Name: artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events at JoVE.com

Agradecemos a S. Shuman por proporcionar la enzima de tapado de mamíferos cDNA. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención al Instituto Stowers para la Investigación Médica del Fondo de Investigación Médica Helen Nelson de la Greater Kansas City Community Foundation.  Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito desde el repositorio de datos original de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. Montaje de Complejos de Elongación Artificial y Caminar Pol II
<ol><li>Inmovilizar 1 nmol de ADN no-plantilla oligo que contiene una molécula de biotina de 3' en cuentas magnéticas. NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar con antelación para prepararse para futuros experimentos. Todas las secuencias de oligo utilizadas en este protocolo se proporcionan en la Tabla1. Los oligos de ARN se sintetizan con 5'-trifosfato modificaciones.<ol>
<li>Añadir 200 l de perlas magnét...

<ol>
	<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription:+structure+and+mechanism.">RNA polymerase II transcription: structure and mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).</li><li>Daube, S. S., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transcription+elongation+complexes+from+synthetic+RNA-DNA+bubble+duplexes.">Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes.</a> Science. 258, 1320-1324 (1992).</li><li>Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8-nucleotide-long+RNA:DNA+hybrid+is+a+primary+stability+determinant+of+the+RNA+polymerase+II+elongation+complex.">The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping.">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li><li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II.">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li><li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA.">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li><li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF.">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li><li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6.">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li><li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage.">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li></ol>

Los estudios que buscan diseccionar eventos acoplados al complejo de elongación Pol II como el procesamiento de ARN y la regulación del alargamiento de la transcripción en sí pueden ser facilitados en gran medida mediante el uso de un sistema enzimático altamente purificado. La configuración de estos sistemas enzimáticos puede ser un desafío. La transcripción dependiente del promotor por parte de la Pol II requiere al menos cinco factores de transcripción generales. Preparar y almacenar estos factores puede lle...

La síntesis de ARN mensajero eucariota (ARNm) es un elaborado proceso bioquímico que implica la síntesis de un ARN precursor no procesado por ARN polimerasa II y el procesamiento del ARN precursor para producir el ARNm maduro. Los pasos de procesamiento de ARN de tapado, empalme y poliadenilación se llevan a cabo en gran medida de forma co-transcripción. El complejo de alargamiento Pol II sirve como un andamio que recluta y orquesta las actividades de muchas de las enzimas de procesamiento de ARN. En consecuencia, nuestra comprensión última de cómo se generan los ARNm eucariotas maduros dependerá en gran medida del desarrollo de sistemas experimentales que permitan la disección de los mecanismos bioquímicos subyacentes al reclutamiento al complejo de alargamiento y regulación de las enzimas responsables de la limitación co-transcripción, empalme y poliadenilación.
No es de extrañar que el desarrollo de estos sistemas experimentales haya sido difícil. Un impedimento importante ha sido la notable complejidad de la propia transcripción de la Pol II, donde la simple reconstitución de la transcripción basal por Pol II in vitro requiere un conjunto mínimo de cinco factores generales de iniciación de la transcripción: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH 1. Además, la reconstitución de cualquier tipo de transcripción regulada de Pol II in vitro requiere un conjunto aún mayor de factores de transcripción y coreguladores. Por lo tanto, un objetivo importante ha sido desarrollar sistemas experimentales más simples que permitan la reconstitución de complejos de alargamiento activos de Pol II adecuados para la investigación del acoplamiento funcional de la transcripción de Pol II y el procesamiento de ARN.
Uno de esos métodos más sencillos para reconstituir complejos de alargamiento activos de la Pol II ha demostrado ser útil para los estudios estructurales y bioquímicos de alargamiento de la Pol II y, más recientemente, para investigar el procesamiento de ARN co-transcripcional2,3 ,4,5. En este artículo, mostramos cómo los complejos de elongación Pol II preparados a partir de Pol II purificado y las burbujas de transcripción sintética se pueden utilizar eficazmente para investigar los mecanismos subyacentes al taponamiento co-transcripcional de las nacientes transcripciones pol II.
El taponamiento se refiere a la adición covalente de una "tapa" de 5'-guanosina al extremo 5'-trifosfato de las nacientes transcripciones Pol II. El límite es importante para los pasos posteriores de maduración del ARNm, transporte, traducción y otros procesos6,7. La tapa se añade co-transcripcionalmente a las transcripciones de Pol II por una enzima conocida como enzima de taponamiento. En las células de mamíferos, los sitios activos responsables de las actividades de ARN 5'-trifosfatasa yguanylyl transferasa de la enzima de taponamiento están contenidos dentro de un solo polipéptido 8. La enzima de tapado se contrata para el complejo de elongación Pol II a través de interacciones con superficies aún por definir en la carrocería Pol II y el dominio carboxi-terminal Rpb1 (CTD) fosforilado en Ser5 de su heptapéptido repite5. En el complejo de alargamiento, la enzima de tapado cataliza la adición de una tapa de 5'-guanosina una vez que la transcripción naciente alcanza una longitud de al menos 18 nucleótidos y ha surgido del canal de salida del ARN polimerasa. En el primer paso de la reacción de taponamiento, la trifosfatasa hidroliza el ARN 5'-trifosfato para producir un 5'-difosfato. En el segundo paso, GTP es hidrolizado a GMP por la guanylyl transferasa, formando una enzima GMP-capping intermedia. Finalmente, la guanylyl transferasa transfiere GMP al extremo 5'-difosfato de la naciente transcripción para producir la tapa.
Una característica notable de la reacción de tapado es que el taponamiento co-transcripcional (es decir, el taponamiento detranscripciones asociadas con complejos de alargamiento funcional Pol II) es mucho más eficiente que el taponamiento del ARN libre 5,9. Por lo tanto, una pregunta importante en el campo ha sido cómo esta activación dramática de la tapado se logra a través de interacciones de la enzima de tapado con el complejo de elongación Pol II. En este protocolo describimos el ensamblaje de complejos de alargamiento activos de ARN polimerasa II utilizando únicamente ARN polimerasa II purificado y burbujas de transcripción artificial. Estos métodos permiten la creación de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II con transcripciones de longitud y secuencia definidas. En un estudio reciente, utilizamos estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II definidos como modelo para investigar aspectos de los mecanismos de limitación de ARN5. En particular, mostramos que i) el taponamiento del ARN asociado a estos complejos de alargamiento era más de 100 veces más eficiente que el taponamiento del ARN libre y ii) fue estimulado por la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II. El enfoque descrito aquí podría, en principio, adaptarse para generar sustratos para el estudio de otras reacciones de procesamiento de ARN co-transcripcional vinculadas al complejo de alargamiento Pol II.
En la sección 1 de este protocolo, los complejos de alargamiento artificial se crean recocidos de un oligonucleótido de ADN de hilo de plantilla sintética a un oligonucleótido de ARN que es complementario en su extremo 3 a aproximadamente 9 nucleótidos del ADN de la hebra de la plantilla. Pol II se carga entonces en el dúplex DNA:RNA. El complejo de alargamiento se completa mediante la adición de un oligonucleótido de ADN de cadena parcialmente complementario y no-plantilla que se etiqueta con biotina en su extremo 3 (Figura1 y Figura 2A). El oligonucleótido de ARN es ampliado por Pol II en estos complejos de alargamiento para hacer transcripciones radioetiquetas de longitud y secuencia definidas tras la adición de combinaciones apropiadas de nucleótidos radiomarcados. Además, utilizando una combinación de lavados para eliminar nucleótidos no incorporados y la adición adicional de diferentes combinaciones de nucleótidos, se puede "caminar" Pol II a diferentes posiciones a lo largo de la plantilla de ADN y sintetizar ARN de longitudes definidas. El ARN se purifica y se somete a electroforesis en geles de urea-PAGE desnaturalizantes. En la sección 2 del protocolo, los complejos de alargamiento artificial se utilizan para analizar el taponamiento de ARN co-transcripcional. El ejemplo presentado mide el efecto de la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II en el taponamiento del ARN co-transcripcional. En este experimento, medimos el alcance del tapón co-transcripcional en función de la concentración de enzimas de taponamiento (5, 15 y 45 ng por reacción) y el tiempo (1, 2 y 4 min).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[&#945;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG007H001MC</td>
			<td>For radiolabeling RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Highly recommended. For preparing RNA during gel loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Bis:Acrylamide solution</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (20 mg/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &#181;g</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>14-476</td>
			<td>Used to phosphorylate Pol II CTD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for purity specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600-15-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaXtract high density tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129046</td>
			<td>Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20&#8201;mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA oligonucleotides</td>
			<td>Trilink</td>
			<td></td>
			<td>See Table 8 for more details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>NEBM2403S</td>
			<td>Required only during capping reactions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial rna polymerase ii elongation complexes for dissecting co-transcriptional rna processing events

La síntesis de ARNm eucariota es un proceso bioquímico complejo que requiere la transcripción de una plantilla de ADN en un ARN precursor por la enzima multi-subunit ARN polimerasa II y el taponamiento y empalme co-transcripcional del ARN precursor para formar el ARNm maduro. Durante la síntesis de ARNm, el complejo de alargamiento de ARN polimerasa II es un objetivo de regulación por una gran colección de factores de transcripción que controlan su actividad catalítica, así como el tapón, empalme y enzimas de procesamiento de 3'que crean el ARNm maduro. Debido a la complejidad inherente de la síntesis de ARNm, los sistemas experimentales más simples que permiten el aislamiento y la investigación de sus diversas etapas co-transcripcionales tienen gran utilidad.
En este artículo, describimos uno de estos sistemas experimentales simples adecuados para investigar el taponamiento de ARN co-transcripcional. Este sistema se basa en complejos de elongación de ARN polimerasa II definidos ensamblados a partir de burbujas de transcripción artificial y polimerasa purificada. Cuando se inmovilizan a través de ADN biotinilado, estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II proporcionan una herramienta fácilmente manipulable para disuado de taponamiento de ARN co-transcripcional y mecanismos por los cuales el complejo de alargamiento recluta y regula la enzima de tapado durante límite de ARN co-transcripcional. Anticipamos que este sistema podría adaptarse para estudiar el reclutamiento y/o el ensamblaje de proteínas o complejos proteicos con funciones en otras etapas de maduración del ARNm acopladas al complejo de alargamiento de ARN polimerasa II.

Las figuras 2 y 3 muestran reacciones representativas de resultados utilizadas para generar complejos de alargamiento artificial que contienen transcripciones de diferentes longitudes mediante la extensión o Pol II de diferentes fuentes. La Figura 4 muestra cómo estos complejos de alargamiento se pueden utilizar para analizar el taponamiento de ARN dependiente de la fosforilación CTD co-transcripcional.
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Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Aquí, hemos establecido un sistema experimental simple que permite la reconstitución de complejos activos de alargamiento Pol II adecuados para investigar el acoplamiento funcional de la transcripción de Pol II y el taponamiento de ARN. Con este método, los complejos de alargamiento funcional se pueden montar fácilmente con solo unos pocos componentes. Los complejos de alargamiento están inmovilizados en cuentas magnéticas, por lo que es fácil cambiar las condiciones de reacción.Para inmovilizar el oligo de ADN que contiene biotina en cuentas magnéticas, primero agregue 200 microlitros de cuentas magnéticas a un tubo de 1,5 mililitros de unión a proteínas bajas, y luego coloque el tubo en un bastidor magnético durante dos minutos. Mientras el tubo está en el bastidor magnético, utilice una pipeta para extraer el líquido del tubo sin alterar las perlas. Para lavar las perlas, retire el tubo del bastidor y agregue un mililitro de tampón de lavado que contenga trishidloruro, EDTA y cloruro de sodio.Vuelva a colocar el tubo en el bastidor. Después de dos minutos, retire la solución de lavado y repita los lavados dos veces más con 200 microlitros del mismo tampón. Resuspender las perlas magnéticas en 400 microlitros de tampón 2X.A continuación, agregue 380 microlitros de agua y 20 microlitros de oligo de ADN biotinilado de 10 micromolares no plantillas para mezclar. Coloque el tubo en un encarioador e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, lave las perlas con oligo de ADN inmovilizado no plantilla tres veces usando 200 microlitros de tampón y luego tres veces con 200 microlitros de almacenamiento y tampón de dilución.Almacene el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche para terminar de bloquear las perlas con BSA. Al día siguiente, desechar la solución, resuspender las perlas en 200 microlitros de almacenamiento y tampón de dilución, para alcanzar una concentración aproximada de ADN de cinco micromolares, y luego transferir la solución con las perlas a un nuevo tubo. Para obtener el dúplex DNA-ARN, prepare una mezcla de recocido de 10 microlitros en un tubo pcR con una relación molar de ARN-ADN de dos a uno, como se describe en el protocolo escrito.Coloque el tubo en un ciclor térmico. Ajuste el programa a 45 grados centígrados durante cinco minutos, seguido de 12 ciclos de dos minutos cada uno, comenzando en 43 grados Celsius y disminuyendo la temperatura en dos grados Celsius por ciclo. Por último, manténgalo inactivo a cuatro grados centígrados.Para cargar ARN polimerasa II purificado en el híbrido DNA-RNA, mezcle un microlitros de dúplex DNA-ARN con 13 microlitros de tampón de polimerasa II recién preparados en un tubo. Agregue un microlitro de ARN polimerasa PURIFICAdo II, y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y revolviendo con la punta de la pipeta, sin introducir burbujas. Incubar el tubo durante 10 minutos a 30 grados centígrados.Para completar el complejo de alargamiento, agregue un microlitro de cuentas de oligos de ADN no plantillas inmovilizadas a 14 microlitros de tampón de ADN no plantillas, agregue la mezcla de 15 microlitros al tubo previamente incubado e ilicíquela durante otros 10 minutos a 37 grados centígrados. Coloque la muestra en el bastidor magnético durante dos minutos. Lave la muestra una vez con 30 microlitros de tampón de lavado para eliminar la polimerasa NO incorporada II y los oligos.Para radioetiquetar los complejos de alargamiento con ARN 23mermers, agregue un microlitros de ATP y un microlitros de UTP radiomarcado a 23 microlitros de tampón de pulso, y agregue esta mezcla a las cuentas magnéticas lavadas para resuspender. Incubar la reacción durante 10 minutos para permitir la síntesis de 23mermers radiomarcados. Añadir 1,5 microlitros de solución que contengan 100 micromolares DE ATP y mezcla de UTP de 100 micromolares a 3,5 microlitros de tampón de persecución, y añadir la mezcla al tubo que contiene complejos de alargamiento premontados en perlas.Una vez más, incuba el tubo durante cinco minutos para perseguir todas las transcripciones nacientes en 23mers. A continuación, coloque el tubo en el bastidor magnético y lave como se hizo anteriormente para eliminar los nucleótidos no incorporados. Resuspender la muestra en 30 microlitros de tampón de lavado.Para generar complejos de alargamiento con transcripciones más largas, siga los procedimientos anteriores y escale cuatro veces para generar 120 microlitros de complejos de alargamiento lavados para cuatro reacciones. Etiquete tres tubos nuevos 23mer, 25mer y 29mer. Transfiera 30 microlitros de complejos de alargamiento lavados al tubo de 23mer, y agregue 94 microlitros de mezcla de parada que contengan proteinasa K y glucógeno.Coloque el tubo que contiene los 90 microlitros restantes de complejos de alargamiento lavados en el bastidor magnético durante dos minutos, retire el sobrenadante y resuspend perlas en 90 microlitros de BTB complementados con 1,2 microlitros de ATP y CTP. Incubar durante 10 minutos a 30 grados centígrados. Después de lavar con 90 microlitros de tampón de lavado, transfiera 30 microlitros de complejos de alargamiento al tubo de 25mer, y agregue 94 microlitros de mezcla de parada que contengan proteinasa K y glucógeno.Una vez más, coloque el tubo que contiene los 60 microlitros restantes de complejos de alargamiento en el bastidor magnético durante dos minutos. Repita el tratamiento BTB con 60 microlitros de tampón complementados con 0,8 microlitros de ATP y CTP. Después de la incubación y lavado como se hizo antes, resuspender la muestra en 60 microlitros de tampón de lavado.Transfiera 30 microlitros de la muestra al tubo de 29mer, y agregue 94 microlitros de mezcla de parada que contengan proteinasa K y glucógeno. Analizar los productos de reacción en un gel de poliacrilamida desnaturalnativo. En primer lugar, generar complejos de alargamiento lavado que contengan 23mermers ampliando 13 veces el procedimiento descrito anteriormente para obtener 390 microlitros para 12 reacciones y un extra.Para realizar la fosforilación de la polimerasa II CTD, retire el sobrenadante después de colocar la muestra en el bastidor magnético, y resuspender las perlas en 377 microlitros de BTB. Etiquetar dos tubos nuevos más H y menos H.To más H, añadir tres microlitros del factor de iniciación de transcripción TFIIH a la concentración de 300 nanogramos por microlitro, y menos H, añadir nueve microlitros de almacenamiento y tampón de dilución. Agregue 87 microlitros de los complejos de alargamiento lavados al tubo más H y 261 microlitros al tubo menos H.Incubar los tubos durante 10 minutos y lavar con tampón de lavado. Para realizar el tapado de ARN, agregue 87 microlitros de mezcla de tapado al tubo más H y 261 microlitros al tubo menos H para resuspend. Etiquete cuatro tubos nuevos, cinco más H, cinco menos H, 15 menos H y 45 menos H, y dispense tres microlitros de cinco, 15 o 45 nanogramos por enzima de tapado de microlitro en los tubos correspondientes.A continuación, prepare 12 tubos nuevos con 94 microlitros de tampón de parada. Inicie la primera reacción de taponamiento añadiendo 87 microlitros de complejo de alargamiento tratados con TFIIH al tubo etiquetado cinco más H.Incubar a 30 grados Celsius en un bloque de calor. Las reacciones de taponamiento deben cronometrando con precisión con un cronómetro.Cuando se trabaja con múltiples reacciones, las horas de inicio de cada reacción deben ser escalonadas. Después de uno, dos o cuatro minutos, transfiera 30 microlitros de la mezcla de reacción más a tubos etiquetados con uno, dos y tres que contienen 94 microlitros de tampón de parada para detener las reacciones. Proceder con reacciones de taponamiento para las muestras en los tubos menos H restantes exactamente de la misma manera, utilizando complejos de alargamiento tratados sin TFIIH.Analizar los productos de reacción en un gel de poliacrilamida desnaturalnativo. Aquí se muestra un diagrama para las moléculas de ADN y ARN en complejos de alargamiento artificial. Utilizando el oligo de ARN sintético de 20 nucleótidos como la imprimación de ARN durante el montaje de los complejos de alargamiento artificial, se añadieron nucleótidos durante cada paso secuencial del protocolo para generar un 23mer, un 25er y un 29mer.Se compararon las reacciones con ARN polimerasa II de diferentes fuentes. Los complejos de alargamiento artificial se ensamblaron con polimerasa II endógena de tipo salvaje purificada del hígado de rata o de levadura de fisión y caminó para generar 23mermers o 25mermers. Se realizó un ensayo para medir el límite de las transcripciones radiomarcadas asociadas con complejos de alargamiento artificial que contenían 23 transcripciones de nucleótidos con un extremo de trifosfato de cinco primos.Los dos últimos carriles muestran los productos de reacciones en las que se incubaron complejos de alargamiento con o sin enzima de tapado en presencia de TFIIH. Las bandas de migración más lenta y rápida contienen transcripciones tapadas y sin límite, respectivamente. Los primeros 12 carriles muestran el límite de las transcripciones asociadas con complejos de alargamiento con una CTD fosforilada o sin fosforilado.Las actividades de la polimerasa II y otras enzimas pueden variar de la preparación a la preparación, por lo que es necesario optimizar las condiciones de reacción mediante la valoración de las concentraciones enzimáticas para definir niveles óptimos. Es importante utilizar material radiactivo de forma segura y evitar la contaminación. Por favor, asegúrese de seguir las pautas de su laboratorio e instituto al hacer experimentos con radiactividad.

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Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Investigación

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

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