Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

אנו מודים לס' שומאן על אספקת האנזים להגבלת היונקים. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענק למכון הסטורים למחקר רפואי מקרן הלן נלסון לחקר הרפואה בקרן הקהילה רבתי בקנזס סיטי.  ניתן לגשת לנתונים המקוריים שבבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. הרכבת של מכלולי התארכות מלאכותיים ופול השני הליכה
<ol><li>השתק 1 nmol של שאינם תבנית DNA oligo המכיל 3 ' ביוטין מולקולה על חרוזים מגנטיים. הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים מראש כדי להתכונן לניסויים עתידיים. כל רצפי oligo המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בטבלה 1. ה-RNA oligos מסונתז עם 5 '-triphosph...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

מחקרים שמבקשים לבתר את האירועים ביחד למכלול התארכות פול השני כגון עיבוד רנ א ורגולציה של ההתארכות עצמה ניתן להקל מאוד על ידי שימוש במערכת אנזימים מאוד מטוהרים. הגדרת מערכות אנזימים כאלה יכולה להיות מאתגרת. התעתיק התלוי של היזם על ידי פול השני דורש לפחות חמישה גורמי שעתוק כלליים. הכנת הגור?...

Eukaryotic RNA (mRNA) סינתזה היא תהליך ביוכימיים מורכבים המערבת סינתזה של רנ א מעובד מעובד על ידי RNA פולימראז II ועיבוד של RNA הקודמן להניב mRNA בוגרת. פעולות עיבוד ה-RNA של הסגירה, החבור והפוליאדלציה מתבצעות במידה רבה באופן משותף. מתחם התארכות פול השני משמש כפיגום שמגוייסים ומתזמונים את פעילותם של רבים מאנזימי העיבוד של RNA. כתוצאה מכך, ההבנה האולטימטיבית של הדרך בה מופקים מערכת mrnas בוגרת, תסתמך במידה רבה על פיתוח מערכות נסיוניות כדי לאפשר ניתוח של המנגנונים הביוכימיים המשמשים לגיוס למכלול התארכות ו התקנה של אנזימים האחראים לסגירה משותפת, שחבור ופוליאדלציה.
לא באופן מפתיע, פיתוח מערכות נסיוניות כאלה היה קשה. מכשול גדול כבר המורכבות המדהימה של שעתוק פול השני עצמו היכן פשוט מחדש את התמלול בסיס על ידי פול השני בפריפרייה דורש קבוצה מינימלית של חמישה גורמים כלליים ליזום שעתוק: TFIIB יברות, TFIIB, TFIIB, TFIIB, ו TFIIB 1. יתר על כן, מחדש כל סוג של שעתוק פול II מוסדר בתוך מבחנה דורש קבוצה גדולה עוד יותר של מרכיבי שעתוק ומתאמים. כך, המטרה העיקרית הייתה לפתח מערכות ניסיוני פשוט המאפשר החוקה של מתחמי התארכות פעיל פול השני מתאים לחקירות של הזיווג הפונקציונלי של שעתוק פול השני ו-RNA עיבוד.
אחת שיטה פשוטה כזאת לחידוש מתחמי התארכות החדש של פול השני הוכיחה שימושי עבור מחקרים מבניים וביוכימיים של להאריך Pol II ו, לאחרונה, עבור חקירת שיתוף RNA עיבוד2,3 ,4,5. במאמר זה, אנו מראים כיצד פול התארכות מתחמים הכין מטוהרים פול II ובועות תמלול סינתטי ניתן להשתמש ביעילות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים שיתוף החוצה של התעתיקים המתהווה פול השני.
הסגירה מתייחסת התוספת הקוולנטי של 5 '-guanosine "כובע" כדי 5 '-triphosphate לסיים את התעתיקים פול השני המתהווה. הכובע חשוב עבור השלבים הבאים של mrna התבגרות, תחבורה, תרגום, ותהליכים אחרים6,7. הכובע מתווסף בשיתוף פעולה לתעתיקים של פול השני על ידי אנזים המכונה אנזים סגירה. בתאי היונקים, אתרים פעילים האחראים RNA 5 '-triphosphatase ו guanylyl טרנספראז פעילויות של אנזים הסגירה כלולים בתוך פוליפטידים אחד8. האנזים הסגירה מגויס למכלול התארכות פול השני באמצעות אינטראקציות עם זאת כדי להיות משטחים מוגדרים על הגוף Pol II והתחום Rpb1 xy-מסוף (CTD) זרחניות על Ser5 הפטניות שלה חוזר על5. במתחם התארכות, האנזים הסגירה מזרז תוספת של 5 '-guanosine כובע פעם התעתיק המתהווה מגיע לאורך של לפחות 18 נוקלאוטידים והגיח מערוץ היציאה של RNA פולימראז. בשלב הראשון של תגובת הסגירה, triphosphatase הידרו RNA 5 '-triפוספט כדי להניב 5 '-diphosphate. בשלב השני, gtp הוא ידרוליזה ל-GMP על ידי guanylyl transferase, ויוצרים ביניים אנזים הסגירה של gmp. לבסוף, guanylyl טרנספראז העברת GMP לקצה 5 '-diphosphate של התעתיק המתהווה לייצר את הכובע.
תכונה יוצאת דופן של תגובת הסגירה היא שיתוף הסגירה המשותף (כלומר, הסגירה של התעתיקים הקשורים עם מכלולי התארכות פול 2 של פונקציונלי) הוא הרבה יותר יעיל מאשר הסגירה של RNA חינם5,9. לפיכך, השאלה העיקרית בתחום הייתה כיצד הפעלה דרמטית זו של הסגירה מושגת באמצעות אינטראקציות של אנזים הסגירה עם קומפלקס התארכות פול השני. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההרכבה של פעיל RNA פולימראז II מתחמי התארכות באמצעות מטוהרים רק RNA פולימראז II ובועות תעתיק מלאכותי. שיטות אלה לאפשר יצירה של RNA פולימראז II מתחמי התארכות עם תעתיקים של אורך ורצף מוגדר. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו אלה מוגדרים RNA פולימראז II מתחמי התארכות כמודל לחקירת היבטים של מנגנוני הסגירה של RNA5. בפרט, הראנו כי (אני) הסגירה של RNA הקשורים עם מתחמי התארכות אלה היה יותר מ 100-קיפול יעיל יותר מאשר הסגירה של RNA חינם ו (ii) היה מגורה על ידי TFIIH תלוי זרחון של השני של הפול CTD. הגישה המתוארת כאן יכולה עקרונית להיות מותאם כדי ליצור מצעים עבור לימוד אחרים שיתוף ההמרה לעיבוד RNA תגובות הקשורות למכלול התארכות פול II.
בסעיף 1 של פרוטוקול זה, מכלולי התארכות מלאכותיים נוצרים על-ידי חישול תבנית סינתטי גדיל ה-DNA olig, הגאות ל-RNA olig, משלימה ב 3 '-end שלה כ 9 נוקלאוטידים של ה-DNA תבנית סטרנד. פול II נטען לאחר מכן על ה-DNA: רנ א דופלקס. מתחם התארכות מושלם לאחר מכן על-ידי תוספת של משלימה באופן חלקי, DNA שאינו תבנית של החיבור האלחוטי, אשר מתויג עם ביוטין ב 3 '-end (איור 1 ואיור 2a). ה-RNA olig, הגאות והשפל מורחב על ידי פול השני במערכות התארכות אלה כדי להפוך את התעתיקים המוגדרים של האורך והרצף בתוספת של שילובים הולמים של הנוקלאוטידים. בנוסף, שימוש בשילוב של שוטף כדי להסיר נוקלאוטידים משולבים ותוספת נוספת של צירופים שונים של נוקלאוטידים, אחד יכול "ללכת" פול II למיקומים שונים לאורך תבנית ה-DNA ולסנתז RNA של אורכי מוגדר. RNA הוא לאחר מכן מטוהר ונתון לאלקטרופורזה בדאתהיכה שתנן-דף ג ' לים. בסעיף 2 לפרוטוקול, מערכות התארכות מלאכותיות משמשות לניתוח הסגירה של RNA שכונתיות. הדוגמה המוצגת מודדת את ההשפעה של זרחון התלוי ב-TFIIH של ה-CTD של הפול השני בנוגע לסגירה משותפת של RNA. בניסוי זה, אנו מודדים את היקף הסגירה של שיתוף הפעולה כפונקציה של הגבלת ריכוז האנזים (5, 15 ו 45 ng לכל תגובה) וזמן (1, 2 ו 4 דקות).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

הסינתזה של eukaryotic הוא תהליך ביוכימיים מורכב המחייב תמלול של תבנית DNA לתוך RNA מקודמת על ידי אנזים רב subunit RNA פולימראז II ו-co-transcript השילוב של RNA הקודמן כדי ליצור את mRNA בוגרת. במהלך סינתזה mRNA, מתחם התארכות RNA פולימראז II הוא יעד לרגולציה על ידי אוסף גדול של גורמי שעתוק השולטים בפעילות הקטליטית שלה, כמו גם הסגירה, השילוב, ו 3 '-עיבוד אנזימים היוצרים את mRNA בוגרת. בגלל המורכבות הטבועה של סינתזה של mRNA, מערכות ניסוי פשוטות יותר המאפשרות בידוד וחקירה של שלבי ההמרה השונים שלה יש תועלת רבה.
במאמר זה, אנו מתארים אחד מערכת ניסיונית פשוטה כזו המתאימה לחקירת הסגירה שיתוף RNA. מערכת זו מסתמכת על הגדרת RNA פולימראז II מתחמי התארכות התאספו מ פולימראז מטוהרים ובועות תעתיק מלאכותי. כאשר מקיבוע באמצעות ה-DNA biotinylated, אלה מתחמי התארכות RNA פולימו II מספקים כלי manipulable בקלות לניתוח מנגנוני הסגירה של RNA ומנגנונים שבהם מורכבות התארכות המגוייסים ומווסת את האנזים הסגירה במהלך שיתוף עם הסגירה של RNA. אנו מצפים מערכת זו יכול להיות מותאם ללימוד גיוס ו/או הרכבה של חלבונים או מתחמי חלבונים עם תפקידים בשלבים אחרים של התבגרות mRNA בשילוב למכלול התארכות RNA פולימראז II.

דמויות 2 ו- 3 להראות התגובה הייצוגית משמש ליצירת מתחמי הארכה מלאכותית המכילה תעתיקים של אורכים שונים על ידי הרחבת או פול השני ממקורות שונים. איור 4 מתאר כיצד אלה מתחמי התארכות ניתן להשתמש כדי לחשב שכונתיות ctd מותנית בסגירה של RNA.
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

כאן, הקמנו מערכת ניסיונית פשוטה המאפשרת התחדשות של מתחמי התארכות פעילים של Pol II המתאימים לחקירת הצימוד הפונקציונלי של שעתוק Pol II וכיפה של RNA. בשיטה זו, ניתן להרכיב בקלות קומפלקסים של התארכות פונקציונלית עם כמה רכיבים. מתחמי התארכות משותקים על חרוזים מגנטיים, כך שקל לשנות את תנאי התגובה.כדי לשתק אוליגו DNA המכיל ביוטין על חרוזים מגנטיים, תחילה להוסיף 200 microliters של חרוזים מגנטיים לצינור חלבון נמוך מחייב 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן למקם את הצינור על מתלה מגנטי במשך שתי דקות. בזמן שהצינור נמצא על המדף המגנטי, השתמש בפיגט כדי להסיר את הנוזל מהצינור מבלי להפריע לחטוזים. כדי לשטוף את חרוזים, להסיר את הצינור מן המדף, ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ לשטוף המכיל טריס הידרוכלוריד, EDTA, ונתרן כלורי.תחזיר את הצינור למדף. לאחר שתי דקות, להסיר את פתרון לשטוף, ולחזור על לשטוף פעמיים נוספות באמצעות 200 microliters של אותו חיץ. תן שימוש חוזר ב חרוזים מגנטיים ב-400 מיקרוליטרים של חיץ 2X.לאחר מכן, להוסיף 380 microliters של מים ו 20 microliters של 10 מיקרומולרים שאינם תבנית אוליגו DNA biotinylated לערבב. מניחים את הצינור על מטור, ואת הדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם אוליגו DNA משותק שאינו תבנית שלוש פעמים באמצעות 200 microliters של חיץ ולאחר מכן שלוש פעמים עם 200 microliters של מאגר אחסון ודילול.לאחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס לילה כדי לסיים את חסימת חרוזים עם BSA. למחרת, להשליך את הפתרון, להשתמש שוב את חרוזים 200 microliters של אחסון חיץ דילול, כדי להגיע לריכוז DNA משוער של חמישה micromolar, ולאחר מכן להעביר את הפתרון עם חרוזים לצינור חדש. כדי להשיג את דופלקס הדנ"א-RNA, הכינו תערובת חישול של 10 מיקרוליטר בצינור PCR עם יחס טוחן RNA-DNA של שניים לאחד, כמתואר בפרוטוקול הכתוב.מניחים את הצינור באופניים תרמיים. הגדר את התוכנית ל 45 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ואחריו 12 מחזורים של שתי דקות כל אחד, החל 43 מעלות צלזיוס והפחתת הטמפרטורה על ידי שתי מעלות צלזיוס למחזור. לבסוף, לשמור אותו סרק בארבע מעלות צלזיוס.כדי לטעון פולימראז RNA מטוהר II על היברידית DNA-RNA, לערבב מיקרוליטר אחד של דופלקס DNA-RNA עם 13 microliters של מאגר פולימראז II מוכן טרי בצינור. מוסיפים מיקרוליטר אחד של פולימראז RNA מטוהר II, ומערבבים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה ומערבבים עם קצה פיפטה, מבלי להציג בועות. דגירה הצינור במשך 10 דקות ב 30 מעלות צלזיוס.כדי להשלים את קומפלקס התארכות, להוסיף מיקרוליטר אחד של בחנורי אוליגו DNA משותקים שאינם תבנית ל 14 microliters של מאגר DNA שאינו תבנית, להוסיף את תערובת 15 מיקרוליטר לצינור הדגירה בעבר, ולהדגיר אותו עוד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מניחים את הדגימה על המדף המגנטי במשך שתי דקות. לשטוף את המדגם פעם אחת עם 30 microliters של חיץ לשטוף כדי להסיר פולימראז לא מאוגד II ו אוליגוס.כדי radiolabel מתחמי התארכות עם RNA 23mers, להוסיף מיקרוליטר אחד של ATP ומיקרוליטר אחד של radiolabeled UTP ל 23 microliters של חיץ הדופק, ולהוסיף תערובת זו חרוזים מגנטיים שטף כדי resuspend. הדגירה את התגובה במשך 10 דקות כדי לאפשר את הסינתזה של radiolabeled 23mers. הוסף 1.5 מיקרוליטרים של פתרון המכיל ATP 100 מיקרומולרי ו 100 מיקרומולרי UTP לערבב 3.5 microliters של מאגר מרדף, ולהוסיף את התערובת לצינור המכיל מתחמי התארכות מורכבים מראש על חרוזים.שוב, דגירה הצינור במשך חמש דקות לרדוף אחרי כל התמלילים המתהווים לתוך 23mers. לאחר מכן, מניחים את הצינור על המדף המגנטי, ולשטוף כפי שנעשה בעבר כדי להסיר נוקלאוטידים מאוגדים. תן שימוש חוזר בדגימה ב-30 מיקרוליטרים של חיץ כביסה.כדי ליצור מתחמי התארכות עם תעתיקים ארוכים יותר, בצע את ההליכים הקודמים, והגדל פי ארבעה כדי ליצור 120 מיקרוליטרים של מתחמי התארכות שטופים לארבע תגובות. תווית שלוש צינורות חדשים 23mer, 25mer, ו 29mer. מעבירים 30 מיקרוליטרים של מתחמי התארכות שטופים לצינור 23mer, ומוסיפים 94 מיקרוליטרים של תערובת עצירה המכילה פרוטאינאז K וגליקוגן.מניחים את הצינור המכיל את 90 microliters הנותרים של מתחמי התארכות שטף על המדף המגנטי במשך שתי דקות, להסיר את supernatant, ו resuspend חרוזים 90 microliters של BTB בתוספת 1.2 microliters של ATP ו CTP. דגירה במשך 10 דקות ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה עם 90 microliters של חיץ לשטוף, להעביר 30 microliters של מתחמי התארכות לצינור 25mer, ולהוסיף 94 microliters של תערובת להפסיק המכיל proteinase K וגליקוגן.שוב, מניחים את הצינור המכיל את 60 microliters הנותרים של מתחמי התארכות על המדף המגנטי במשך שתי דקות. חזור על הטיפול BTB עם 60 microliters של חיץ בתוספת 0.8 microliters של ATP ו CTP. לאחר הדגירה והכביסה כפי שנעשה בעבר, יש להשתמש מחדש בדגימה ב-60 מיקרוליטרים של חיץ כביסה.מעבירים 30 מיקרוליטרים מהדגימה לצינור 29mer, ומוסיפים 94 מיקרוליטרים של תערובת עצירה המכילה פרוטאינאז K וגליקוגן. לנתח מוצרי תגובה על ג'ל פוליאקרילמיד denaturing. ראשית, ליצור מתחמי התארכות שטף המכיל 23mers על ידי קנה מידה של 13 פי ההליך שתואר בעבר כדי להשיג 390 microliters עבור 12 תגובות ואחד נוסף.כדי לבצע זרחון של פולימראז II CTD, להסיר את supernatant לאחר הצבת המדגם בארון מגנטי, ו resuspend את חרוזים ב 377 microliters של BTB. תווית שני צינורות חדשים בתוספת H ומינוס H.To בתוספת H, להוסיף שלושה microliters של גורם אתחול שעתוק TFIIH בריכוז של 300 ננוגרם למיקרוליטר, כדי מינוס H, להוסיף תשעה microliters של מאגר אחסון ודילול. הוסיפו 87 מיקרוליטרים של מתחמי התארכות שטופים לצינור הפלוס H ו-261 מיקרוליטרים לצינור מינוס H.דגירה הצינורות במשך 10 דקות, ולשטוף עם חיץ לשטוף. כדי לבצע מכסה RNA, להוסיף 87 microliters של תערובת capping לצינור בתוספת H ו 261 microliters לצינור מינוס H כדי resuspend. סמן ארבעה צינורות חדשים, חמישה פלוס H, חמישה מינוס H, 15 מינוס H, ו 45 מינוס H, ולוותר על שלושה microliters של חמישה, 15, או 45 ננוגרם לכל אנזים microliter capping לתוך הצינורות המתאימים.לאחר מכן, הכינו 12 צינורות חדשים עם 94 מיקרוליטרים של חיץ עצירה. התחל את תגובת המכסה הראשונה על ידי הוספת 87 microliters של קומפלקס התארכות שטופלו TFIIH לצינור שכותרתו חמש בתוספת H.Incubate ב 30 מעלות צלזיוס בבלוק חום. יש לתזמן במדויק את תגובות המכסה באמצעות סטופר.בעת עבודה עם תגובות מרובות, זמני ההתחלה של כל תגובה צריכים להיות מזעזעים. לאחר אחת, שתיים או ארבע דקות, להעביר 30 microliters של חמש בתוספת תערובת התגובה צינורות שכותרתו אחד, שתיים, ושלושה המכילים 94 microliters של חיץ עצירה כדי לעצור את התגובות. המשך עם התגובות capping עבור הדגימות בצינורות מינוס H הנותרים בדיוק באותו אופן, באמצעות מתחמי התארכות שטופלו ללא TFIIH.לנתח מוצרי תגובה על ג'ל פוליאקרילמיד denaturing. תרשים מוצג כאן עבור מולקולות DNA ו- RNA במתחמים התארכות מלאכותית. באמצעות אוליגו RNA סינתטי של 20 נוקלאוטידים כמו פריימר RNA במהלך ההרכבה של מתחמי התארכות מלאכותית, נוקלאוטידים נוספו במהלך כל צעד הליכה רציפה של הפרוטוקול כדי ליצור 23mer, 25mer, ו 29mer.תגובות באמצעות RNA פולימראז II ממקורות שונים הושוו. מתחמי התארכות מלאכותיים הורכבו עם פולימראז II אנדוגני, מסוג פראי, מטוהרים מכבד עכברוש או משמרי ביקוע והלכו לייצר 23מרים או 25מרים. בוצעה התדהמה למדידת תעתיקים עם תעתיקים הקשורים למתחמים מלאכותיים של התארכות המכילים 23 תעתיקי נוקלאוטיד עם קצה טריפוספט של חמישה ראשים.שני הנתיבים האחרונים מראים את המוצרים של תגובות שבהן מתחמי התארכות היו דגירה עם או בלי כובע אנזים בנוכחות TFIIH. הלהקות הנודדות לאט יותר ויותר במהירות מכילות תעתיקים מכוסים ולא מנוצלים, בהתאמה. 12 הנתיבים הראשונים מראים תעתיקים הקשורים למתחמים מוארכים עם CTD זרחני או לא פוסורי.פעילויות של פולימראז II ואנזימים אחרים עשויות להשתנות מהכנה להכנה, ולכן יש צורך לייעל את תנאי התגובה על ידי טיטרטינג ריכוזי אנזימים כדי להגדיר רמות אופטימליות. חשוב להשתמש בחומר רדיואקטיבי בבטחה ולהימנע מזיהום. אנא הקפד לעקוב אחר הנחיות המעבדה והמכון שלך בעת ביצוע ניסויים עם רדיואקטיביות.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...