Name: modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH) R01 CA222560 und den Breakthrough Award des Department of Defense W81XWH-18-1-0037 unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women es Hospital genehmigt.
1. Erzeugung und Wartung von Floxed-Mäusen
<ol><li>Erhalten Sie brustkrebsrelevante bedingte Knockouts (z. B. Trp53tm1Brn [trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) oder bedingte Einsteckmauslinien (z. B. Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan) aus dem Jackson ...

<ol>
	<li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland.">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li><li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland.">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li><li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer.">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li><li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RUNX1,+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer,+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells.">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881 (2014).</li><li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors.">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation.">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex.">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer.">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li><li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells.">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li><li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours.">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li><li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity.">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li><li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours.">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431 (2017).</li><li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses.">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+21+breast+cancers.">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li><li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ.">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li></ol>

Der Erfolg dieses Ansatzes zur Induktion von Brusttumoren aus verschiedenen Subpopulationen von MECs hängt nicht nur von der Wahl geeigneter zelltypspezifischer Promotoren (um die Cre-Expression zu fördern), sondern auch von der intraduktiven Injektion selbst ab. Die Idee hinter diesem Ansatz ist, dass die injizierten Ad-Cre-Viren im duktalen Baum zurückgehalten werden, der eine verborgene Struktur mit Lumen ist, und daher sind nur MECs den Viren ausgesetzt und werden von Ad-Cre infiziert. Aufgrund des begrenzten Lume...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Modellierung von Brustkrebs auf der Grundlage einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in die Maus MG. Der Cre/loxP-Rekombinationsansatz wurde häufig verwendet, um menschlichen Brustkrebs bei Mäusen zu modellieren. Die erste Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebsmausmodellen wird durch verwendung von cre-exzessienten transgenen Mäusen unter der Kontrolle von MEC-spezifischen Promotoren (z. B. MMTV-Cre für luminale MECs und einen Teil der basalen MECs, Wap-Cre und Blg-Cre für luminale Vorläufer und alveolare Leuchtdichte MECs, K14-Cre für Basal und einen Teil der luminalen MECs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Während diese transgenen Cre-Linien zwar die räumliche Kontrolle des Cre-Expressions (d. h. in verschiedenen Teilmengen von MECs) ermöglichen, erlauben sie jedoch keine zeitliche Kontrolle der Cre-Expression und der Cre/loxP-vermittelten genetischen Manipulation. Die zweite Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebs-Mausmodellen nutzt induzierbare Cre-Aktivitäts-/Expressionsansätze (z. B. Verwendung von Cre-Östrogen-Rezeptor-Fusion [CreER], die nur eine Cre/LoxP-Rekombination bei Verabreichung von Tamoxifen induzieren kann), und Daher ermöglichen diese genetischen Werkzeuge sowohl räumliche als auch zeitliche Kontrollen der Aktivierung onkogener Ereignisse in MECs (z. B. K8-CreER-und K5-CreER-basierteModelle)10,11,12 . In beiden Generationen von Brustkrebsmausmodellen können als Promotoren, die zur Antrieb von Cre- oder CreER-Expression (z. B. Krt8, Krt5) verwendet werden, auch in Epithelzellen anderer Organe aktiv sein (d. h. sie sind zelltypspezifisch, aber nicht organspezifisch) oder haben eine undichte Expression in anderen Zelltypen als Epithelzellen (z. B. MMTV, die undichte Aktivität in hämatopoetischen Knochenmarkzellen hat), können diese Ansätze zur Entwicklung unerwünschter Krebserkrankungen in anderen Organen führen. Wenn diese unerwarteten Krebsarten bei den betroffenen Mäusen eine Letalität verursachen, kann der ursprüngliche Zweck der Modellierung von Brustkrebs bei diesen Mäusen verboten sein (z. B. MMTV-Cre-getriebeneonkogene Ereignisse können zu hämatopoetischen Malignitäten und einem frühen Tod der Mäuse führen. , aufgrund der Leckage des MMTV-Promotors in hämatopoetischen Zellen)4. 
Hier berichten wir über einen Ansatz zur Brustkrebsmodellierung bei Mäusen, der sowohl zelltyp- als auch organspezifische Manipulationen onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in Maus-MGs (und ist somit organspezifisch). Die Cre-Expression kann durch die Verwendung verschiedener MEC-Subpopulations-spezifischer Promotoren gesteuert werden, die in den adenoviralen Vektor eingebettet sind (z. B. Krt8 für luminale MECs, Krt5 für Basal-MECs, wodurch eine zelltypische Spezifität erreicht wird). Die Krebsinduktion in MGs kann zeitlich durch eine Injektion von Ad-Cre in Mäuse in verschiedenen Altersstufen kontrolliert werden, beginnend mit 3-4 Wochen (Pubertät) bis zum Erwachsenenstadium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>point style 3 blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7mm Reflex Clip</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>RF7 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus, Ad-K5-Cre</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core</td>
			<td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus, Ad-K8-Cre</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core</td>
			<td>Ad5mK8-nlsCre</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC800-1GAL</td>
			<td>Prepare to 70% in use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated CD31</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated CD45</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated TER119</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24-AF-700</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24-PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-0242-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD29-APC</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-0291-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD29-PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-0291-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Remover Lotion</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>9 Oz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7636-01</td>
			<td>0.025 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td>10% Povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 10019-360-40</td>
			<td>1-2.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Akorn</td>
			<td colspan="2">NDC 17478-062-35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>9M</td>
			<td>Watchmaker&#39;s Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq 5X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0285L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland

Brustkrebs ist eine heterogene Krankheit, möglicherweise aufgrund komplexer Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ursprungszellen und onkogenen Ereignissen. Mausmodelle sind entscheidend, um Einblicke in diese komplexen Prozesse zu gewinnen. Obwohl viele Mausmodelle entwickelt wurden, um Beiträge verschiedener onkogener Ereignisse und Ursprungszellen zur Brusttumorigenese zu untersuchen, sind diese Modelle oft nicht zelltyp- oder organspezifisch oder können die Initiation einer Brusttumorigenese in einem zeitlich gesteuerte Art und Weise. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer neuen Art von Brustkrebsmausmodellen, die auf der intraduktiven Injektion des Cre-expressing adenovirus (Ad-Cre) in Maus-Mammary Drüsen (MGs) basieren. Durch die direkte Injektion von Ad-Cre in Brustkanäle ist dieser Ansatz MG-spezifisch, ohne unerwünschte Krebsinduktion in anderen Organen. Das intrauktale Injektionsverfahren kann bei Mäusen in verschiedenen Stadien ihrer MG-Entwicklung durchgeführt werden (daher ermöglicht es eine zeitliche Kontrolle der Krebsinduktion, beginnend mit einem Alter von 3-4 Wochen). Die Zelltyp-Spezifität kann erreicht werden, indem verschiedene zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, um die Cre-Expression im adenoviralen Vektor zu fördern. Wir zeigen, dass luminale und basale Brustepithelzellen (MECs) durch eine intraduktive Injektion von Ad-Cre unter der Kontrolle des Keratin 8 bzw. Keratin 5-Promotors gezielt für die Cre/loxP-basierte genetische Manipulation eingesetzt werden können. Durch die Einbeziehung eines bedingten Cre-Reporters (z.B. Cre/loxP-inducible Rosa26-YFP-Reporter) zeigen wir, dass MECs, die von Ad-Cre ins Visier genommen werden, und von ihnen abgeleitete Tumorzellen nach der intraduktiven Injektion den Reporter-positiven Zellen folgen.

Repräsentative PCR-Genotypisierungsergebnisse für die R26Y- und Trp53 L-Allele sind in Abbildung 1dargestellt.
Obwohl grundsätzlich alle 10 MGs dem intraduktiven Injektionsverfahren unterzogen werden können, werden praktisch die beiden vierten Leisten-MGs aufgrund ihrer leichterenZugänglichkeit und größerer MG-Größen (Abbildung 2) ...

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Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland Video (Video) | JoVE

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen neuen Ansatz zur Modellierung von Brustkrebs zu beschreiben, der auf der intraduktiven Injektion von Cre-expressing adenovirus in Maus-Mammary-Drüsen basiert. Dieser Ansatz ermöglicht sowohl eine zelltyp- als auch organspezifische Manipulation onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise.

Modellierung von Brustkrebs über eine intraduktive Injektion des Cre-expressingAvirus in die Maus-Mammary Drüse

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Dieses Protokoll wird Forschern helfen, eine neue Art von Mausmodell zu generieren, um die Entwicklung von menschlichem Brustkrebs aus verschiedenen Teilmengen von Brustepithelzellen zu rekapitulieren. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Brustkrebs-Maus-Modelle im Entwicklungsstadium Gewebe auf eine zelltypspezifische Weise und ohne die Notwendigkeit einer umfangreichen Mauszucht zu generieren. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, generieren, warten und anästhesieren Sie floxierte Mäuse, wie im Textprotokoll beschrieben.Bringen Sie die Maus in einen Bereich, der von dem Ort getrennt ist, an dem die Operation durchgeführt werden soll. Nach Bestätigung der Anästhesie durch Durchführung einer Zehenprise, injizieren Meloxicam als Analgesie subkutan in einer Dosis von fünf Milligramm pro Kilogramm, um für den chirurgischen Eingriff vorzubereiten. Setzen Sie die Brustwarzen chirurgische Stelle durch die Anwendung mehrerer Tropfen Haarentfernung Creme.Entfernen Sie übermäßige Creme und lockeres Haar mit weichen Papiertüchern. Rasieren wird nicht empfohlen, um Schäden an den Brustwarzen zu vermeiden. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit Iodophoren zuerst gefolgt von 70%Alkohol und enden mit einer endgültigen Anwendung von Peeling-Iodophoren.Tun Sie dies in einer kreisförmigen Bewegung von der Mitte des Arbeitsbereichs in Richtung Peripherie mit einem Gazeschwamm oder einem Baumwoll-Applikator. Wiederholen Sie den Zyklus drei- bis viermal. Verwenden Sie aseptische Techniken während des gesamten chirurgischen Eingriffs.Machen Sie eine Einschnittstelle auf der Haut mit einer Länge von etwa einem Zentimeter zwischen den beiden vierten Leistenbrustdrüsen. Trennen Sie vorsichtig die Hautklappe vom parietalen Peritoneum, um den Brustduktalbaum zu sehen. Halten Sie die Brustwarze vorsichtig mit Uhrmacherzangen, um die Außennippel zu entfernen, ohne die nahe gelegene Haut mit einer Mikrodissektionsschere zu schneiden.Laden Sie etwa drei bis fünf Mikroliter Cre-adenovirus Injektionsmischung in eine 25 Mikroliter Hamilton Spritze mit einer 33 Gauge Metallnabennadel befestigt. Schätzen Sie das Volumen der Injektionsmischung in der Spritze auf der Grundlage des in der Mischung enthaltenen blauen Farbstoffs. Halten Sie vorsichtig den Rand der Hautklappe mit einer feinen gekrümmten Pinzette und injizieren Sie die Cre-adenovirus Injektionsmischung langsam in die Brustwarze, während Sie die Ausbreitung von blauem Farbstoff in den Brustduktalbaum überwachen.Halten Sie die Injektionsrate so langsam wie möglich, um Schäden am duktalen Lumen zu vermeiden. Eine erfolgreiche intrauktale Injektion wird durch injizierte Flüssigkeiten angezeigt, die sich über den gesamten duktalen Baum ausbreiten, ohne in das Stroma-Fach zu gelangen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus der Brustwarze, um ein Auslaufen der injizierten Flüssigkeit zu vermeiden.Untersuchen Sie die distale Seite der Brustdrüse oder die Umgebung der injizierten Brustwarze. Farbstoff, der in die nahe gelegene Stroma diffundiert, wie hier gezeigt, deutet eher auf eine Brustfettpad-Injektion als auf eine erfolgreiche intrauktale Injektion hin. Schließen Sie die chirurgischen Wunden in der Haut mit Wundclips.Entfernen Sie die Maus von der Anästhesie und legen Sie sie auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig für die Erholung. Überwachen Sie die Entwicklung des Brusttumors, wie im Textprotokoll beschrieben. Die jüngsten weiblichen Mäuse, bei denen eine intrauktale Injektion erfolgreich durchgeführt werden kann, sind die im Alter von etwa drei Wochen.Obwohl für die meisten Mammary Tumor Induktionsexperimente, junge erwachsene weibliche Mäuse verwendet werden. Intraduktionale Injektion mit einem größeren Volumen der Injektionsmischung kann bei weiblichen Mäusen während der frühen bis mittleren Trächtigkeit durchgeführt werden, um alveolare Zellen anzugreifen. Um verschiedene Brustepithelzellsubpopulationen für die Brusttumorinduktion ins Visier zu nehmen, wurden Cre-adenoviren unter der Kontrolle verschiedener Brustepithelzellsubmenge spezifische Promotoren für die Injektion verwendet.Zum Beispiel wurde das Cre-adenovirus unter der Kontrolle von Keratin 8-Promotor verwendet, um luminale Brustepithelzellen anzugreifen. Das Cre-adenovirus unter der Kontrolle von Keratin 5-Promotor zielte auf die Basallinie, die zur genetischen Markierung nur von Basal-Epithelzellen führte. Bei einer weiblichen P53-Flox-Homozygoten-Maus mit einem ROSA26-YFP-Reporter führte die intrauktale Injektion von Keratin 8 Cre-adenovirus einige Monate nach der Injektion zur Entwicklung von Brusttumoren.Durch die Einbeziehung des bedingten R26-Y-Reporters wurden Tumorepithelzellen typischerweise durch YFP markiert und konnten durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Die Zellen können durch die Flusssortierung von YFP-positiven Zellen zur weiteren Analyse angereichert werden. Die wichtigsten Dinge, die Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, sind, ein kleines Injektionsvolumen zu verwenden, langsam zu injizieren und auch die Nadel langsam zurückzuziehen.Nach diesem Verfahren kann man das Fortschreiten der gezielten YFP-positiven Epithelzellen zu prämalignen und Krebsstadien durch Durchflusszytometrie oder Co-Immunfluoreszenzfärbung der injizierten Drüse überwachen. Diese Technik wird den Forschern den Weg ebnen, um Zellen mit Ursprung von Brustkrebs zu untersuchen, wie sie auf verschiedene autogene Ereignisse reagieren und wie sie zu Krebszellen übergehen. Sowohl Adenovirus als auch die Injektionsnadel sind potenziell gefährlich.Daher sollte man bei der intrauktinalen Injektion immer Handschuhe tragen und Sicherheitsnadeln und Spritzen verwenden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis Video (Video) | JoVE

Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Forschung

Krebsforschung

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis Video (Video) | JoVE

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification Video (Video) | JoVE

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad Video (Video) | JoVE

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad Video (Video) | JoVE

Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging Video (Video) | JoVE

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System Video (Video) | JoVE

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells Video (Video) | JoVE

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...