Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Мы благодарим С. Шумана за предоставление фермента укупорки млекопитающих кДНК. Эта работа была частично поддержана грантом Института медицинских исследований Stowers от Фонда медицинских исследований Хелен Нельсон в Большом Канзас-Сити.  Исходные данные, лежащие в основе этой рукописи, можно получить из хранилища исходных данных Stowers в http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. Сборка искусственных удлинений комплексов и Пол II Ходьба
<ol><li>Обездвижить 1 нмоль нешаблонного олиго ДНК, содержащего молекулу биотина 3' на магнитных бусинах. ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги можно сделать заранее, чтобы подготовиться к будущим экспериментам. Все последователь...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTD-dependent+and+-independent+mechanisms+govern+co-transcriptional+capping+of+Pol+II+transcripts.">CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).</li><li>Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+capping:+biological+functions+and+applications.">mRNA capping: biological functions and applications.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).</li><li>Ghosh, A., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology+of+RNA+cap+synthesis.">Enzymology of RNA cap synthesis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).</li><li>Moteki, S., Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+capping+and+transcription+of+mRNA.">Functional coupling of capping and transcription of mRNA.</a> Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).</li><li>Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+polymerase+II+transcription+factor+shares+functional+properties+with+Escherichia+coli+sigma+70.">An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70.</a> Science. 248, 1550-1553 (1990).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+transcription:+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution.">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li><li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

Исследования, которые стремятся вскрыть события в сочетании с комплексом удлинения Pol II, таким как обработка РНК и регулирование самой удлинения стенограммы, могут быть значительно облегчены с помощью высокоочищенной ферментной системы. Настройка таких ферментных систем может быть с?...

Эукариотический посыльный РНК (мРНК) синтез является сложным биохимическим процессом, который включает в себя синтез необработанной РНК-прекурсоров РНК-полимераза II и обработка РНК-прекурсора для получения зрелой мРНК. Этапы обработки РНК, укупорки, сращивания и полиаденилаации выполняются в основном совместно транскрипционно. Комплекс удлинения Pol II служит эшафотом, который вербует и организует деятельность многих ферментов обработки РНК. Следовательно, наше окончательное понимание того, как образуются зрелые эукариотические мРНК, будет в значительной степени опираться на разработку экспериментальных систем, позволяющих рассеивать биохимические механизмы, лежащие в основе набора в удлинение комплекса и регулирование ферментов, ответственных за совместное транскрипционное укупорки, сплайсинг и полиаденилацию.
Неудивительно, что разработка таких экспериментальных систем была сложной задачей. Основным препятствием была замечательная сложность самой транскрипции Pol II, где просто ездовестяя базальную транскрипцию Pol II in vitro требует минимального набора из пяти общих факторов инициации транскрипции: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH 1. Кроме того, восстановление любого вида регулируемой транскрипции Pol II in vitro требует еще большего набора транскрипционных факторов и корегуляторов. Таким образом, основной целью было разработать более простые экспериментальные системы, позволяющие воссоздать активные комплексы удлинения Pol II, пригодные для исследования функционального соединения транскрипции Пол II и обработки РНК.
Один из таких простых методов для восстановления активных комплексов удлинения Пол II оказался полезным для структурных и биохимических исследований удлинения Pol II и, в последнее время, для исследования совместной транскрипционной обработки РНК2,3 ,4,5. В этой статье мы покажем, как комплексы удлинения Pol II, приготовленные из очищенного Поля II и синтетических пузырей транскрипции, могут быть эффективно использованы для исследования механизмов, лежащих в основе котранскрипционного укупорки зарождающихся транскриптов Pol II.
Capping относится к ковалентное добавление 5'-гуанозин "шапка" на 5'-трифосфат конце зарождающейся Пол II стенограммы. Крышка важна для последующих этапов созревания мРНК, транспортировки, перевода и других процессов6,7. Крышка добавляется совместно транскрипционно в пол II стенограммы фермента называют укупорки фермента. В клетках млекопитающих активные участки, ответственные за РНК 5'-трифосфатаза и гуанилил трансферазы деятельности фермента укупорки, содержатся в одном полипептиде8. Фермент укупорки завербован к комплексу удлинения Pol II через взаимодействия с еще не определенными поверхностями на теле Pol II и домене rpb1 carboxy-терминального (CTD) фосфорилона на Ser5 его гептапептида повторяет5. В комплексе удлинения фермент укупорки катализает добавление крышки 5'-гуанозин, как только зарождающийся транскрипт достигает длины не менее 18 нуклеотидов и вышел из канала выхода из полимеразной РНК. На первом этапе реакции укупорки, трифосфатазы гидролизов РНК 5'-трифосфат аудионизирует 5'-дифосфат. На втором этапе GTP гидролизуется до GMP гуанилил-трансферазой, образуя промежуточный фермент GMP-capping. Наконец, гуанылил трансферазы передает GMP в 5'-дифосфатный конец зарождающегося транскрипта для получения крышки.
Примечательной особенностью укупорки реакции является то, что совместнотранскрипционные укупорки (т.е. укупорки стенограмм, связанных с функциональными комплексами удлинения Пол II) является гораздо более эффективным, чем укупорки свободной РНК5,9. Таким образом, главный вопрос в этой области заключается в том, как эта драматическая активация укупорки достигается через взаимодействие фермента укупорки с комплексом удлинения Pol II. В этом протоколе мы описываем сборку активных комплексов рнк-полимеразы II с использованием только очищенной РНК-полимеразы II и искусственных транскрипционных пузырей. Эти методы позволяют создавать удлинение РНК-полимераза II комплексов с транскриптами определенной длины и последовательности. В недавнем исследовании, мы использовали эти определенные РНК полимеразы II удлинение комплексов в качестве модели для изучения аспектов механизмов РНК укупорки5. В частности, мы показали, что (i) укупорки РНК, связанные с этими удлинением комплексов, были более чем в 100 раз более эффективными, чем ограничение свободной РНК и (ii) стимулировалось TFIIH-зависимым фосфорилированием Pol II CTD. Описанный здесь подход в принципе можно было бы адаптировать для генерации субстратов для изучения других реакций по обработке РНК, связанных с комплексом удлинения Пол II.
В разделе 1 этого протокола, искусственные комплексы удлинения создаются путем аннулирования синтетического шаблона нити ДНК олигонуклеотида к Олигонуклеотид РНК, который дополняет в своем 3'-end примерно 9 нуклеотидов шаблона нити ДНК. Пол II затем загружается на ДНК: РНК дуплекс. Удлинение комплекс затем завершается добавлением частично дополняющих, не-шаблон наяп ДНК олигонуклеотида, который помечен с биотином на его 3'-конец (Рисунок 1 и Рисунок 2A). Олигонуклеотид РНК продлевается Полом II в этих удлиненных комплексах, чтобы сделать радиомаркированные транскрипты определенной длины и последовательности при добавлении соответствующих комбинаций радиомаркированных нуклеотидов. Кроме того, используя комбинацию смок для удаления неинкорпорированных нуклеотидов и дальнейшего добавления различных комбинаций нуклеотидов, можно «ходить» пол II в разные позиции по шаблону ДНК и синтезировать РНК определенных длин. РНК затем очищается и подвергается электрофорезу в денатурируя гели мочевины-PAGE. В разделе 2 протокола для анализа котранскрипционной РНК-укупорки используются комплексы искусственного удлинения. В приведенном примере представлены меры воздействия фосфорилирования TFIIH на совместное транскрипционное укупорки РНК. В этом эксперименте мы измеряем степень котранскрипционного укупорки как функцию укупорки концентрации фермента (5, 15 и 45 нг на реакцию) и время (1, 2 и 4 мин).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

Эукариотический синтез мРНК представляет собой сложный биохимический процесс, требующий транскрипции шаблона ДНК в прекурсор РНК многосубединым ферментом РНК-полимераза II и сотранскрипционным укупоркой и сплайсингом РНК-прекурсора для формирования зрелой мРНК. Во время синтеза мРНК комплекс удлинения РНК-полимеразы II является мишенью для регулирования большой коллекцией транскрипционных факторов, контролирующих его каталитической активностью, а также укупорки, сращивания и 3'обработки ферментов, которые создают зрелые мРНК. Из-за присущей им сложности синтеза мРНК более простые экспериментальные системы, позволяющие проводить изоляцию и исследование различных стадий сотранскрипции, обладают большой полезностью.
В этой статье мы описываем одну из таких простых экспериментальных систем, пригодных для исследования котранскрипционной РНК-укупорки. Эта система опирается на определенные комплексы рнк-полимеразы II, собранные из очищенной полимеразы и искусственных транскрипционных пузырьков. При обездвижении с помощью биотинителированной ДНК эти комплексы рнк-полимераза II удлинения обеспечивают легко манипулируемый инструмент для вскрытия котранскрипционной РНК-укупорки и механизмов, с помощью которых комплекс удлинения набирает и регулирует укудчивую фермент во время скотрансктионная РНК укупорки. Мы ожидаем, что эта система может быть адаптирована для изучения набора и/или сборки белков или белковых комплексов с ролями на других стадиях созревания мРНК в сочетании с комплексом вытяжения РНК-полимеразы II.

Цифры 2 и 3 показывают репрезентативные реакции результатов, используемые для генерации комплексов искусственного удлинения, содержащих транскрипты различной длины путем расширения или Pol II из различных источников. На рисунке 4 пока?...

Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Здесь мы описываем сборку РНК-полимеразы II (Pol II) удлиненных комплексов, требующих только коротких синтетических ДНК и Олигонуклеотидов РНК и очищенных Пол II. Эти комплексы полезны для изучения механизмов, лежащих в основе совместной транскрипционной обработки стенограмм, связанных с комплексом удлинения Пол II.

Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Здесь мы создали простую экспериментальную систему, которая позволяет воссоздать активные комплексы удлинения Pol II, пригодные для исследования функциональной связи транскрипции Pol II и ограничения РНК. С помощью этого метода функциональные удлининные комплексы могут быть легко собраны всего с несколькими компонентами. Удлиненные комплексы обездвижены на магнитных бусинках, поэтому легко изменить условия реакции.Чтобы обездвижить ДНК-олиго, содержащее биотин на магнитных бусинках, сначала добавьте 200 микролитров магнитных бусин в низко белковый связующий 1,5-миллилитровую трубку, а затем поместите трубку на магнитную стойку на две минуты. В то время как трубка находится на магнитной стойке, используйте пипетку, чтобы удалить жидкость из трубки, не нарушая бисера. Чтобы вымыть бисер, снимите трубку со стойки и добавьте один миллилитр буфера для мытья, содержащего трис-гидрохлорид, ЭДТА и хлорид натрия.Верните трубку в стойку. Через две минуты снимите раствор для мытья и повторите стирку еще два раза с помощью 200 микролитров одного буфера. Перепродюсните магнитные бусы в 400 микролитров 2X буфера.Затем добавьте 380 микролитров воды и 20 микролитров 10-микромолярной недатальной биотинилированной ДНК олиго для смешивания. Поместите трубку на нутритор и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого, мыть бисер с обездвиженными не-шаблон ДНК олиго три раза с помощью 200 микролитров буфера, а затем три раза с 200 микролитров хранения и разбавления буфера.Храните трубку при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы закончить блокирование бисера с BSA. На следующий день, отбросив раствор, повторно посовестить бисер в 200 микролитров буфера хранения и разбавления, чтобы достичь приблизительной концентрации ДНК в пять микромолеров, а затем перенести раствор с бисером в новую трубку. Для получения дуплекса ДНК-РНК подготовьте 10-микролитровую аннальную смесь в трубке ПЦР с соотношением рЯС-ДНК-ДНК два к одному, как описано в письменном протоколе.Поместите трубку в тепловой циклер. Установите программу до 45 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем 12 циклов по две минуты каждый, начиная с 43 градусов по Цельсию и снижение температуры на два градуса по Цельсию за цикл. Наконец, держать его без дела при четырех градусах по Цельсию.Для загрузки очищенной РНК-полимеразы II на гибрид ДНК-РНК смешайте один микролитер дуплекса ДНК-РНК с 13 микролитров свежеприготовленного буфера полимеразы II в трубке. Добавьте один микролитер очищенной РНК-полимеразы II и перемешайте, аккуратно трубя вверх и вниз и помешивая кончиком пипетки, не вводя пузырьков. Инкубировать трубку в течение 10 минут при 30 градусах по Цельсию.Чтобы завершить удлиненный комплекс, добавьте один микролитер обездвиженных неконфектных олиго-бусин ДНК до 14 микролитров неконфюкерного буфера ДНК, добавьте 15-микролитровую смесь в ранее инкубированную трубку и инкубировать ее еще на 10 минут при 37 градусах Цельсия. Поместите образец на магнитную стойку на две минуты. Вымойте образец один раз с 30 микролитров мыть буфера для удаления неинкорпорированных полимеразы II и oligos.Чтобы радиолабельировать удлиненные комплексы с РНК 23mers, добавьте один микролитер АТФ и один микролитер радиозапомощенного UTP до 23 микролитров импульсного буфера, и добавьте эту смесь в промытые магнитные бусы для повторного перерасхода. Инкубировать реакцию в течение 10 минут, чтобы синтез radiolabeled 23mers. Добавьте 1,5 микролитров раствора, содержащего 100-микромолерный АТФ и 100-микромолярный UTP микс, в 3,5 микролитров буфера погони и добавьте смесь в трубку, содержащую предварительно собранные удлиненные комплексы на бисере.Опять же, инкубировать трубку в течение пяти минут, чтобы преследовать все зарождающиеся стенограммы в 23mers. Затем поместите трубку на магнитную стойку и вымойте, как это было сделано ранее, чтобы удалить неинкорпорированные нуклеотиды. Перепродюсатор образца в 30 микролитров буфера для мытья.Для создания удлиненных комплексов с более длительными транскриптами, следуйте предыдущим процедурам, и масштабировать в четыре раза для создания 120 микролитров промытых удлиненных комплексов для четырех реакций. Этикетка три новые трубы 23mer, 25mer, и 29mer. Перенесите 30 микролитров промытых удлинионных комплексов в 23мерную трубку и добавьте 94 микролитров стоп-микса, содержащего протеиназу K и гликоген.Поместите трубку, содержащую оставшиеся 90 микролитров промытых удлиненных комплексов, на магнитную стойку на две минуты, удалите супернатант и повторно снимите бисер в 90 микролитров BTB, дополненных 1,2 микролитров АТФ и КТП. Инкубировать в течение 10 минут при 30 градусах по Цельсию. После мытья 90 микролитров буфера стирки перенесите 30 микролитров удлиненных комплексов в 25мерную трубку и добавьте 94 микролитров стоп-микса, содержащего протеиназу K и гликоген.Опять же, поместите трубку, содержащую оставшиеся 60 микролитров удлиненных комплексов, на магнитную стойку в течение двух минут. Повторите лечение BTB с 60 микролитров буфера дополнены 0,8 микролитров АТФ и CTP. После инкубации и мытья, как это было сделано раньше, повторно помыть образец в 60 микролитров буфера мытья.Перенесите 30 микролитров из образца в 29мерную трубку и добавьте 94 микролитров стоп-микса, содержащего протеиназу K и гликоген. Проанализируйте реакционной продукции на денатурации полиакриламинидного геля. Во-первых, создать вымытые удлиненные комплексы, содержащие 23mers путем расширения в 13 раз процедуры ранее описанные для получения 390 микролитров для 12 реакций и один дополнительный.Для выполнения фосфорилирования полимеразы II CTD, удалить супернатант после размещения образца в магнитной стойке, и повторно использовать бисер в 377 микролитров BTB. Этикетка две новые трубки плюс H и минус H.To плюс H, добавить три микролитера транскрипции инициации фактор TFIIH при концентрации 300 нанограмм на микролитер, и до минус H, добавить девять микролитров хранения и разбавления буфера. Добавьте 87 микролитров промытых удлиненных комплексов к трубке plus H и 261 микролитера к минусУ трубки H.Инкубировать трубки в течение 10 минут, и мыть буфером для мытья. Для выполнения РНК укупорки, добавить 87 микролитров укупорки смеси плюс H трубки и 261 микролитров в минус H трубки для повторного перерасхода. Этикетка четыре новые трубки, пять плюс H, пять минус H, 15 минус H, и 45 минус H, и обойтись три микролитера из пяти, 15 или 45 нанограмм на микролитер укупорки фермента в соответствующие трубки.Затем подготовь 12 новых трубок с 94 микролитровами стоп-буфера. Начните первую капинговую реакцию, добавив 87 микролитров удлиненного комплекса, обработанных TFIIH, в трубку с надписью 5 плюс H.Incubate при температуре 30 градусов по Цельсию в тепловом блоке. Укупорки реакции должны быть точно приучены с помощью секундомера.При работе с несколькими реакциями время начала каждой реакции должно быть ошеломлено. После одной, двух или четырех минут, передача 30 микролитров из пяти плюс реакция смеси труб помечены один, два, и три, содержащие 94 микролитров стоп-буфера, чтобы остановить реакции. Продолжить с укупорки реакции для образцов в оставшихся минус H труб точно так же, используя удлиненные комплексы обрабатываются без TFIIH.Проанализируйте реакционной продукции на денатурации полиакриламинидного геля. Здесь показана диаграмма молекул ДНК и РНК в искусственных удлиненных комплексах. Используя синтетический РНК-олиго из 20 нуклеотидов в качестве грунтовки РНК во время сборки искусственных комплексов удлинения, нуклеотиды были добавлены во время каждого последовательного шага ходьбы протокола для создания 23mer, 25mer, и 29mer.Сравнивались реакции с использованием РНК-полимеразы II из разных источников. Искусственные удлиненные комплексы были собраны с эндогенной полимеразой дикого типа II, очищенной от крысиной печени или дрожжей деления, и шли для генерации 23mers или 25mers. Анализ был выполнен для измерения укупорки радиозаклеенных транскриптов, связанных с искусственными удлиненными комплексами, содержащими 23 нуклеотидных транскрипта с пятиступным трифосфатным концом.Последние две полосы показывают продукты реакций, в которых удлиненные комплексы инкубировались с или без укупорки фермента в присутствии TFIIH. Более медленно и более быстро мигрирующие полосы содержат ограниченные и необнаменные стенограммы, соответственно. Первые 12 полос показывают укупорку транскриптов, связанных с удлиненными комплексами с фосфорилированным или нефосфорилированным CTD.Деятельность полимеразы II и других ферментов может варьироваться от подготовки к подготовке, поэтому необходимо оптимизировать условия реакции путем определения концентрации ферментов для определения оптимального уровня. Важно безопасно использовать радиоактивный материал и избегать загрязнения. Пожалуйста, не забудьте следовать вашим лабораторным и институтом руководящих принципов при проведении экспериментов с радиоактивностью.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Пивоваренные дрожжи Метаболические маркировки с 4-thiouracil и количественная оценка недавно синтезированных мРНК как прокси для РНК-полимераза II деятельности

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

ТРИФОСФАТЫ руководство РНК клонирования млекопитающих систем

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Анализ для количественной протеино-РНК Связывания в бактериях

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...