Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Vi takker S. Shuman for å gi pattedyr capping enzymet cDNA. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelson Medical Research Fund ved Greater Kansas City Community Foundation.  Opprinnelige data underliggende dette manuskriptet kan nås fra Stowers opprinnelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. montering av kunstige forlengelse komplekser og Pol II walking
<ol><li>Nakkens 1 nmol av ikke-mal DNA oligo inneholder et 3 ' biotin molekyl på magnetiske perler. Merk: følgende trinn kan gjøres på forhånd for å forberede for fremtidige eksperimenter. Alle oligo sekvenser som brukes i denne protokollen, er angitt i tabell 1. RNA oligos er syntetisert med 5 '-trifosfat modifikasjoner.<ol>
<li>Tilsett 200 μL av magnetiske perler (10 mg/mL) til en lav-proteinbinding 1,5 mL r?...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

Studier det søke å analysere begivenheter koplet å Pol II forlengelse innviklet som RNA bearbeiding og reguleringen av utskriften forlengelse selv kan høyeste lettere ved bruk av en høylig renset enzym system. Sette opp slike enzym systemer kan være utfordrende. Promoter-avhengig transkripsjon av pol II krever minst fem generelle transkripsjon faktorer. Utarbeidelse og lagring av disse faktorene kan ta måneder; Derfor er det rate-begrensende trinn i denne prosessen ofte bare forbereder den av transkripsjon faktore...

Eukaryote Messenger RNA (mRNA)-syntese er en forseggjort biokjemiske prosess som involverer syntese av en ubehandlet forløper RNA ved RNA polymerase II og behandling av forløperen RNA for å gi den modne mRNA. RNA prosessering trinnene av capping, skjøting, og polyadenylation utføres i stor grad co-transcriptionally. Pol II forlengelse-komplekset fungerer som et stillas som rekrutterer og appartefakter aktivitetene til mange av RNA prosesserings enzymene. Følgelig, vår ultimate forståelse av hvordan modne eukaryote mRNAs genereres vil stole tungt på utviklingen av eksperimentelle systemer for å tillate Disseksjon av biokjemiske mekanismer underliggende rekruttering til forlengelse komplekse og regulering av enzymer ansvarlig for co-transcriptional capping, skjøting, og polyadenylation.
Ikke overraskende har utviklingen av slike eksperimentelle systemer vært vanskelig. Et stort hinder har vært bemerkelsesverdig kompleksiteten i Pol II transkripsjon selv der bare rekonstituering av basal transkripsjon av pol II in vitro krever et minimum sett av fem generelle transkripsjon innvielse faktorer: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, og TFIIH 1. dess, rekonstituering av noen form for REGULERT Pol II transkripsjon in vitro krever et enda større sett med transkripsjon faktorer og coregulators. Dermed har et stort mål vært å utvikle enklere eksperimentelle systemer slik rekonstituering av aktive Pol II forlengelse komplekser egnet for undersøkelser av funksjonell kopling av pol II transkripsjon og RNA prosessering.
En slik enklere metode for rekonstituering av aktiv Pol II forlengelse komplekser har vist seg nyttig for strukturelle og biokjemiske studier av elongating Pol II og, mer nylig, for å undersøke co-transcriptional RNA prosessering2,3 ,4,5. I denne artikkelen viser vi hvordan Pol II forlengelse komplekser tilberedt av renset Pol II og syntetisk transkripsjon bobler kan brukes effektivt for å undersøke mekanismene underliggende co-transcriptional capping av begynnende Pol II transkripsjoner.
Capping refererer til kovalente tillegg av en 5 '-guanosin "cap" til 5 '-trifosfat slutten av begynnende Pol II transkripsjoner. Hetten er viktig for påfølgende trinn av mRNA modning, transport, oversettelse, og andre prosesser6,7. Hetten er lagt co-transcriptionally til Pol II transkripsjoner av et enzym referert til som capping enzym. I pattedyrceller, aktive nettsteder ansvarlig for RNA 5 '-triphosphatase og guanylyl glutamyltransferase aktiviteter av capping enzymet er inneholdt innenfor en enkelt polypeptid8. Capping enzymet er rekruttert til Pol II forlengelse komplekse gjennom interaksjoner med ennå ikke er definert overflater på Pol II kroppen og Rpb1 carboxy-Terminal domene (CTD) fosforylert på Ser5 av sine heptapeptide gjentar5. I forlengelse komplekset, capping enzymet katalyserer tillegg av en 5-guanosin cap når begynnende transkripsjon når en lengde på minst 18 nukleotider og har dukket opp fra polymerase RNA exit kanal. I første trinn av capping-reaksjonen hydrolyzes triphosphatase RNA 5 '-trifosfat for å gi en 5-uridindifosfatglukuronosyltransferase. I det andre trinnet, er GTP hydrolysert til GMP av guanylyl glutamyltransferase, danner et GMP-capping enzym mellomliggende. Til slutt overfører guanylyl glutamyltransferase GMP til 5 '-uridindifosfatglukuronosyltransferase slutten av den begynnende transkripsjon å produsere hetten.
En bemerkelsesverdig trekk ved capping reaksjonen er at co-transcriptional capping (dvs. capping av transkripsjoner forbundet med funksjonell Pol II forlengelse komplekser) er mye mer effektivt enn capping av gratis RNA5,9. Således, et stort spørsmål i feltet har vært hvordan denne dramatiske aktiveringen av capping oppnås via interaksjoner av capping enzymet med Pol II forlengelse kompleks. I denne protokollen beskriver vi monteringen av aktive RNA polymerase II forlengelse komplekser med bare renset RNA polymerase II og kunstige transkripsjon bobler. Disse metodene tillater opprettelse av RNA polymerase II forlengelse komplekser med transkripsjoner av definert lengde og sekvens. I en fersk studie brukte vi disse definerte RNA polymerase II-forlengelse komplekser som modell for å undersøke aspekter ved mekanismene til RNA-capping5. Spesielt viste vi at (i) capping av RNA assosiert med disse forlengelse komplekser var mer enn 100-fold mer effektiv enn capping av fri RNA og (II) ble stimulert av TFIIH-avhengige fosforylering av pol II CTD. Tilnærmingen som beskrives her, kan i prinsippet tilpasses til å generere underlag for å studere andre transcriptional RNA-behandlings reaksjoner knyttet til Pol II-forlengelse komplekset.
I del 1 av denne protokollen, kunstige forlengelse komplekser er opprettet av annealing en syntetisk mal Strand DNA oligonukleotid til en RNA oligonukleotid som er komplementære på sitt 3 '-end til ca 9 nukleotider av malen Strand DNA. Pol II blir deretter lastet inn på DNA: RNA dupleks. Forlengelse komplekset blir deretter fullført ved tilsetning av en delvis utfyllende, ikke-mal Strand DNA-oligonukleotid som er merket med biotin på sitt 3 '-end (figur 1 og figur 2a). RNA-oligonukleotid utvides av pol II i disse forlengelse komplekser for å gjøre radiolabeled utskrifter av definert lengde og sekvens ved tilsetning av egnede kombinasjoner av radiolabeled nukleotider. I tillegg, ved hjelp av en kombinasjon av vasker for å fjerne næringsdrivende nukleotider og videre tillegg av ulike kombinasjoner av nukleotider, kan man "gå" Pol II til ulike posisjoner langs DNA malen og syntetisere RNA av definerte lengder. RNA blir deretter renset og utsatt for elektroforese i denaturering urea-side gels. I del 2 av protokollen brukes kunstige forlengelse komplekser til å analysere transcriptional RNA-capping. Eksempelet presentert måler effekten av TFIIH-avhengige fosforylering av pol II CTD på co-transcriptional RNA capping. I dette eksperimentet måler vi omfanget av co-transcriptional capping som en funksjon av capping enzym konsentrasjon (5, 15 og 45 ng per reaksjon) og tid (1, 2 og 4 min).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

Eukaryote mRNA syntese er en kompleks biokjemiske prosess som krever transkripsjon av en DNA-mal til en forløper RNA av multi-delenhet enzym RNA polymerase II og co-transcriptional capping og skjøting av forløperen RNA å danne den modne mRNA. Under mRNA syntese, er RNA polymerase II forlengelse komplekset et mål for regulering av en stor samling av transkripsjon faktorer som styrer sin katalysator, samt capping, skjøting, og 3 '-prosessering enzymer som skaper den modne mRNA. På grunn av den iboende kompleksiteten i mRNA syntese, enklere eksperimentelle systemer muliggjør isolering og etterforskning av sine ulike co-transcriptional stadier har stor nytte.
I denne artikkelen beskriver vi en slik enkel eksperimentell system egnet for å undersøke co-transcriptional RNA capping. Dette systemet er avhengig av definerte RNA polymerase II forlengelse komplekser samlet fra renset polymerase og kunstige transkripsjon bobler. Ved immobilisert via biotinylated DNA gir disse RNA polymerase II forlengelse komplekser et lett manipulable verktøy for dissekere med transcriptional RNA-capping og mekanismer der forlengelse komplekse rekrutter og regulerer capping enzym under transcriptional RNA-capping. Vi forventer at dette systemet kan bli tilpasset for å studere rekruttering og/eller montering av proteiner eller protein komplekser med roller i andre stadier av mRNA modning koplet til RNA polymerase II forlengelse kompleks.

Tall 2 og 3 viser representative resultat reaksjoner som brukes til å generere kunstige forlengelse komplekser som inneholder transkripsjoner av ulik lengde ved å utvide eller Pol II fra ulike kilder. Figur 4 viser hvordan disse forlengelse komplekser kan brukes til å analysen co-transcriptional CTD fosforylering-avhengige RNA capping.
Figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Her beskriver vi monteringen av RNA polymerase II (Pol II) forlengelse komplekser som kun krever kort syntetisk DNA og RNA-oligonukleotider og renset Pol II. Disse komplekser er nyttige for å studere mekanismer underliggende co-transcriptional behandling av transkripsjoner knyttet til Pol II forlengelse kompleks.

Kunstig RNA polymerase II forlengelse komplekser for dissekere co-transcriptional RNA prosessering hendelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Her har vi etablert et enkelt eksperimentelt system som tillater rekonstituering av aktive Pol II forlengelseskomplekser egnet for å undersøke funksjonell kobling av Pol II transkripsjon og RNA capping. Med denne metoden kan funksjonelle forlengelseskomplekser enkelt monteres med bare noen få komponenter. Forlengelseskompleksene immobiliseres på magnetiske perler, så det er lett å endre reaksjonsforhold.For å immobilisere DNA oligo som inneholder biotin på magnetiske perler, legg først til 200 mikroliter magnetiske perler til et lavproteinbindende 1,5-milliliter rør, og legg deretter røret på et magnetisk stativ i to minutter. Mens røret er på magnetstativet, bruk en pipette til å fjerne væsken fra røret uten å forstyrre perlene. For å vaske perlene, fjern røret fra stativet, og tilsett en milliliter vaskebuffer som inneholder Tris-hydroklorid, EDTA og natriumklorid.Sett røret tilbake til stativet. Etter to minutter, fjern vaskeoppløsningen, og gjenta vaskene to ganger til ved hjelp av 200 mikroliter av samme buffer. Resuspend de magnetiske perlene i 400 mikroliter av 2X buffer.Deretter legger du til 380 mikroliter vann og 20 mikroliter med 10 mikromos ikke-mal biotinylert DNA oligo å blande. Plasser røret på en nøtte, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter vasker du perlene med immobilisert ikke-mal DNA oligo tre ganger ved hjelp av 200 mikroliter buffer og deretter tre ganger med 200 mikroliter lagrings- og fortynningsbuffer.Oppbevar røret i fire grader Celsius over natten for å fullføre blokkeringen av perlene med BSA. Neste dag, kast løsningen, resuspend perlene i 200 mikroliter lagring og fortynning buffer, for å nå en omtrentlig DNA-konsentrasjon på fem mikromos, og deretter overføre løsningen med perlene til et nytt rør. For å få DNA-RNA duplex, forberede en 10-mikroliter glødeblanding i et PCR-rør med en to-til-en RNA-DNA molar ratio, som beskrevet i den skriftlige protokollen.Plasser røret i en termisk cycler. Sett programmet til 45 grader Celsius i fem minutter, etterfulgt av 12 sykluser på to minutter hver, starter på 43 grader Celsius og reduserer temperaturen med to grader Celsius per syklus. Til slutt, hold den inaktiv på fire grader Celsius.For å laste renset RNA polymerase II på DNA-RNA hybrid, bland en mikroliter DNA-RNA duplex med 13 mikroliter nylaget polymerase II buffer i et rør. Tilsett en mikroliter renset RNA polymerase II, og bland ved å forsiktig pipettering opp og ned og rør med pipettespissen, uten å introdusere bobler. Inkuber røret i 10 minutter ved 30 grader Celsius.For å fullføre forlengelseskomplekset, legg til en mikroliter immobilisert ikke-mal DNA oligo perler til 14 mikroliter av ikke-mal DNA-buffer, legg til 15-mikroliterblandingen til det tidligere inkuberte røret, og inkubere den i ytterligere 10 minutter ved 37 grader Celsius. Plasser prøven på magnetstativet i to minutter. Vask prøven en gang med 30 mikroliter vaskebuffer for å fjerne innlemmet polymerase II og oligos.For å radiomerket forlengelseskompleksene med RNA 23mers, legg til en mikroliter ATP og en mikroliter radiomerket UTP til 23 mikroliter pulsbuffer, og legg denne blandingen til de vasket magnetiske perlene for å gjenopplive. Inkuber reaksjonen i 10 minutter for å tillate syntese av radiomerket 23mers. Tilsett 1,5 mikroliter oppløsning som inneholder 100 mikromos ATP og 100 mikromos UTP-blanding til 3,5 mikroliter jagebuffer, og tilsett blandingen til røret som inneholder forhåndsmonterte forlengelseskomplekser på perler.Igjen, inkubere røret i fem minutter for å jage alle gryende transkripsjoner i 23mers. Deretter plasserer du røret på magnetstativet, og vasker som det tidligere ble gjort for å fjerne ikke-inkorporerte nukleotider. Bruk prøven på en resuspend i 30 mikroliter vaskebuffer.For å generere forlengelseskomplekser med lengre transkripsjoner, følg de forrige prosedyrene, og skaler opp firedert for å generere 120 mikroliter vasket forlengelseskomplekser for fire reaksjoner. Merk tre nye rør 23mer, 25mer og 29mer. Overfør 30 mikroliter vasket forlengelseskomplekser til 23mer-røret, og tilsett 94 mikroliter stoppblanding som inneholder proteinase K og glykogen.Plasser røret som inneholder de resterende 90 mikroliter av vasket forlengelseskomplekser på magnetstativet i to minutter, fjern de supernatante og resuspend perlene i 90 mikroliter btb supplert med 1,2 mikroliter ATP og CTP. Inkuber i 10 minutter ved 30 grader Celsius. Etter vask med 90 mikroliter vaskebuffer, overfør 30 mikroliter forlengelseskomplekser til 25mer-røret, og tilsett 94 mikroliter stoppblanding som inneholder proteinase K og glykogen.Igjen, plasser røret som inneholder de resterende 60 mikroliter av forlengelseskomplekser på magnetstativet i to minutter. Gjenta BTB-behandlingen med 60 mikroliter buffer supplert med 0,8 mikroliter ATP og CTP. Etter inkubasjon og vasking som gjort før, resuspend prøven i 60 mikroliter vaskebuffer.Overfør 30 mikroliter fra prøven til 29mer-røret, og tilsett 94 mikroliter stoppblanding som inneholder proteinase K og glykogen. Analyser reaksjonsprodukter på en denaturing polyakrylamidgel. Først generere vasket forlengelse komplekser som inneholder 23mers ved å skalere opp 13-fold prosedyren tidligere beskrevet for å få 390 mikroliter for 12 reaksjoner og en ekstra.For å utføre fosforylering av polymerase II CTD, fjern supernatanten etter å ha plassert prøven i magnetstativet, og gjenbruk perlene i 377 mikroliter btb. Merk to nye rør pluss H og minus H.To pluss H, tilsett tre mikroliter transkripsjonsinitieringsfaktor TFIIH ved konsentrasjon av 300 nanogram per mikroliter, og til minus H, tilsett ni mikroliter lagrings- og fortynningsbuffer. Tilsett 87 mikroliter av de vasket forlengelseskompleksene til pluss H-røret og 261 mikroliter til minus H-røret.Inkuber rørene i 10 minutter, og vask med vaskebuffer. For å utføre RNA-capping, tilsett 87 mikroliter capping mix til pluss H-røret og 261 mikroliter til minus H-røret for å gjenbruke. Merk fire nye rør, fem pluss H, fem minus H, 15 minus H og 45 minus H, og dispenser tre mikroliter på fem, 15 eller 45 nanogram per mikroliter capping enzymet i tilsvarende rør.Deretter klargjør du 12 nye rør med 94 mikroliter stoppbuffer. Start den første capping reaksjonen ved å legge til 87 mikroliter av forlengelseskompleks behandlet med TFIIH til røret merket fem pluss H.Incubate ved 30 grader Celsius i en varmeblokk. Avsnkapret reaksjonene må være nøyaktig tidsstet ved hjelp av en stoppeklokke.Når du arbeider med flere reaksjoner, bør starttidene for hver reaksjon forskyses. Etter ett, to eller fire minutter overfører du 30 mikroliter av de fem pluss reaksjonsblandingen til rør merket en, to og tre som inneholder 94 mikroliter stoppbuffer for å stoppe reaksjonene. Fortsett med capping reaksjoner for prøvene i de resterende minus H rørene på nøyaktig samme måte, ved hjelp av forlengelseskomplekser behandlet uten TFIIH.Analyser reaksjonsprodukter på en denaturing polyakrylamidgel. Et diagram er vist her for DNA og RNA molekyler i kunstige forlengelseskomplekser. Ved hjelp av syntetisk RNA oligo av 20 nukleotider som RNA primer under montering av kunstig forlengelse komplekser, nukleotider ble lagt under hver sekvensiell gange trinn av protokollen for å generere en 23mer, en 25mer, og en 29mer.Reaksjoner som bruker RNA polymerase II fra forskjellige kilder ble sammenlignet. Kunstige forlengelseskomplekser ble satt sammen med endogene, vill-type polymerase II renset fra enten rottelever eller fisjonsgjær og gikk for å generere 23mers eller 25mers. En analyse ble utført for å måle capping av radiomerkede transkripsjoner forbundet med kunstige forlengelseskomplekser som inneholder 23 nukleotidtranskripsjoner med en fem-prime trifosfatende.De to siste banene viser produktene av reaksjoner der forlengelseskomplekser ble inkubert med eller uten capping enzymet i nærvær av TFIIH. De langsommere og raskere migrerende båndene inneholder henholdsvis avkortet og uavslutning. De første 12 banene viser capping av transkripsjoner forbundet med forlengelseskomplekser med enten en fosforylert eller ukosforylert CTD.Aktiviteter av polymerase II og andre enzymer kan variere fra prep til prep, så det er nødvendig å optimalisere reaksjonsforholdene ved å titrere enzymkonsentrasjoner for å definere optimale nivåer. Det er viktig å bruke radioaktivt materiale på en trygg måte og for å unngå kontaminering. Vennligst sørg for å følge laboratoriet og institutt retningslinjer når du gjør eksperimenter med radioaktivitet.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA rullegardinmenyen prosedyre å identifisere RNA mål av en lenge ikke-koding

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolsk merking med 4-thiouracil og kvantifisering av nylig syntetisert mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning for pattedyr systemer

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse for kvantifisere protein-RNA binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...