasierten Deckelung von aufkeimenden Pol II-Transkripten zugrunde liegen.
Die Deckelung bezieht sich auf die kovalente Zugabe einer 5'-Guanosin-"Kappe" zum 5'-Triphosphat-Ende der entstehenden Pol-II-Transkripte. Die Kappe ist wichtig für nachfolgende Schritte der mRNA Reifung, Transport, Translation und andere Prozesse6,7. Die Kappe wird von einem Enzym, das als Verschlussenzym bezeichnet wird, kotranskriptional zu Pol II-Transkripten hinzugefügt. In Säugetierzellen sind aktive Stellen, die für die RNA 5'-Triphosphatase und guanylyl transferase Aktivitäten des Verschlussenzyms verantwortlich sind, in einem einzigen Polypeptid8enthalten. Das Verschlussenzym wird durch Wechselwirkungen mit noch zu definierten Oberflächen auf dem Pol II-Körper und der Rpb1-Carboxy-Terminal-Domäne (CTD) phosphoryliert auf Ser5 seiner Heptapeptid-Wiederholungen5an den Pol-II-Dehnungskomplex rekrutiert. Im Dehnungskomplex katalysiert das Verschlussenzym die Zugabe einer 5'-Guanosin-Kappe, sobald das entstehende Transkript eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden erreicht und aus dem Polymerase-RNA-Ausgangskanal hervorgegangen ist. Im ersten Schritt der Verschlussreaktion hydrolysiert die Triphosphatase die RNA 5'-Triphosphat zu einem 5'-Diphosphat. Im zweiten Schritt wird GTP durch die Guanylyltransferase zu GMP hydrolysiert und bildet ein GMP-Verschlussenzym-Zwischenprodukt. Schließlich überträgt die guanylyl transferase GMP an das 5'-Diphosphat-Ende des entstehenden Transkripts, um die Obergrenze zu erzeugen.
Ein bemerkenswertes Merkmal der Verschlussreaktion ist, dass die kotranskriptionsbezogene Deckelung (d.h. die Deckelung von Transkripten im Zusammenhang mit funktionellen Pol II Dehnungskomplexen) viel effizienter ist als die Deckelung der freien RNA5,9. Eine wichtige Frage auf diesem Gebiet war daher, wie diese dramatische Aktivierung der Deckelung durch Wechselwirkungen des Verschlussenzyms mit dem Pol-II-Dehnungskomplex erreicht wird. In diesem Protokoll beschreiben wir die Montage aktiver RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe unter Verwendung nur gereinigter RNA-Polymerase II und künstlicher Transkriptionsblasen. Diese Methoden ermöglichen die Erstellung von RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexen mit Transkripten definierter Länge und Sequenz. In einer aktuellen Studie haben wir diese definierten RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe als Modell zur Untersuchung von Aspekten der Mechanismen der RNA-Verkappung5verwendet. Insbesondere zeigten wir, dass (i) die Verkappung von RNA im Zusammenhang mit diesen Dehnungskomplexen mehr als 100-fach effizienter war als die Deckelung freier RNA und (ii) durch TFIIH-abhängige Phosphorylierung der Pol II CTD stimuliert wurde. Der hier beschriebene Ansatz könnte grundsätzlich angepasst werden, um Substrate für die Untersuchung anderer kotranskriptionaler RNA-Verarbeitungsreaktionen im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zu erzeugen.
In Abschnitt 1 dieses Protokolls entstehen künstliche Dehnungskomplexe, indem ein synthetisches Schablonen-DNA-Oligonukleotid zu einem RNA-Oligonukleotid glüht, das sich an seinem 3'-Ende zu etwa 9 Nukleotiden der Schablonenstrang-DNA ergänzt. Pol II wird dann auf das DNA:RNA-Duplex geladen. Der Dehnungskomplex wird dann durch Zugabe eines teilweise komplementären, nicht-schablonenfreien DNA-Oligonukleotids ergänzt, das an seinem 3'-Ende mit Biotin beschriftet ist (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Das RNA-Oligonukleotid wird durch Pol II in diesen Dehnungskomplexen erweitert, um radioaktiv markierte Transkripte von definierter Länge und Sequenz nach Zugabe geeigneter Kombinationen von radioaktiv markierten Nukleotiden zu erstellen. Darüber hinaus kann man mit einer Kombination von Wässen, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen und die weitere Zugabe verschiedener Kombinationen von Nukleotiden, Pol II zu verschiedenen Positionen entlang der DNA-Vorlage "laufen" und RNA von definierten Längen synthetisieren. RNA wird dann gereinigt und in denaturierenden Harnstoff-PAGE-Gelen einer Elektrophorese unterzogen. In Abschnitt 2 des Protokolls werden künstliche Dehnungskomplexe verwendet, um die kotranskriptionelle RNA-Verkappung zu analysieren. Das vorgestellte Beispiel misst die Wirkung der TFIIH-abhängigen Phosphorylierung der Pol II CTD auf die co-transkriptionelle RNA-Verkappung. In diesem Experiment messen wir das Ausmaß der Co-Transkriptionsverkappung in Abhängigkeit von der Verschluss-Enzymkonzentration (5, 15 und 45 ng pro Reaktion) und der Zeit (1, 2 und 4 min).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

Die eukaryotische mRNA-Synthese ist ein komplexer biochemischer Prozess, der die Transkription einer DNA-Vorlage in eine Vorläufer-RNA durch das Multi-Subunit-Enzym RNA-Polymerase II und die kotranskriptionale Verkabelung und Spleißung der Vorläufer-RNA zur Bildung der reifen mRNA erfordert. Während der mRNA-Synthese ist der RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplex ein Ziel für die Regulierung durch eine große Sammlung von Transkriptionsfaktoren, die seine katalytische Aktivität steuern, sowie die Verschluss-, Spleiß- und 3'-Verarbeitungsenzyme, die die ausgereifte mRNA erzeugen. Aufgrund der inhärenten Komplexität der mRNA-Synthese haben einfachere experimentelle Systeme, die die Isolierung und Untersuchung ihrer verschiedenen kotranskriptionsbasierten Stadien ermöglichen, einen großen Nutzen.
In diesem Artikel beschreiben wir ein solches einfaches experimentelles System, das für die Untersuchung der co-transkriptionellen RNA-Verkappung geeignet ist. Dieses System stützt sich auf definierte RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Polymerase- und künstlichen Transkriptionsblasen zusammengesetzt sind. Bei immobilisierter DNA-Deaktivierung bieten diese RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe ein leicht zu manipulierbares Werkzeug zur Sezieren von co-transkriptioniellen RNA-Verschließungen und Mechanismen, mit denen der Dehnungskomplex das Verschlussenzym während der co-transkriptionelle RNA-Verkappung. Wir gehen davon aus, dass dieses System für die Untersuchung der Rekrutierung und/oder Montage von Proteinen oder Proteinkomplexen mit Rollen in anderen Stadien der mRNA-Reifung angepasst werden könnte, die an den Dehnungskomplex der RNA-Polymerase II gekoppelt sind.

Die Abbildungen 2 und 3 zeigen repräsentative Ergebnisreaktionen, die zur Erzeugung künstlicher Dehnungskomplexe verwendet werden, die Transkripte unterschiedlicher Länge enthalten, indem sie sich erweitern oder Pol II aus verschiedenen Quellen beziehen. Abbildung 4 zeigt, wie diese Dehnungskomplexe verwendet werden können, um die co-transkriptionelle CTD-Phosphorylierungsabhängige RNA-Verkappung zu assay.
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Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Hier haben wir ein einfaches experimentelles System etabliert, das die Rekonstitution aktiver Pol II Dehnungskomplexe ermöglicht, die für die Untersuchung der funktionellen Kopplung von Pol II Transkription und RNA-Kappung geeignet sind. Mit dieser Methode lassen sich funktionale Dehnungskomplexe einfach mit wenigen Komponenten zusammenbauen. Die Dehnungskomplexe sind auf magnetischen Perlen immobilisiert, so dass es einfach ist, Reaktionsbedingungen zu ändern.Um DNA-Oligo, das Biotin enthält, auf magnetischen Perlen zu immobilisieren, fügen Sie zunächst 200 Mikroliter Magnetperlen in eine proteinarme, bindende 1,5-Milliliter-Röhre ein und legen Sie die Röhre dann für zwei Minuten auf ein magnetisches Rack. Während sich das Rohr auf dem magnetischen Rack befindet, verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit aus dem Rohr zu entfernen, ohne die Perlen zu stören. Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie das Rohr aus dem Rack, und fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer mit Tris-Hydrochlorid, EDTA und Natriumchlorid hinzu.Geben Sie das Rohr in das Rack zurück. Nach zwei Minuten die Waschlösung entfernen und die Wäsche zwei weitere Male mit 200 Mikroliter n.A. desselben Puffers wiederholen. Setzen Sie die magnetischen Perlen in 400 Mikroliter 2X Puffer aus.Dann fügen Sie 380 Mikroliter Wasser und 20 Mikroliter 10-Mikromolar nicht-Schablone biotinylierte DNA-Oligo zu mischen. Legen Sie das Rohr auf einen Nutator und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Danach die Perlen mit immobilisiertem DNA-Oligo dreimal mit 200 Mikroliter Puffer und dann dreimal mit 200 Mikroliter Lagerung und Verdünnungspuffer waschen.Bewahren Sie die Röhre über Nacht bei vier Grad Celsius auf, um die Beads mit BSA zu blockieren. Am nächsten Tag entsorgen Sie die Lösung, setzen Sie die Perlen in 200 Mikroliter Lagerung und Verdünnungspuffer wieder auf, um eine ungefähre DNA-Konzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen, und übertragen Sie die Lösung dann mit den Perlen in ein neues Rohr. Um das DNA-RNA-Duplex zu erhalten, bereiten Sie eine 10-Mikroliter-Glühmischung in einer PCR-Röhre mit einem Zwei-zu-Eins-RNA-DNA-Molar-Verhältnis vor, wie im geschriebenen Protokoll beschrieben.Legen Sie das Rohr in einen thermischen Cycler. Stellen Sie das Programm für fünf Minuten auf 45 Grad Celsius, gefolgt von 12 Zyklen zu je zwei Minuten, beginnend bei 43 Grad Celsius und einer Senkung der Temperatur um zwei Grad Celsius pro Zyklus. Schließlich halten Sie es untätig bei vier Grad Celsius.Um gereinigte RNA-Polymerase II auf den DNA-RNA-Hybrid zu laden, mischen Sie einen Mikroliter DNA-RNA-Duplex mit 13 Mikroliterfrisch zubereitetem Polymerase-II-Puffer in einer Röhre. Fügen Sie einen Mikroliter gereinigte RNA-Polymerase II hinzu und mischen Sie sie, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen und mit der Pipettenspitze rühren, ohne Blasen einzuschleusen. Inkubieren Sie die Röhre für 10 Minuten bei 30 Grad Celsius.Um den Dehnungskomplex zu vervollständigen, fügen Sie einen Mikroliter immobilisierter DNA-Oligoperlen, die nicht in schablonierten DNA-Gerüchen, 14 Mikroliter nicht-Template-DNA-Puffer hinzu, fügen Sie die 15-Mikroliter-Mischung in die zuvor inkubierte Röhre ein und inkubieren Sie sie für weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Legen Sie die Probe für zwei Minuten auf das Magnetgestell. Waschen Sie die Probe einmal mit 30 Mikroliter Waschpuffer, um nicht inkorporierte Polymerase II und Oligos zu entfernen.Um die Dehnungskomplexe mit RNA 23mers radioaktiv zu kennzeichnen, fügen Sie einen Mikroliter ATP und einen Mikroliter radioaktiv markierte UTP zu 23 Mikroliter Pulspuffer hinzu, und fügen Sie diese Mischung zu den gewaschenen Magnetperlen hinzu, um sie wieder aufzusetzen. Inkubieren Sie die Reaktion für 10 Minuten, um die Synthese von radioaktiv markierten 23mers zu ermöglichen. Fügen Sie 1,5 Mikroliter Lösung mit 100-Mikromolar ATP und 100-Mikromolar-UTP-Mischung zu 3,5 Mikroliter Njekpuffer hinzu und fügen Sie die Mischung in das Rohr mit vormontierten Dehnungskomplexen auf Perlen hinzu.Wieder, inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten, um alle aufkeimenden Transkripte in 23mers zu jagen. Legen Sie dann das Rohr auf das magnetische Rack und waschen Sie, wie zuvor getan wurde, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen. Setzen Sie die Probe in 30 Mikroliter Waschpuffer aus.Um Dehnungskomplexe mit längeren Transkripten zu erzeugen, folgen Sie den vorherigen Verfahren und skalieren Sie sich vervierfachen, um 120 Mikroliter gewaschener Dehnungskomplexe für vier Reaktionen zu erzeugen. Beschriften Sie drei neue Rohre 23mer, 25mer und 29mer. Übertragen Sie 30 Mikroliter gewaschener Dehnungskomplexe in das 23mer-Rohr und fügen Sie 94 Mikroliter Stop-Mix hinzu, der Proteinase K und Glykogen enthält.Legen Sie das Rohr mit den restlichen 90 Mikrolitern gewaschener Dehnungskomplexe für zwei Minuten auf das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie Perlen in 90 Mikroliter BTB auf, ergänzt mit 1,2 MikroliterAT und CTP. 10 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Waschen mit 90 Mikroliter Waschpuffer 30 Mikroliter Dehnungskomplexe in das 25mer-Rohr geben und 94 Mikroliter Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzufügen.Legen Sie das Rohr mit den restlichen 60 Mikroliterdehnungskomplexen erneut zwei Minuten lang auf das Magnetgestell. Wiederholen Sie die BTB-Behandlung mit 60 Mikroliter Puffer, ergänzt mit 0,8 MikroliterAT und CTP. Nach dem Inkubieren und Waschen wie zuvor, die Probe in 60 Mikroliter Waschpuffer wieder aussetzen.Übertragen Sie 30 Mikroliter aus der Probe in das 29mer-Röhrchen und fügen Sie 94 Mikroliter Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzu. Analysieren Sie Reaktionsprodukte auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Erstellen Sie zunächst gewaschene Dehnungskomplexe mit 23Mern, indem Sie das zuvor beschriebene Verfahren um das 13-fache skalieren, um 390 Mikroliter für 12 Reaktionen und ein Extra zu erhalten.Um die Phosphorylierung der Polymerase II CTD durchzuführen, entfernen Sie den Überstand, nachdem Sie die Probe in das magnetische Rack gestellt haben, und setzen Sie die Perlen in 377 Mikroliter BTB wieder aus. Zwei neue Tuben plus H und minus H.To plus H beschriften, drei Mikroliter Transkriptionsinitiierungsfaktor TFIIH in der Konzentration von 300 Nanogramm pro Mikroliter hinzufügen und auf minus H neun Mikroliter Lagerung und Verdünnungspuffer hinzufügen. Fügen Sie 87 Mikroliter der gewaschenen Dehnungskomplexe in das Plus H-Rohr und 261 Mikroliter in das Minus H-Rohr.Die Schläuche 10 Minuten lang bebrüten und mit Waschpuffer waschen. Um die RNA-Verkappung durchzuführen, fügen Sie 87 Mikroliter Verschließmischung in die Plus-H-Röhre und 261 Mikroliter in die Minus-H-Röhre ein, um sie wieder aufzusetzen. Etikettieren Sie vier neue Tuben, fünf plus H, fünf minus H, 15 minus H und 45 minus H, und geben Sie drei Mikroliter fünf, 15 oder 45 Nanogramm pro Mikroliter Verschließungsenzym in die entsprechenden Röhrchen.Dann bereiten Sie 12 neue Rohre mit 94 Mikroliter Stop-Puffer. Beginnen Sie die erste Verkappungsreaktion, indem Sie 87 Mikroliter Dehnungskomplex, der mit TFIIH behandelt wird, in das mit fünf plus H.Inkubte bei 30 Grad Celsius beschriftete Rohr in einem Wärmeblock hinzufügen. Die Kappungsreaktionen müssen mit einer Stoppuhr präzise getimt werden.Bei der Arbeit mit mehreren Reaktionen sollten die Startzeiten für jede Reaktion gestaffelt sein. Nach einer, zwei oder vier Minuten 30 Mikroliter der fünf Plus-Reaktionsmischung in Röhren mit der Bezeichnung eins, zwei und drei mit 94 Mikroliter Stopppuffer übertragen, um die Reaktionen zu stoppen. Gehen Sie mit Verschlussreaktionen für die Proben in den verbleibenden Minus H-Röhren genau auf die gleiche Weise vor, wobei Dehnungskomplexe ohne TFIIH behandelt werden.Analysieren Sie Reaktionsprodukte auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Ein Diagramm für DNA- und RNA-Moleküle in künstlichen Dehnungskomplexen ist hier dargestellt. Mit dem synthetischen RNA-Oligo von 20 Nukleotiden als RNA-Primer während der Montage der künstlichen Dehnungskomplexe wurden bei jedem sequenziellen Schritt des Protokolls Nukleotide hinzugefügt, um ein 23mer, ein 25mer und ein 29mer zu erzeugen.Reaktionen mit RNA-Polymerase II aus verschiedenen Quellen wurden verglichen. Künstliche Dehnungskomplexe wurden mit endogener, wildartiger Polymerase II zusammengesetzt, die entweder aus Rattenleber oder Spalthefe gereinigt und zu 23Mern oder 25Mern geführt wurden. Ein Test wurde durchgeführt, um die Deckelung von radioaktiv markierten Transkripten zu messen, die mit künstlichen Dehnungskomplexen verbunden sind, die 23 Nukleotid-Transkripte mit einem Fünf-Prime-Triphosphat-Ende enthalten.Die letzten beiden Bahnen zeigen die Produkte von Reaktionen, in denen Dehnungskomplexe in Gegenwart von TFIIH mit oder ohne Verschlussenzym inkubiert wurden. Die langsameren und schneller migrierenden Bänder enthalten gedeckelte bzw. ungekapselte Transkripte. Die ersten 12 Bahnen zeigen die Deckelung von Transkripten, die mit Dehnungskomplexen mit einer phosphorylierten oder nicht phosphorylierten CTD verbunden sind.Aktivitäten von Polymerase II und anderen Enzymen können von Vorbereitung bis Vorbereitung variieren, so dass es notwendig ist, Reaktionsbedingungen durch Titrierung von Enzymkonzentrationen zu optimieren, um optimale Niveaus zu definieren. Es ist wichtig, radioaktives Material sicher zu verwenden und Kontaminationen zu vermeiden. Bitte beachten Sie bei Experimenten mit Radioaktivität Die Richtlinien Ihres Labors und Instituts.

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

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Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

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RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

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