Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door National Natural Science Foundation van China 81402582, Natural Science Foundation van Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 en 18ZR1404500

Alle dier procedures werden goedgekeurd en volgden de richtlijnen van het Animal Ethics Committee bij Fudan University en alle pancreaskanker specimens werden verkregen van Fudan University Shanghai Cancer Center. De ethische goedkeuring werd verkregen van de afdeling ethiek van de FUSCC en elke patiënt kreeg schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. voorbereiding van de apparatuur voor de micro injectie
<ol><li>
Voorbereiding van de injectie plaat.
	<ol>
<li>Bereid een ...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

Zowel de PDX-als de CDX-modellen zijn vitale platformen op het gebied van tumor biologie22, en de kritieke stap van een succesvolle Inter-species transplantatie is het verbeteren van het voortbestaan van de xenograft.  Onlangs hebben sommige studies aangetoond dat voorbijgaande expressie van BCL2L1 (BCL-XL) of BCL2 de levensvatbaarheid van menselijke embryonale stamcellen bij muizen hosts aanzienlijk kan verbeteren zonder de celidentiteiten en lot23</s...

Precision oncologie streeft naar het vinden van de meest gunstige therapeutische strategieën voor individuele patiënt1. Momenteel worden talrijke preklinische modellen zoals in vitro primaire kweek, in vitro organoïde Culture2en patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX) bij muizen voor of na de organoïde cultuur voorgesteld voor diagnose en om de potentiële therapeutische keuzes3. PDX-model dat wordt gegenereerd door de injectie van menselijke primaire kankercellen in immuungecompromitteerde muizen, is een van de meest veelbelovende hulpmiddelen voor gepersonaliseerde geneesmiddelen screening in klinische oncologie3,4. In tegenstelling tot de gekweekte cellijn in vitro, de PDX modellen meestal behouden de integriteit en heterogeniteit van de in vivo tumor omgeving, beter nabootsen van de diversiteit en idiosyncratische kenmerken van verschillende tumor patiënten, en daarom, kan voorspellen de potentiële medische uitkomst van patiënten4. De generatie van PDX-modellen in muizen vereist echter een hoge kwaliteit patiënt monsters en maanden tijd om voldoende cellen en modellen te verzamelen voor experimenten met meerdere groepen, en de cellulaire/genetische samenstellingen van de xenotransplantaatmodellen is kunnen afwijken van die van de oorspronkelijke debiopsie van de patiënt. Het succespercentage voor het vaststellen van model muizen PDX is ook laag, waardoor het moeilijk is om in de klinische praktijk breed te worden uitgevoerd. Voor de patiënten die snel gevorderde kankers zoals pancreaskanker dragen, kunnen ze niet tijdig waardevolle informatie van de PDX-experimenten verkrijgen.
In de afgelopen jaren, zebravis is gemeld dat potentiële hosts voor niet alleen CDX (cel-afgeleide tumor xenograft) modellen, maar ook PDX modellen5,6,7,8,9, 10. als een gewervelde model dier, zebravis herbergt voldoende gelijkenissen met zoogdieren in zowel genetica en fysiologie, met twee belangrijke voordelen: transparantie en kleine in maat11. Zebravis is ook zeer vruchtbaarheid, en honderden ingeteelde larven kunnen worden verkregen binnen een paar dagen vanaf één paar volwassenen12. Verschillende studies hebben gebruikt zebravis voor het genereren van zowel transgene en xenotransplantaatmodellen is modellen van kanker ziekten13,14. In vergelijking met muizen xenotransplantaten, zebravis xenotransplantaten toestaan tracking bij een enkele celresolutie. Een bepaalde hoeveelheid menselijk weefsel is in staat om honderden zebravis PDX-modellen (zpdxs) te genereren, terwijl het mogelijk alleen volstaat om een paar muizen PDX-modellen15,16te genereren. Behalve, de zebravis larven op 2-5 DPF al ontwikkelen complete bloedsomloop en metabole organen zoals lever en nieren, maar niet het immuunsysteem17, terwijl de overgebleven dooier SAC is een natuurlijke 3D-medium, ideaal voor drug screening, drug resistentie tests en tumor migratie observaties6,18,19,20,21.
Met een ultieme poging om zPDX te gebruiken als screening/testplatform voor klinisch gebruik, beschrijven we hier een geoptimaliseerd voorstel voor het zPDX-model van pancreaskanker, waarmee de in vivo kandidaatgeneesmiddelen beoordeling binnen korte tijd met minder cellen tegen lagere kosten mogelijk is. Vergeleken met de eerdere referenties over zpdx6,9,10, introduceerden we verschillende optimalisaties om het systeem realiseerbaar en betrouwbaarder te maken voor klinische gepersonaliseerde diagnoses: 1) verschillende cellen vooraf sorteren groepen in de primaire tumorweefsels en stabiliseert primaire cellen voor een week voor verdere experimenten; 2) labelen van de menselijke cellen en verbetering van de levensvatbaarheid van de cel in xenotransplantaatmodellen is via lentivirus gebaseerde genetische modificatie; 3) het optimaliseren van de zebravis cultuur conditie in beide voedingssupplementen (glucose en glutamine) en temperatuur; 4) kwantificeren van de Drug reacties van verschillende celtypen op een vergelijkende manier. We hebben ook wijzigingen aangebracht in de injectie oplossing door verschillende aanvullende materialen toe te voegen. In totaal bieden deze verbeteringen de mogelijkheid om snel een meer patiënt-achtige xenotransplantaatmodellen is in zebravis-hosts te genereren die kan worden gebruikt als een betrouwbaar hulpmiddel om de respons van kandidaatmedicijnen te beoordelen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

Patiënt-afgeleide tumor xenotransplantaatmodellen is (PDX) en cel-afgeleide tumor xenotransplantaatmodellen is (CDX) zijn belangrijke technieken voor Preklinische beoordeling, medicatie begeleiding en fundamentele kanker onderzoeken. Generaties PDX-modellen in traditionele hostmuizen zijn tijdrovend en werken slechts voor een klein deel van de monsters. Onlangs is zebravis PDX (zpdx) ontstaan als een uniek hostsysteem, met de kenmerken van kleinschalige en hoge efficiëntie. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methodologie voor het genereren van een dubbel fluorescentie-gelabeld tumor xenotransplantaatmodellen is-model voor vergelijkende chemotherapie-evaluatie in zpdx-modellen. Tumor cellen en fibroblasten werden verrijkt met vers geoogst of bevroren pancreaskanker weefsel onder verschillende cultuuromstandigheden. Beide celgroepen werden gelabeld door lentivirus dat groene of rode fluorescentie eiwitten uitdrukt, evenals een gen BCL2L1dat anti-apoptosis heeft. De getransfeerde cellen werden voorgemengd en geïnjecteerd in de 2 DPF larvale zebravis die vervolgens werden gefokt in gemodificeerde E3 medium op 32 ° c. De xenotransplantaatmodellen is modellen werden behandeld door chemotherapie drugs en/of BCL2L1 inhibitor, en de vicapaciteiten van beide tumorcellen en fibroblasten werden gelijktijdig onderzocht. Samenvattend, dit protocol stelt onderzoekers in staat om snel een grote hoeveelheid zPDX modellen met een heterogene tumor micro-omgeving te genereren en biedt een langere observatie-venster en een preciezere kwantificerings bij het beoordelen van de efficiëntie van drugs kandidaten.

Een schematische schets van de procedure wordt weergegeven in Figuur 1. Kortom, de primaire kanker weefselcellen werden in het volledige medium na de spijsvertering, met of zonder toevoeging van alvleesklierkanker fibroblast remmers. Kankercellen en fibroblasten werden verrijkt als twee verschillende populaties die fibroblasten gedomineerd zonder remmers, en kanker celgroei heerste na de toevoeging van remmers (Figuur 2). Er werd...

Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Dit protocol beschrijft de optimalisatie procedures in een virus-gebaseerde Dual fluorescentie-gelabelde tumor xenotransplantaatmodellen is model met behulp van larvale zebravis als gastheren. Dit heterogene xenotransplantaatmodellen is-model bootst de weefsel samenstelling van de micro-omgeving van pancreaskanker na in vivo en dient als een preciezer hulpmiddel voor het beoordelen van geneesmiddel responsen in gepersonaliseerde zpdx (Zebrafish patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is) modellen.

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Vandaag introduceren we een larven Zebrafish PDX Model. Dit model is belangrijk omdat ze een vergelijkbare cellulaire samenstelling in de xenograft beter kunnen nabootsen voor het beoordelen van medicijnreacties en ook de consistentie van de resultaten verder verbeteren met onze vergelijkende analyse. Er zijn twee belangrijke voordelen van deze techniek.Ten eerste gebruiken we verschillende standaard chemische kleurstoffen om cellen in verschillende fluorescentie te etiketteren, waardoor de real-time tracering van de cellulaire composities en het vermogen van de angraphfase mogelijk is. Ten tweede verbetert het ook de algemene overlevingstijd van menselijke cellen in zebravissen, hun genetische modificatie, die een langer observatievenster biedt voor drugstesten. Deze techniek biedt een potentieel model voor gepersonaliseerde geneeskunde voor patiënten met alvleesklierkanker en ook voor de pre-beoordeling van preklinische tumordrug.Deze methode kan ook worden gebruikt om andere tumorcellen of geen tumorcel xenografted in zebravissen in vivo te traceren en om de celoverleving voor langere observatietijd te verbeteren. Om de injectieplaat voor te bereiden, bereidt u een 50 milliliter oplossing van 1% agarose in E3-oplossing. Kook de oplossing tot de agarose oplost.Giet de hele oplossing in een petrischaal van 10 centimeter en plaats vervolgens de Zebrafish embryo fixatiemal op het oppervlak. Wanneer de agarose oplossing volledig stolt, verwijder de mal. Om injectienaalden voor te bereiden, gebruikt u een naaldtrekker om een glazen capillair van 10 centimeter met een binnendienmaat van 0,9 millimeter in twee naalden te trekken.Met behulp van een microscoop en tangen, snijd het einde van de naald om een opening te creëren. Plaats eerst een tot twee paar volwassen Zebrafish in een paringstank rond zeven tot negen pm. Om acht uur de volgende ochtend, het verzamelen van de bevruchte eieren. Breng de bevruchte eieren over op een petrischaaltje met 40 milliliter verse E3-oplossing.Incubeer bij 28.5 graden Van Celsius. Breng eerst het verzamelde alvleesklierkankermonster over in een petrischaaltje. Spoel het weefsel vijf tot zes keer met PBS en gebruik een scalpel om het weefsel in een millimeter blokjes te snijden.Breng vervolgens het versnipperde weefsel over in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter HBSS. Voeg collagenase type vier, hyalurodinase, en DNAse een op de laatste concentraties hier getoond. Pipette het mengsel op en neer om goed te mengen.Incubeer het mengsel bij 37 graden Celsius in een 5%koolstofdioxide incubator gedurende 15 tot 20 minuten. Pipette het mengsel op en neer een paar keer om de vijf minuten. Voeg zeven milliliter DMEM toe aan de buis.Centrifuge op 110 keer G en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Decanteer vervolgens het supernatant en schort het tumormengsel opnieuw op in DMEM. Plaat het mengsel in twee zes centimeter Petri gerechten met drie milliliter van volledige groei media genaamd groep een en groep twee.Broed beide groepen bij 37 graden Celsius in een 5%koolstofdioxide incubator. Na 48 uur, voeg 100x remmer van alvleesklierkanker fibroblasten in het medium van groep een om de overwoekerde fibroblasten te verwijderen, waardoor de kankercellen als de belangrijkste celtypes. Doorgaan met uitbroeden met behulp van de vorige voorwaarden.Na de productie van het lentivirus, zaad van de cellen te worden besmet in een 12-put plaat met 30 tot 40%-dichtheid. Kweek de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius in een 5%koolstofdioxide incubator. De volgende dag, vervang het medium met 500 microliter serum-vrij medium met polybrene met een concentratie van acht microgram per milliliter.Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende vier uur. Voeg vervolgens 100 microliter van het lentivirus toe aan het medium en incubbate opnieuw gedurende 12 uur. Na 12 uur, vervang het medium met twee milliliter van volledige medium en incubbate voor een extra 36 uur.Controleer na 36 uur de fluorescentiemarkers. Oogst de geïnfecteerde cellen en meng ze met een één-op-één verhouding met een uiteindelijke concentratie van een miljoen cellen per milliliter. Centrifugeren de cellen op 110 keer G gedurende vijf minuten en opnieuw opschorten het celmengsel in 50 microliter injectieoplossing.Na het verdoven van de Zebrafish larven, breng ze in de injectieplaat, die is gevuld met gemodificeerde E3. Neem 25 microliter van de gemengde celsuspensie in de microcapillaire naald en steek de naald in de microinjectiemanipulator. Stel de injectiedruk en tijd in en injecteer 50 tot 80 cellen in de dooierzak van 48 uur na de bevruchting Zebrafish. Breng eerst de na-zenografted Zebrafish larven over in 40 milliliter mixoplossing bij 32 graden Celsius.Plaats 10 zenografted larven in elke put van een 12-put plaat. Verdeel de larven vervolgens in vier groepen. Behandel de controlegroep met E3 met 0,1%DMSO en behandel de andere groepen met Gemcitabine en/of Navitoclax.Broed alle larven twee dagen lang uit op 32 graden Celsius. Na het verdoven van de zenografted larven na de behandeling, plaats ze in 3%methylcellulose. Gebruik een fluorescentie of confocale microscoop om de larven vanuit de zijaanzicht in beeld te brengen.Gebruik vervolgens beeld J en grafische padsoftware om de intensiteit van rode en groene fluorescentiesignalen te kwantificeren. In deze studie worden primaire kankerweefselcellen na de spijsvertering in het volledige medium gezaaid met of zonder de toevoeging van fibroblaspersremmers van alvleesklierkanker. Kankercellen en fibroblasten zijn verrijkt als twee verschillende populaties.De populatie zonder remmers wordt gedomineerd door fibroblasten, terwijl de groei van de kankercel heerst na de toevoeging van remmers. Twee lentivirale verpakkingsvectoren zijn gebouwd die groene of rode fluorescerende eiwitten uitdrukken in BCL2L1. De virus-gebaseerde fluorescentie etikettering vertegenwoordigt de overlevingsstatus van de cellen.De gemengde kankercellen en fibroblasten worden geïnjecteerd in de Zebrafish dooierzak na 48 uur na de bevruchting en worden vervolgens twee dagen behandeld met Gemcitabine en/of Navitoclax. De cel viabilities in verschillende populaties en cellulaire samenstelling van de zenograft worden veranderd als de reacties op de behandeling van de drug. Bij de verwerking van verschillende soorten tumoren, Er zijn verschillende stappen die kunnen moeten worden bezwaar gemaakt, met inbegrip van cel spijsvertering tijd, drug behandeling dosering, en ga zo maar door.Deze techniek helpt onderzoekers om Zebrafish te gebruiken vanuit een standaard CGX of PDS test. Het zorgt voor het mengen en injecteren van verschillende cellen bij vaste verhoudingen om de voortgangsbanden te kwantificeren door ze te vergelijken met celgroei. Persoonlijke bescherming is van groot belang, vooral bij het verpakken van lentivirus.Draag maskers en handschoenen indien nodig en probeer niet te mengen op de huid.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Ontwikkeling en onderhoud van een preklinisch Patient Afgeleid Tumor xenograft model voor onderzoek naar nieuwe anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Een Murine Ommaya Xenograft-model om direct-gerichte therapie van leptomeningeale ziekte te bestuderen

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

De oprichting en het gebruik van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van metastasen van het centrale zenuwstelsel

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebravislarven als model om potentiële radiosensibilisatoren of beschermers te evalueren

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...