Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

私たちは、哺乳類キャッピング酵素cDNAを提供してくれたS.シューマンに感謝します。この研究は、グレーター・カンザスシティ・コミュニティ財団のヘレン・ネルソン医学研究基金からのスタワーズ医学研究所への助成金によって一部支援されました。 この原稿の根底にある元のデータは、http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434のスタワーズオリジナルデータリポジトリからアクセスできます。

1. 人工伸びコンプレックスの組み立てとポルIIウォーキング
<ol><li>磁気ビーズ上の3'ビオチン分子を含む非テンプレートDNAオリゴの1 nmolを固定化する。 注:次の手順は、将来の実験に備えるために事前に行うことができます。このプロトコルで使用されるすべてのオリゴ配列は表1に示されています。RNAオリゴは、5'-三リン酸修飾で合成される。<ol>
<li>低タンパク質...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

RNA処理や転写伸長自体の調節などのPol II伸長複合体に結合した事象を解剖しようとする研究は、高度に精製された酵素系を用いることによって大いに促進することができる。このような酵素システムの設定は困難な場合があります。Pol IIによるプロモーター依存転写には、少なくとも5つの一般的な転写因子が必要である。これらの要因の準備と備蓄には数ヶ月かかる場合があります。したが...

真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)合成は、RNAポリメラーゼIIによる未処理前駆体RNAの合成および成熟したmRNAを得るための前駆体RNAの処理を含む精巧な生化学的プロセスである。キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化のRNA処理ステップは、主に共写的に行われる。Pol II伸長複合体は、RNA処理酵素の多くの活動を募集し、調整する足場として機能します。その結果、成熟した真核生物mRNAがどのように生成されるかについての我々の究極の理解は、伸長複合体への募集の基礎となる生化学的メカニズムの解剖を可能にする実験システムの開発に大きく依存し、共転写キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化を担当する酵素の調節。
当然のことながら、このような実験システムの開発は困難であった。主な障害は、単にインビトロでPol IIによって基底転写を再構成するだけで、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIHの5つの一般的な転写開始因子の最小セットを必要とするPol II転写自体の顕著な複雑さでした。さらに、インビトロで規制されたPol II転写の任意の並べ替えを再構成するには、転写因子と共レギュレータのより大きなセットが必要です。したがって、主な目標は、Pol II転写およびRNA処理の機能結合の研究に適した活性Pol II伸長複合体の再構成を可能にする、より単純な実験システムを開発することである。
活性Pol II伸長複合体を再構成するためのそのようなより簡単な方法の1つは、細長いPol IIの構造および生化学的研究に有用であることが証明されており、さらに最近では、共転写RNA処理2、3を研究するために有用である。 、4、5.本稿では、精製されたPol IIと合成転写気泡から調製されたPol II伸長複合体を効果的に使用して、新生Pol II転写物の共転写キャッピングのメカニズムを調べることができる方法を示す。
キャッピングとは、5'-グアノシン「キャップ」を、生まれつきのPol II転写物の5'-三リン酸末端に共生添加することをいう。キャップは、mRNAの成熟、輸送、翻訳、およびその他のプロセス6、7の後続のステップで重要です。キャップは、キャッピング酵素と呼ばれる酵素によってPol II転写物に共写物を添加する。哺乳動物細胞において、キャッピング酵素のRNA 5'-三ホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を担う活性部位は、単一のポリペプチド8内に含まれる。キャッピング酵素は、そのヘプタペプチドのSer5上でリン酸化されたPol II体およびRpb1カルボキシ末端ドメイン(CTD)上の未定義の表面との相互作用を通じてPol II伸長複合体に募集される5。伸長複合体では、キャッピング酵素は、生まれつき転写物が少なくとも18ヌクレオチドの長さに達し、ポリメラーゼRNA出口チャネルから出現した後、5'-グアノシンキャップの添加を触媒する。キャッピング反応の最初のステップでは、三ホスファターゼはRNA 5'-三リン酸を加水分解し、5'--二リン酸を得る。第2工程では、GTPをグアニチルトランスフェラーゼによってGMPに加水分解し、GMPキャッピング酵素中間体を形成する。最後に、グアニュリルトランスフェラーゼは、GMPを生まれつき転写物の5'-二リン酸末端に移し、キャップを産生する。
キャッピング反応の顕著な特徴は、同写物キャッピング(すなわち、機能的Pol II伸長複合体に関連する転写物のキャッピング)が遊びRNA5,9のキャッピングよりもはるかに効率的である。したがって、この分野の大きな問題は、キャッピングのこの劇的な活性化がPol II伸長複合体とのキャッピング酵素の相互作用によってどのように達成されるのかである。このプロトコルでは、精製されたRNAポリメラーゼIIおよび人工転写気泡のみを用いた活性RNAポリメラーゼII伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの方法は、定義された長さと配列の転写物を有するRNAポリメラーゼII伸長複合体の作成を可能にする。最近の研究では、これらの定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体をRNAキャッピング5のメカニズムの側面を調査するためのモデルとして使用した。特に、これらの伸長複合体に関連するRNAのキャッピングは、遊値RNAのキャッピングよりも100倍以上効率的であり、(ii)はPol II CTDのTFIIH依存性リン酸化によって刺激されたことを示した。ここで説明するアプローチは、原則として、Pol II伸長複合体にリンクされた他の共転写RNA処理反応を研究するための基板を生成するように適合させることができる。
このプロトコルのセクション1では、人工伸び複合体は、合成テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを、テンプレート鎖DNAの約9ヌクレオチドに対してその3'末端で相補的であるRNAオリゴヌクレオチドにアニールすることによって作成される。次に、Pol II が DNA:RNA 二重鎖にロードされます。伸長複合体は、その3'末端でビオチンで標識された部分的に相補的な非テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを添加することによって完了する(図1および図2A)。RNAオリゴヌクレオチドは、これらの伸長複合体におけるPol IIによって拡張され、放射性標識ヌクレオチドの適切な組み合わせの添加時に定義された長さと配列の放射標識転写物を作る。さらに、未組み込みのヌクレオチドを除去するワッシュの組み合わせを使用して、ヌクレオチドの異なる組み合わせをさらに添加し、1つは、DNAテンプレートに沿って異なる位置にPol IIを「歩く」と定義された長さのRNAを合成することができます。RNAは次いで精製され、尿素-PAGEゲルを脱ナーチジンで電気泳動を受ける。プロトコルのセクション2では、人工伸長複合体が共転写RNAキャッピングを分析するために使用される。提示された例は、共転写RNAキャッピングに対するPol II CTDのTFIIH依存リン酸化の効果を測定する。本実験では、キャッピング酵素濃度(反応当たり5、15、45ng)と時間(1、2、4分)の関数として、共写物キャッピングの程度を測定した。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

真核生物mRNA合成は、成熟したmRNAを形成する前駆体RNAの多サブユニット酵素RNAポリメラーゼIIおよび共写物キャッピングおよびスプライシングにより前駆体RNAへのDNAテンプレートの転写を必要とする複雑な生化学的プロセスである。mRNA合成中、RNAポリメラーゼII伸長複合体は、その触媒活性を制御する転写因子の大規模なコレクション、ならびに成熟したmRNAを作成するキャッピング、スプライシング、および3'処理酵素による調節の標的である。mRNA合成の本質的な複雑さのために、その様々な共転写段階の単離および調査を可能にするより単純な実験システムは大きな有用性を持っている。
本稿では,同写物RNAキャッピングの研究に適したそのような単純な実験システムについて述べた.このシステムは、精製されたポリメラーゼおよび人工転写気から組み立てられた定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体に依存する。ビオチン化DNAを介して固定化すると、これらのRNAポリメラーゼII伸長複合体は、同転写RNAキャッピングと、伸び複合体がカッピング酵素を募集し、調節するメカニズムを解剖するための容易に可動化可能なツールを提供します。共写RNAキャッピング。このシステムは、RNAポリメラーゼII伸長複合体に結合されたmRNA成熟の他の段階における役割を有するタンパク質またはタンパク質複合体の募集および/または組み立てを研究するために適応できると期待される。

図2および図3は、異なる供給源から拡張またはPol IIを拡張することによって異なる長さの転写物を含む人工伸長複合体を生成するために使用される代表的な結果反応を示す。図4は、これらの伸長複合体を共写性CTDリン酸化依存性RNAキャッピングのアッセイにどのように使用できるかを示す。
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

ここでは、短い合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドと精製されたPol IIのみを必要とするRNAポリメラーゼII(Pol II)伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの複合体は、Pol II伸長複合体に関連する転写物の共転写処理の基礎となるメカニズムを研究するのに有用である。

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

ここでは、Pol II転写とRNAキャッピングの機能的結合の調査に適したアクティブなPol II伸長複合体の再構成を可能にする簡単な実験システムを確立しました。この方法を使用すると、機能伸び複合体は、わずか数個のコンポーネントで簡単に組み立てることができます。伸びの複合体は磁気ビーズに固定化されるので、反応条件を変えやすい。磁気ビーズにビオチンを含むDNAオリゴを固定化するには、まず200マイクロリットルの磁気ビーズを低タンパク質結合1.5ミリリットルチューブに加え、次に2分間磁気ラックにチューブを置きます。チューブが磁気ラックにある間、ピペットを使用してビーズを邪魔することなくチューブから液体を取り除きます。ビーズを洗浄するには、ラックからチューブを取り出し、トリス塩酸塩、EDTA、塩化ナトリウムを含む洗浄バッファーを1ミリリットル加えます。チューブをラックに戻します。2分後、洗浄液を取り出し、同じバッファーの200マイクロリットルを使用してさらに2回洗浄を繰り返します。磁気ビーズを400マイクロリットルの2Xバッファーに再懸濁します。次に、380マイクロリットルの水と10マイクロモル非鋳型ビオチン化DNAオリゴの20マイクロリットルを加え、混合します。チューブをヌテーターに置き、室温で30分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルのバッファーを使用して固定化された非鋳型DNAオリゴでビーズを3回洗浄し、200マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーで3回洗浄します。BSAでビーズをブロックし終えるために一晩摂氏4度でチューブを保管してください。翌日、溶液を廃棄し、200マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーでビーズを再懸濁し、5マイクロモルの近似DNA濃度に達し、次にビーズと共に溶液を新しいチューブに移す。DNA-RNA二重を得るために、書かれたプロトコルに記載されているように、2対1のRNA-DNAモル比を有するPCRチューブに10マイクロリットルのアニーリングミックスを調製する。チューブをサーマルサイクラーに入れます。プログラムを摂氏45度に設定し、次にそれぞれ2分間の12サイクルを摂氏43度から始め、1サイクルあたり2度の温度を下げます。最後に、摂氏4度でアイドル状態に保ちます。精製されたRNAポリメラーゼIIをDNA-RNAハイブリッドにロードするには、DNA-RNAデュプレックスの1マイクロリットルを、13マイクロリットルの新しく調製したポリメラーゼIIバッファーをチューブに混合します。精製されたRNAポリメラーゼIIの1マイクロリットルを加え、気泡を導入することなく、上下に軽くピペットをピペット化し、ピペットチップで攪拌して混ぜます。チューブを摂氏30度で10分間インキュベートします。伸長複合体を完成させるために、固定化された非鋳型DNAオリゴビーズの1マイクロリットルを非鋳型DNAバッファーの14マイクロリットルに加え、以前インキュベートされたチューブに15マイクロリットルの混合物を加え、さらに10分間摂氏37度でインキュベートします。サンプルを磁気ラックに2分間置きます。30マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを1回洗い、非組み込みポリメラーゼIIおよびオリゴを除去します。RNA 23mersで伸び複合体に放射標識を付けるには、23マイクロリットルのパルスバッファーにATPの1マイクロリットルと1マイクロリットルの放射標識されたUTPを加え、この混合物を洗浄された磁気ビーズに加え再懸濁液にします。反応を10分間インキュベートし、23mersの放射標識合成を可能にする。100マイクロモルATPと100マイクロモルUTPミックスを含む溶液1.5マイクロリットルを3.5マイクロリットルのチェイスバッファに加え、ビーズ上にあらかじめ組み立てた伸び物を含むチューブに混合物を加えます。繰り返しますが、チューブを5分間インキュベートして、すべての新生転写物を23mersに追いかけます。次いで、チューブを磁気ラックの上に置き、以前に行ったように洗浄して、非法人ヌクレオチドを除去する。30マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを再懸濁します。より長い転写物を伴う伸び複合体を生成するには、前の手順に従い、4倍にスケールアップして、4つの反応に対して120マイクロリットルの洗浄された伸長複合体を生成する。ラベル3つの新しいチューブ23mer、25mer、および29mer。洗浄された伸び複合体の30マイクロリットルを23merチューブに移し、プロテナーゼKとグリコーゲンを含むストップミックスの94マイクロリットルを加える。残りの90マイクロリットルの洗浄された伸び複合体を含むチューブを磁気ラックに2分間置き、上清を取り除き、1.2マイクロリットルのATPとCTPを補充したBTBの90マイクロリットルでビーズを再懸濁します。摂氏30度で10分間インキュベートします。90マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄した後、30マイクロリットルの伸び複合体を25merチューブに移し、プロテイナーゼKとグリコーゲンを含むストップミックスの94マイクロリットルを加えます。再度、残りの60マイクロリットルの伸び複合体を含むチューブを磁気ラックに2分間置きます。ATPおよびCTPの0.8マイクロリットルで補われた緩衝液の60マイクロリットルでBTB処理を繰り返す。前に行ったようにインキュベーションと洗浄後、60マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを再懸濁します。サンプルから29merチューブに30マイクロリットルを移し、プロテイナーゼKとグリコーゲンを含むストップミックスの94マイクロリットルを加えます。変性ポリアクリルアミドゲルで反応生成物を分析します。まず、先に説明した手順を13倍にスケールアップして23マーを含む洗浄伸長複合体を生成し、12回の反応と1回の追加反応に対して390マイクロリットルを得る。ポリメラーゼII CTDのリン酸化を行うために、試料を磁気ラックに入れた後に上清を取り除き、BTBの377マイクロリットルでビーズを再懸濁する。2つの新しいチューブにHとマイナスH.ToプラスHを加え、1マイクロリットル当たり300ナノグラムの濃度で転写開始因子TFIIHの3マイクロリットルを追加し、マイナスHに9マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーを追加します。プラスHチューブに87マイクロリットルの洗浄された伸び複合体を加え、マイナスHチューブに261マイクロリットルを加えます。チューブを10分間インキュベートし、洗浄バッファーで洗浄します。RNAキャッピングを行う場合は、プラスHチューブにキャッピングミックス87マイクロリットル、マイナスHチューブに261マイクロリットルを加えて再懸濁します。4つの新しいチューブ、5プラスH、5マイナスH、15マイナスH、45マイナスHにラベルを付け、マイクロリットルキャッピング酵素あたり5、15、または45ナノグラムの3マイクロリットルを対応するチューブに分配します。次に、94マイクロリットルの停止バッファーを備えた12個の新しいチューブを準備します。TFIIHで処理した87マイクロリットルの伸び複合体を、ヒートブロック内の摂氏30度で5プラスH.Incubateとラベル付けしたチューブに加えて、最初のキャッピング反応を開始します。キャッピング反応は、ストップウォッチを使用して正確にタイミングを合わせたものである必要があります。複数の反応を処理する場合、各反応の開始時間はずらされるべきです。1、2、または4分後、5プラス反応混合物の30マイクロリットルを、1、2、および3個のストップバッファーを含む1、2、および3を標識したチューブに移し、反応を停止する。TFIIHなしで処理された伸び複合体を使用して、全く同じ方法で残りのマイナスHチューブ内のサンプルのキャッピング反応を進めます。変性ポリアクリルアミドゲルで反応生成物を分析します。人工伸長複合体におけるDNAおよびRNA分子の図をここに示す図。人工伸長複合体の組立時にRNAプライマーとして20ヌクレオチドの合成RNAオリゴを用い、プロトコルの各逐次歩行工程中にヌクレオチドを加え、23mer、25mer、および29merを生成した。異なる供給源からのRNAポリメラーゼIIを用いた反応を比較した。人工伸長複合体は、ラット肝臓または分裂酵母のいずれかから精製された内在性の野生型ポリメラーゼIIで組み立てられ、23mersまたは25mersを生成するために歩いた。アッセイを行い、5素数の三リン酸末端を有する23個のヌクレオチド転写物を含む人工伸長複合体に関連する放射標識された転写物のキャッピングを測定した。最後の2つのレーンは、TFIIHの存在下で酵素をキャッピングの有無にかかわらず伸長複合体がインキュベートされた反応の産物を示しています。よりゆっくりとより急速に移行するバンドには、それぞれ上限付きトランスクリプトと上限なしのトランスクリプトが含まれています。最初の12レーンは、リン酸化またはリン酸化されていないCTDを有する伸び複合体に関連する転写物のキャッピングを示す。ポリメラーゼIIと他の酵素の活性は準備から準備に異なる場合がありますので、最適なレベルを定義するために酵素濃度を滴定することによって反応条件を最適化する必要があります。放射性物質を安全に使用し、汚染を避けることは重要です。放射能実験を行う際は、必ず研究室や研究所のガイドラインに従ってください。

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...