Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 und 18ZR1404500

Alle tierischen Verfahren wurden genehmigt und folgten den Richtlinien der Animal Ethics Committee an der Fudan University und alle Proben von Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden vom Fudan University Shanghai Cancer Center bezogen. Die Ethikkommission der FUSCC erhielt die ethische Zustimmung, und jeder Patient erhielt die schriftliche Zustimmung in Kenntnis der Sachlage.
1. Vorbereitung der Ausrüstung für die Mikroinjektion
<ol><li>
Vorbereitung der Injektionsplatte.
	<ol>
<...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

Sowohl PDX- als auch CDX-Modelle sind wichtige Plattformen im Bereich der Tumorbiologie22, und der entscheidende Schritt einer erfolgreichen Tierübergreifenden Transplantation ist die Verbesserung des Überlebens des Xenografts.  Kürzlich haben einige Studien gezeigt, dass die transiente Expression von BCL2L1 (BCL-XL) oder BCL2 die Lebensfähigkeit menschlicher embryonaler Stammzellen in Mäusewirten signifikant verbessern kann, ohne die Zellidentitäten und Schicksal...

Die Präzisionsonkologie zielt darauf ab, die vorteilhaftesten therapeutischen Strategien für den einzelnen Patienten zu finden1. Derzeit werden zahlreiche präklinische Modelle wie In-vitro-Primärkultur, In-vitro-Organoidkultur2und patientenabgeleitete Xenografts (PDX) bei Mäusen vor oder nach der Organoidkultur zur Diagnose und zur Prüfung/Bewertung des Potenzials vorgeschlagen. therapeutische Entscheidungen3. PDX-Modell durch die Injektion von menschlichen primären Krebszellen in immungeschwächte Mäuse generiert, ist eines der vielversprechendsten Werkzeuge für personalisierte Arzneimittel-Screening in der klinischen Onkologie3,4. Im Gegensatz zur kultivierten Zelllinie in vitro bewahren PDX-Modelle in der Regel die Integrität und Heterogenität der In-vivo-Tumorumgebung, imitieren besser die Vielfalt und die eigenwilligen Eigenschaften verschiedener Tumorpatienten und können daher die potenzielle medizinische Ergebnisse von Patienten4. Die Generierung von PDX-Modellen bei Mäusen erfordert jedoch qualitativ hochwertige Patientenproben und Monate Zeit, um genügend Zellen und Modelle für Multi-Gruppen-Experimente zu sammeln, und die zellulären/genetischen Zusammensetzungen des Xenografts können von denen des Originals abweichen. Biopsie des Patienten. Die Erfolgsrate bei der Etablierung des PDX-Modells von Mäusen ist ebenfalls gering, was eine breite Umsetzung in der klinischen Praxis erschwert. Für Patienten, die schnell fortschreitende Krebsarten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs tragen, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, rechtzeitig wertvolle Informationen aus den PDX-Experimenten zu erhalten.
In den letzten Jahren wurden Zebrafische als potenzielle Wirte nicht nur für CDX-Modelle (Zell-abgeleitetes Tumor-Xenograft), sondern auch für PDX-Modelle5,6,7,8,9, 10. Als Wirbeltier-Modelltier hat Zebrafisch genügend Ähnlichkeiten mit Säugetieren sowohl in der Genetik als auch in der Physiologie, mit zwei wesentlichen Vorteilen: Transparenz und klein in Größe11. Zebrafische sind auch sehr fecundity, und Hunderte von inzuchtigen Larven können innerhalb weniger Tage von einem einzigen Paar Erwachsene12erhalten werden. Mehrere Studien haben Zebrafische verwendet, um sowohl transgene als auch Xenograft-Modelle von Krebserkrankungen zu erzeugen13,14. Im Vergleich zu Mäusexenografts ermöglichen Zebrafisch-Xenografts die Verfolgung mit Einzelzellauflösung. Eine bestimmte Menge an menschlichen Geweben ist in der Lage, Hunderte von Zebrafisch PDX-Modelle (zPDXs) zu erzeugen, während kann nur ausreichen, um ein paar Mäuse PDX-Modelle15,16zu generieren. Außerdem entwickeln die Zebrafischlarven bei 2-5 dpf bereits komplette Kreislaufsysteme und Stoffwechselorgane wie Leber und Niere, aber nicht das Immunsystem17, während der verbleibende Dottersack ein natürliches 3D-Medium ist, ideal für Dasmedikamentenscreening, Resistenztests und Tumormigrationsbeobachtungen6,18,19,20,21.
Mit dem ultimativen Versuch, zPDX als Screening/Testplattform für den klinischen Einsatz zu nutzen, beschreiben wir hier einen optimierten Vorschlag für das zPDX-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, das es ermöglicht, die In-vivo-Kandidaten-Arzneimittel innerhalb kurzer Zeit mit weniger Zellen zu geringeren Kosten zu untersuchen. Im Vergleich zu den bisherigen Referenzen über zPDX6,9,10haben wir mehrere Optimierungen eingeführt, um das System für die klinische personalisierte Diagnose machbarer und zuverlässiger zu machen: 1) Vorsortierung verschiedener Zellen Gruppen in den primären Tumorgeweben und stabilisierenden Primärzellen für eine Woche vor weiteren Experimenten; 2) Kennzeichnung der menschlichen Zellen und Verbesserung der Zelllebensfähigkeit in Xenograft durch Lentivirus-basierte genetische Modifikation; 3) Optimierung der Zebrafischkultur Zustand in Nutriment Ergänzungen (Glukose und Glutamin) und Temperatur; 4) Quantifizierung der Wirkstoffreaktionen verschiedener Zelltypen in vergleichender Weise. Wir haben auch Änderungen an der Injektionslösung vorgenommen, indem wir mehrere zusätzliche Materialien hinzugefügt haben. Insgesamt bieten diese Verbesserungen die Möglichkeit, schnell ein patientenähnlicheres Xenograft in Zebrafisch-Wirten zu erzeugen, das als zuverlässiges Werkzeug zur Beurteilung der Reaktion von Kandidatenmedikamenten verwendet werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

Patienten-abgeleitetes Tumorxenograft (PDX) und zellabgeleitetes Tumorxenograft (CDX) sind wichtige Techniken für die präklinische Bewertung, Medikationsberatung und grundlegende Krebsforschung. Generationen von PDX-Modellen in traditionellen Wirtsmäusen sind zeitaufwändig und arbeiten nur für einen kleinen Teil der Proben. In letzter Zeit hat sich zebrafish PDX (zPDX) zu einem einzigartigen Wirtssystem entwickelt, mit den Eigenschaften von klein und hoch effizient. Hier beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Erzeugung eines dualen fluoreszenzmarkierten Tumor-Xenograft-Modells zur vergleichenden Chemotherapie-Bewertung in zPDX-Modellen. Tumorzellen und Fibroblasten wurden aus frisch geerntetem oder gefrorenem Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe unter verschiedenen Kulturbedingungen angereichert. Beide Zellgruppen wurden durch Lentivirus mit grünen oder roten fluoreszierenden Proteinen sowie einem Anti-Apoptose-Gen BCL2L1gekennzeichnet. Die transfizierten Zellen wurden vorgemischt und in die 2 dpf Larvenzebrafische mitinjiziert, die dann in modifiziertem E3-Medium bei 32 °C gezüchtet wurden. Die Xenograft-Modelle wurden mit Chemotherapie-Medikamenten und/oder BCL2L1-Hemmern behandelt, und die Viabilitäten von Tumorzellen und Fibroblasten wurden gleichzeitig untersucht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglicht, schnell eine große Menge an zPDX-Modellen mit einer heterogenen Tumormikroumgebung zu generieren und bietet ein längeres Beobachtungsfenster und eine genauere Quantifizierung bei der Bewertung der Effizienz von Wirkstoffkandidaten.

Eine schematisierte Gliederung der Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die primären Krebsgewebezellen wurden nach der Verdauung mit oder ohne Zugabe von Pankreaskrebs-Fibroblasten in das gesamte Medium eingesät. Krebszellen und Fibroblasten wurden als zwei verschiedene Populationen angereichert, die Fibroblasten ohne Inhibitoren dominierten, und das Wachstum von Krebszellen setzte sich nach der Zugabe von Inhibitoren durch (<strong class="x...

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Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment (Video) | JoVE

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren in einem virusbasierten Dual-Fluoreszenz-markierten Tumor-Xenograft-Modell unter Verwendung von Larvenzebrafischen als Wirte. Dieses heterogene Xenograft-Modell imitiert die Gewebezusammensetzung der Mikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs in vivo und dient als präziseres Werkzeug zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen in personalisierten zPDX-Modellen (Zebrafish Patient-derived xenograft).

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Heute werden wir eine Larven Zebrafish PDX Modell vorstellen. Dieses Modell ist wichtig, weil sie eine ähnliche Zellzusammensetzung im Xenograft zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen besser imitieren können und auch die Konsistenz der Ergebnisse mit unserer vergleichenden Analyse weiter verbessern. Es gibt zwei Hauptvorteile dieser Technik.Erstens verwenden wir verschiedene chemische Standardfarbstoffe, um Zellen in verschiedene Fluoreszenz zu kennzeichnen, was die Echtzeitverfolgung der zellulären Zusammensetzungen und die Fähigkeit der Anagraphenphase ermöglicht. Zweitens verbessert es auch die allgemeine Überlebenszeit menschlicher Zellen in Zebrafischen, ihre genetische Veränderung, die ein längeres Beobachtungsfenster für Drogentests bietet. Diese Technik bietet ein mögliches Modell für die personalisierte Medizin für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs und auch für die Vorbewertung von präklinischen Tumormedikamenten.Diese Methode kann auch verwendet werden, um andere Tumorzellen oder keine Tumorzelle xenografted in Zebrafischen in vivo zu verfolgen und das Zellüberleben für längere Beobachtungszeit zu verbessern. Zur Vorbereitung der Injektionsplatte eine 50-Milliliter-Lösung von 1%Agarose in E3-Lösung vorzubereiten. Die Lösung aufkochen, bis sich die Agarose auflöst.Gießen Sie die gesamte Lösung in eine 10 Zentimeter Petrischale und legen Sie dann die Zebrafisch-Embryo-Fixierungsform auf die Oberfläche. Wenn die Agarose-Lösung vollständig verfestigt ist, entfernen Sie die Form. Um Injektionsnadeln vorzubereiten, ziehen Sie mit einem Nadelzieher eine 10 Zentimeter lange Glaskapillare mit einer innengroßen Dimension von 0,9 Millimetern in zwei Nadeln.Schneiden Sie mit einem Mikroskop und einer Zange das Ende der Nadel, um eine Öffnung zu erzeugen. Legen Sie zunächst ein bis zwei Paare erwachsener Zebrafische gegen sieben bis um neun Uhr in einen Paarungsbecken. Um acht Uhr am nächsten Morgen die befruchteten Eier sammeln. Die befruchteten Eier in eine Petrischale mit 40 Milliliter frischer E3-Lösung geben.Bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie zunächst die gesammelte Bauchspeicheldrüsenkrebsprobe in eine Petrischale. Spülen Sie das Gewebe fünf- bis sechsmal mit PBS und verwenden Sie ein Skalpell, um das Gewebe in einen Millimeter gewürfelte Stücke zu schneiden.Als nächstes übertragen Sie das geschredderte Gewebe in eine 50-Milliliter-Röhre mit fünf Millilitern HBSS. Fügen Sie Kollagenase Typ 4, Hyalurodinase und DNAse eins bei den letzten Hiergezeigten konzentrationen hinzu. Pipette die Mischung nach oben und unten gut mischen.Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für 15 bis 20 Minuten. Pipette die Mischung auf und ab ein paar Mal alle fünf Minuten. Fügen Sie sieben Milliliter DMEM in die Röhre.Zentrifuge bei 110 mal G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dekantieren Sie dann den Überstand und setzen Sie die Tumormischung in DMEM erneut aus. Die Mischung in zwei sechs Zentimeter lange Petrischalen mit drei Millilitern Vollwachstumsmedien namens Gruppe eins und Gruppe zwei geben.Inkubieren Sie beide Gruppen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Nach 48 Stunden, fügen Sie 100x Inhibitor der Bauchspeicheldrüsenkrebs Fibroblasten in das Medium der Gruppe eins, um die überwucherten Fibroblasten zu entfernen, so dass die Krebszellen als die wichtigsten Zelltypen. Fahren Sie mit den vorherigen Bedingungen fort.Nach der Herstellung des Lentivirus, Samen die Zellen in eine 12-Well-Platte mit 30 bis 40% Dichte infiziert werden. Kultur die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 500 Mikroliter serumfreies Medium, das Polybren in einer Konzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter enthält.Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für vier Stunden inkubieren. Dann fügen Sie weitere 100 Mikroliter des Lentivirus in das Medium und brüten wieder für 12 Stunden. Nach 12 Stunden das Medium durch zwei Milliliter komplettes Medium ersetzen und für weitere 36 Stunden inkubieren.Überprüfen Sie nach 36 Stunden die Fluoreszenzmarker. Ernten Sie die infizierten Zellen und mischen Sie sie im Eins-zu-Eins-Verhältnis mit einer Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 110 mal G für fünf Minuten und setzen Sie das Zellgemisch in 50 Mikroliter Injektionslösung wieder auf.Nach der Anästhesisierung der Zebrafischlarven in die Injektionsplatte, die mit modifiziertem E3 gefüllt ist, geben. Nehmen Sie 25 Mikroliter der gemischtzelligen Suspension in die Mikrokapillarnadel auf und legen Sie die Nadel in den Mikroinjektionsmanipulator ein. Stellen Sie den Injektionsdruck und die Zeit ein und injizieren Sie 50 bis 80 Zellen in den Dottersack von 48 Stunden nach der Befruchtung Zebrafische. Zuerst übertragen Sie die nachzenografierten Zebrafischlarven in 40 Milliliter Mischlösung bei 32 Grad Celsius.Legen Sie 10 zenografierte Larven in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte. Als nächstes teilen Sie die Larven in vier Gruppen. Behandeln Sie die Kontrollgruppe mit E3 mit 0,1%DMSO und behandeln Sie die anderen Gruppen mit Gemcitabin und/oder Navitoclax.Alle Larven zwei Tage lang bei 32 Grad Celsius bebrüten. Nach der Anästhesisierung der zenotransplantierten Larven nach der Behandlung in 3%Methylcellulose geben. Verwenden Sie ein Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop, um die Larven aus der seitlichen Ansicht abzubilden.Verwenden Sie dann Bild J und Graphpad-Software, um die Intensität von roten und grünen Fluoreszenzsignalen zu quantifizieren. In dieser Studie werden primäre Krebsgewebezellen nach der Verdauung mit oder ohne Zugabe von Pankreaskrebs-Fibroblasten-Inhibitoren in ein vollständiges Medium ausgesät. Krebszellen und Fibroblasten werden als zwei verschiedene Populationen angereichert.Die Population ohne Inhibitoren wird von Fibroblasten dominiert, während das Wachstum von Krebszellen nach der Zugabe von Inhibitoren vorherrscht. Es werden zwei lentivirale Verpackungsvektoren konstruiert, die grüne oder rote fluoreszierende Proteine in BCL2L1 ausdrücken. Die virusbasierte Fluoreszenzkennzeichnung stellt den Überlebensstatus der Zellen dar.Die gemischten Krebszellen und Fibroblasten werden nach 48 Stunden nach der Befruchtung in den Zebrafisch-Dottersack injiziert und anschließend zwei Tage lang mit Gemcitabin und/oder Navitoclax behandelt. Die Zellviabilitäten in verschiedenen Populationen und die zelluläre Zusammensetzung des Zenografts werden als Reaktionen auf die medikamentöse Behandlung verändert. Bei der Verarbeitung verschiedener Arten von Tumoren, Es gibt mehrere Schritte, die möglicherweise beanstandet werden müssen, einschließlich der Zellverdauungszeit, Dosierung der medikamentösen Behandlung, und so weiter.Diese Technik hilft Forschern, Zebrafische aus einem Standard-CGX- oder PDS-Assay zu verwenden. Es ermöglicht die Mischung und Injektion verschiedener Zellen in festen Verhältnissen, um die Fortschrittsbänder zu quantifizieren, indem sie mit dem Zellwachstum verglichen werden. Persönlicher Schutz ist von großer Bedeutung, vor allem bei der Verpackung lentivirus.Tragen Sie Masken und Handschuhe, wenn dies angebracht ist, und versuchen Sie nicht, auf der Haut zu mischen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies (Video) | JoVE

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Forschung

Krebsforschung

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model (Video) | JoVE

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells (Video) | JoVE

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines (Video) | JoVE

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models (Video) | JoVE

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform (Video) | JoVE

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish (Video) | JoVE

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease (Video) | JoVE

Ein murines Ommaya Xenograft-Modell zur Untersuchung der direkten zielgerichteten Therapie von Leptomeningealerkrankungen

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients (Video) | JoVE

Patienten-abgeleitete Tumor-Explantate als "Live" präklinische Plattform zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei Patienten

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis (Video) | JoVE

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...