Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 81402582، مؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي 12DZ2295100، 14YF1400600 و 18ZR1404500

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية واتباع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة فودان وتم الحصول على جميع عينات سرطان البنكرياس من مركز السرطان بجامعة فودان شنغهاي. وتم الحصول على موافقة أخلاقية من لجنة الأخلاقيات التابعة للجامعة، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة ?...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

كل من نماذج PDX وCDX هي منصات حيوية في مجال بيولوجيا الورم22، والخطوة الحاسمة من زرع ناجحة بين الأنواع هو تحسين بقاء xenograft.  في الآونة الأخيرة، أظهرت بعض الدراسات أن التعبير العابر من BCL2L1 (BCL-XL) أو BCL2 قد تحسن بشكل كبير من جدوى الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الفئر?...

الأورام الدقيقة تهدف إلى إيجاد الاستراتيجياتالعلاجية الأكثر فائدة للمريض الفردي 1. حاليا، العديد من النماذج ما قبل السريرية مثلفي المختبر الثقافة الأولية، في المختبر الثقافة العضوية 2، وxenografts المستمدة من المريض (PDX) في الفئران قبل أو بعد الثقافة العضوية المقترحة لتشخيص وفحص / تقييم إمكانات الخيارات العلاجية3. نموذج PDX التي تم إنشاؤها عن طريق حقن خلايا السرطان الأولية البشرية في الفئران المناعية للخطر، هي واحدة من الأدوات الواعدة لفحص المخدرات شخصية في الأورام السريرية3،4. على عكس خط الخلايا المستزرعة في المختبر، عادة ما تحافظ نماذج PDX على سلامة وتباين بيئة الورم في الجسم الحي، وتحاكي بشكل أفضل التنوع والخصائص المميزة لمرضى الأورام المختلفة، وبالتالي، قد تتنبأ النتائج الطبية المحتملة للمرضى4. ومع ذلك، فإن توليد نماذج PDX في الفئران يتطلب عينات عالية الجودة من المرضى وأشهر من الوقت لجمع ما يكفي من الخلايا والنماذج للتجارب متعددة المجموعات، والتراكيب الخلوية / الوراثية من xenograft قد الانجراف من تلك الأصلية المريض'الخزعة. معدل النجاح لإنشاء الفئران PDX نموذج منخفض أيضا، مما يجعل من الصعب أن تنفذ على نطاق واسع في الممارسة السريرية. بالنسبة للمرضى الذين يحملون سرطانات سريعة التقدم مثل سرطان البنكرياس، قد لا تكون قادرة على الحصول على معلومات قيمة من تجارب PDX في الوقت المناسب.
في السنوات القليلة الماضية، وقد أفيد حمار وحشي أن تكون المضيفين المحتملين ليس فقط CDX (خلية المستمدة من الورم xenograft) نماذج، ولكن أيضا نماذج PDX5،6،7،8،9، 10.كالحيوان نموذج الفقاريات، حمار وحشي يأوي أوجه التشابه كافية مع الثدييات في كل من علم الوراثة وعلم وظائف الأعضاء، مع اثنين من المزايا الهامة: الشفافية وصغيرة في الحجم11. حمار وحشي هو أيضا البراز للغاية، ويمكن الحصول على مئات من اليرقات الأصيلة في غضون أيام قليلة من زوج واحد من البالغين12. وقد استخدمت العديد من الدراسات حمار وحشي لتوليد كل من نماذج المعدلة وراثيا وxenograft من أمراض السرطان13،14. بالمقارنة مع الفئران xenografts، حمار وحشي xenografts تسمح تتبع في قرار خلية واحدة. وهناك كمية معينة من الأنسجة البشرية قادرة على توليد مئات من نماذج PDX حمار وحشي (zPDXs)، في حين قد تكون كافية فقط لتوليد زوجين من الفئران نماذج PDX15،16. إلى جانب ذلك، يرقات حمار وحشي في 2-5 dpf بالفعل تطوير أنظمة الدورة الدموية كاملة والأعضاء الأيضية مثل الكبد والكلى، ولكن ليس الجهاز المناعي17، في حين أن كيس صفار المتبقية هي وسيلة 3D الطبيعية، مثالية لفحص المخدرات، والمخدرات اختبارات المقاومة وملاحظاتهجرة الأورام 6،18،19،20،21.
مع محاولة في نهاية المطاف لاستخدام zPDX كمنصة فحص / اختبار للاستخدام السريري، وهنا، ونحن نصف اقتراح الأمثل لنموذج zPDX من سرطان البنكرياس، والذي يسمح في تقييم المخدرات مرشح في الجسم الحي في غضون فترة قصيرة باستخدام خلايا أقل بتكاليف أقل. بالمقارنة مع المراجع السابقةحول zPDX 6،9،10،قدمنا العديد من التحسينات لجعل النظام أكثر جدوى وموثوق بها للتشخيص السريري شخصية: 1) ما قبل الفرز خلية مختلفة المجموعات في أنسجة الورم الأولية وتثبيت الخلايا الأولية لمدة أسبوع واحد قبل إجراء مزيد من التجارب. 2) وضع العلامات على الخلايا البشرية وتعزيز صلاحية الخلية في xenograft عن طريق التعديل الوراثي القائم على فيروس لينتي؛ 3) تحسين حالة ثقافة سمك الحمار الوحشي في كل من المكملات الغذائية (الجلوكوز والجلوتامين) ودرجة الحرارة؛ 4) قياس استجابات المخدرات من أنواع الخلايا المختلفة بطريقة مقارنة. كما قمنا بإجراء تغييرات على حل الحقن عن طريق إضافة العديد من المواد التكميلية. وإجمالا، توفر هذه التحسينات إمكانية توليد بسرعة أكثر من المرضى مثل xenograft في المضيفين حمار وحشي التي يمكن استخدامها كأداة موثوق بها لتقييم استجابة الأدوية المرشحة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

يُتعتبر الشُوّة السرطان المستمدة من المريض (PDX) وxenograft (CDX) المستمدة من الخلايا من التقنيات الهامة للتقييم قبل السريري، والتوجيه الدوائي، والبحوث الأساسية للسرطان. أجيال من نماذج PDX في الفئران المضيفة التقليدية تستغرق وقتاطويلا وتعمل فقط لنسبة صغيرة من العينات. في الآونة الأخيرة، ظهرت حمار وحشي PDX (zPDX) كنظام مضيف فريد من نوعه، مع خصائص صغيرة النطاق وكفاءة عالية. هنا، نقوم بوصف منهجية محسنة لتوليد نموذج xenograft الورم المزدوج المسمى الفلورة لتقييم العلاج الكيميائي المقارن في نماذج zPDX. تم إثراء الخلايا السرطانية والخلايا الليفية من أنسجة سرطان البنكرياس التي تم حصادها حديثًا أو المجمدة في ظروف ثقافية مختلفة. وقد وصفت كل من مجموعات الخلايا من قبل lentivirus التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء، فضلا عن الجينات المضادة للأبوبوتوس BCL2L1. وكانت الخلايا المتحولة مختلطة مسبقاً وحقنت بالمشاركة في أسماك الحمار الوحشي لليرقات dpf 2 التي ولدت بعد ذلك في متوسط E3 المعدل عند 32 درجة مئوية. تم علاج نماذج xenograft عن طريق أدوية العلاج الكيميائي و / أو مثبطات BCL2L1، وتم التحقيق في حيوي كل من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في وقت واحد. وباختصار، يسمح هذا البروتوكول للباحثين لتوليد بسرعة كمية كبيرة من نماذج zPDX مع بيئة صغيرة الورم غير متجانسة ويوفر نافذة مراقبة أطول وكمية أكثر دقة في تقييم كفاءة المرشحين المخدرات.

يتم تمثيل مخطط تفصيلي للإجراء في الشكل 1. باختصار، تم زرع خلايا الأنسجة السرطانية الأولية في الوسط الكامل بعد الهضم مع أو بدون إضافة مثبطات الخلايا الليفية لسرطان البنكرياس. تم إثراء الخلايا السرطانية والخلايا الليفية كاثنين من السكان المتميزين أن الخلا...

Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment (Video) | JoVE

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

يصف هذا البروتوكول إجراءات التحسين في نموذج xenograft الورم المزدوج القائم على الفيروسات باستخدام سمك الحمار الوحشي اليرقات كمضيفين. هذا النموذج xenograft غير متجانسة يحاكي تكوين الأنسجة من سرطان البنكرياس microenvironment في الجسم الحي، ويعمل كأداة أكثر دقة لتقييم استجابات المخدرات في zPDX شخصية (حمار وحشي المريض المستمدة xenograft) النماذج.

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

اليوم نحن ذاهبون لتقديم يرقات حمار البحر حمار البحر PDX النموذجي. هذا النموذج هو مهم لأنها يمكن أن تحاكي أفضل تكوين الخلوية مماثلة في xenograft لتقييم الاستجابات المخدرات وأيضا زيادة تحسين اتساق النتائج مع تحليلنا المقارن. هناك نوعان من المزايا الرئيسية لهذه التقنية.أولا، نستخدم مختلف الأصباغ الكيميائية القياسية لتسمية الخلايا في الفلورس المختلفة، مما يسمح لتتبع في الوقت الحقيقي من التراكيب الخلوية وقدرة مرحلة الانجراف. ثانيا ، فإنه يحسن أيضا الوقت العام للبقاء على قيد الحياة من الخلايا البشرية في حمار وحشي ، وتعديلها الجيني ، الذي يوفر نافذة مراقبة أطول لاختبار المخدرات. توفر هذه التقنية نموذجًا محتملًا للطب الشخصي للمرضى المصابين بسرطان البنكرياس وكذلك للتقييم المسبق لدواء الورم قبل السريري.ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتتبع الخلايا السرطانية الأخرى أو لا الخلايا السرطانية xenografted في حمار وحشي في الجسم الحي وتحسين بقاء الخلية لفترة أطول الملاحظة. لإعداد لوحة الحقن، إعداد محلول 50 ملليلتر من 1٪ agarose في حل E3. يغلي الحل حتى يذوب agarose.صب الحل بأكمله في طبق بيتري 10 سنتيمترا ثم ضع قالب تثبيت جنين حمار وحشي على السطح. عندما يقوي الحل agarose تماما، وإزالة القالب. لإعداد حقن الإبر، واستخدام إبرة سحب لسحب الشعرية الزجاجي 10 سم مع البعد الداخلي من 0.9 ملليمتر في إبرة اثنين.باستخدام المجهر والملقط، وقطع نهاية الإبرة لخلق فتحة. أولاً، ضع 1 إلى 2 أزواج من سمك الحمار الوحشي البالغ في خزان تزاوج حوالي الساعة 7 إلى 9 مساءً. في الساعة الثامنة صباحاً في صباح اليوم التالي، اجمع البيض المخصب. نقل البيض المخصب إلى طبق بيتري يحتوي على 40 ملليلتر من محلول E3 الطازج.احتضان في 28.5 درجة مئوية. أولاً، نقل عينة سرطان البنكرياس التي تم جمعها إلى طبق بيتري. شطف الأنسجة من خمس إلى ست مرات مع برنامج تلفزيوني واستخدام مشرط لقطع الأنسجة إلى قطعة مكعبة ملليمتر واحد.بعد ذلك، نقل الأنسجة الممزقة إلى أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من HBSS. إضافة الكولاجين من النوع الرابع، الهيالوروديناز، وDNAse واحد في التركيزات النهائية هو مبين هنا. الميوط الخليط صعودا وهبوطا لخلط جيدا.احتضان الخليط في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 15 إلى 20 دقيقة. الماصات الخليط صعودا وهبوطا عدة مرات كل خمس دقائق. إضافة سبعة ملليلتر من DMEM إلى الأنبوب.جهاز طرد مركزي في 110 مرات G و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، decant الماحشة وإعادة تعليق خليط الورم في DMEM. لوحة الخليط في اثنين من ستة أطباق بيتري سنتيمتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام النمو الكامل اسمه المجموعة الأولى والمجموعة الثانية.احتضان كلتا المجموعتين في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. بعد 48 ساعة، إضافة مثبط 100x من الخلايا الليفية سرطان البنكرياس في وسط المجموعة الأولى لإزالة الخلايا الليفية المتضخمة، وترك الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الرئيسية. متابعة احتضان باستخدام الشروط السابقة.بعد إنتاج فيروس العدس، بذور الخلايا التي سيتم المصابة في لوحة 12-جيدا مع 30 إلى 40٪ كثافة. زراعة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. في اليوم التالي، استبدل الوسيط بـ 500 ميكرولتر من المتوسطة الخالية من المصل التي تحتوي على البوليبرين بتركيز ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر.احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات. ثم، إضافة 100 ميكرولترات إضافية من فيروس العدس إلى المتوسطة واحتضان مرة أخرى لمدة 12 ساعة. بعد 12 ساعة، استبدل الوسيط بمليلترين كاملين ومتوسطين واحتضان لمدة 36 ساعة إضافية.بعد 36 ساعة، تحقق من علامات الفلوريسنس. حصاد الخلايا المصابة وخلطها بنسبة واحد إلى واحد مع تركيز النهائي من مليون خلية لكل ملليلتر. الطرد المركزي الخلايا في 110 مرات G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق خليط الخلية في 50 ميكرولترات من محلول الحقن.بعد تخدير يرقات حمار وحشي ، قم بنقلها إلى لوحة الحقن ، والتي تمتلئ بـ E3 المعدلة. تناول 25 ميكرولترات من تعليق الخلية المختلطة في إبرة الكابيلا الدقيقة وأدخل الإبرة في المتلاعب بالجنون الدقيق. تعيين ضغط الحقن والوقت وحقن 50 إلى 80 الخلايا في كيس صفار من 48 ساعة بعد التخصيب حمار وحشي. أولاً، نقل يرقات أسماك الحمار الوحشي بعد الزينوغرف إلى 40 ملليلتر من محلول المزيج عند 32 درجة مئوية.ضع 10 يرقات زنوجرافت في كل بئر من 12 بئرا. بعد ذلك ، تقسيم اليرقات إلى أربع مجموعات. علاج مجموعة التحكم مع E3 التي تحتوي على 0.1٪ DMSO وعلاج المجموعات الأخرى مع Gemcitabine و / أو Navitoclax.احتضان جميع اليرقات في 32 درجة مئوية لمدة يومين. بعد تخدير اليرقات zenografted بعد العلاج ، ووضعها في 3 ٪ الميثيل السليلوز. استخدم المنظار الفلوري أو المجهر النافق لتصوير اليرقات من المنظر الجانبي.ثم، استخدم الصورة J و برنامج لوحة الرسم البياني لتحديد شدة إشارات الفلورس الأحمر والأخضر. في هذه الدراسة, خلايا الأنسجة السرطانية الأولية هي بذور في المتوسط الكامل بعد الهضم مع أو بدون إضافة مثبطات الخلايا الليفية سرطان البنكرياس. يتم إثراء الخلايا السرطانية والخلايا الليفية كاثنين من السكان متميزة.ويهيمن على السكان الذين لا توجد مثبطات من قبل الخلايا الليفية في حين أن نمو الخلايا السرطانية يسود بعد إضافة مثبطات. تم بناء ناقلين التغليف العدسي الفيروسي التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء في BCL2L1. يمثل وضع الملصقات الفلورية المستندة إلى الفيروسات حالة البقاء للخلايا.يتم حقن الخلايا السرطانية المختلطة والليفية في صفار حمار الحمار الوحشي في 48 ساعة بعد الإخصاب ثم يتم علاجها مع Gemcitabine و / أو Navitoclax لمدة يومين. يتم تغيير viabilities الخلية في مختلف السكان والتكوين الخلوي من زينوجافت كاستجابات للعلاج من المخدرات. عند معالجة أنواع مختلفة من الأورام، وهناك العديد من الخطوات التي قد تحتاج إلى أن يعترض، بما في ذلك وقت هضم الخلية، جرعة العلاج من المخدرات، وهلم جرا.تساعد هذه التقنية الباحثين على توظيف حمار وحشي من مقايسة CGX أو PDS القياسية. وهو يسمح لخلط وحقن الخلايا المختلفة بنسب ثابتة لتحديد نطاقات التقدم من خلال مقارنتها بنمو الخلايا. الحماية الشخصية ذات أهمية كبيرة، وخاصة عند تغليف فيروس العدس.ارتداء أقنعة وقفازات عند الاقتضاء، وليس محاولة لخلط على الجلد.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies (Video) | JoVE

تطوير وصيانة للورم المريض قبل السريرية المستمدة طعم أجنبي نموذج للتحقيق في رواية مكافحة السرطان العلاج

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model (Video) | JoVE

نموذج Xenograft مشتق من سرطان الجلد

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells (Video) | JoVE

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines (Video) | JoVE

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models (Video) | JoVE

العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform (Video) | JoVE

تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish (Video) | JoVE

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease (Video) | JoVE

نموذج مورين أومايا زينوغرافت لدراسة العلاج المباشر المستهدف لمرض اللبتومينينجال

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients (Video) | JoVE

استئصال الورم المشتق من المريض كمنصة "حية" قبل السريرية للتنبؤ بمقاومة الأدوية لدى المرضى

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis (Video) | JoVE

إنشاء واستخدام نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...