Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12D-2295100, 14YF1400600 e 18-R1404500

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate e hanno seguito le linee guida del Comitato Etico Animale della Fudan University e tutti i campioni di cancro al pancreas sono stati ottenuti dal Fudan University Shanghai Cancer Center. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato Etico FUSCC e da ciascun paziente è stato ottenuto il consenso informato scritto.
1. Preparazione dell'apparecchiatura per la Microiniezione
<ol><li>
Preparazione della piastra di iniezione.</st...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. 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Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. 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J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

Entrambi i modelli PDX e CDX sono piattaforme vitali nel campo della biologia tumorale22,e la fase critica di un trapianto interspecie di successo è quello di migliorare la sopravvivenza dello xenotrapianto.  Recentemente, alcuni studi hanno dimostrato che l'espressione transitoria di BCL2L1 (BCL-XL) o BCL2 può migliorare significativamente la vitalità delle cellule staminali embrionali umane negli ospiti dei topi senza influenzare le identità cellulari e i destini<...

L'oncologia di precisione mira a trovare le strategie terapeutiche più vantaggiose per il singolo paziente1. Attualmente, numerosi modelli preclinici come la coltura primaria in vitro, la coltura organoide in vitro2e gli xenografifti derivati dal paziente (PDX) nei topi prima o dopo la coltura organoide sono proposti per la diagnosi e per vagliare/valutare il potenziale scelte terapeutiche3. Modello PDX generato dall'iniezione di cellule tumorali primarie umane in topi immunocompromessi, è uno degli strumenti più promettenti per lo screening farmacologico personalizzato in oncologia clinica3,4. A differenza della linea cellulare coltivata in vitro, i modelli PDX di solito conservano l'integrità e l'eterogeneità dell'ambiente tumorale in vivo, imitando meglio la diversità e le caratteristiche idiosincratiche di diversi pazienti tumorali, e quindi, possono prevedere potenziale esito medico dei pazienti4. Tuttavia, la generazione di modelli PDX nei topi richiede campioni di pazienti di alta qualità e mesi di tempo per raccogliere cellule e modelli sufficienti per esperimenti multigruppo, e le composizioni cellulari/genetiche dello xenotrapianto possono derivarsi da quelle dell'originale biopsia del paziente. Anche il tasso di successo per la creazione del modello PDX dei topi è basso, rendendo difficile l'implementazione nella pratica clinica. Per i pazienti che trasportano carcini rapidamente progrediti come il cancro al pancreas, potrebbero non essere in grado di ottenere informazioni preziose dagli esperimenti PDX in tempo.
Negli ultimi anni, il pesce zebra è stato segnalato per essere potenziali host non solo per i modelli CDX (xenogrofo tumorale derivato dalla cellula), ma anche modelli PDX5,6,7,8,9, 10. Come animale modello di vertebrato, il pesce zebra presenta sufficienti somiglianze con i mammiferi sia in genetica che in fisiologia, con due vantaggi significativi: trasparenza e piccola taglia11. Il pesce zebra è anche altamente fecondità, e centinaia di larve inbred possono essere ottenute in pochi giorni da una singola coppia di adulti12. Diversi studi hanno impiegato pesci zebra per generare modelli sia transgenici che xenotrapiformi di malattie tumorali13,14. Rispetto agli xenografti di topi, gli xenografti di pesce zebra consentono il tracciamento a risoluzione a singola cellula. Una certa quantità di tessuti umani è in grado di generare centinaia di modelli PDX di pesce zebra (zPDX), mentre può essere sufficiente solo per generare un paio di topi pdX modelli15,16. Inoltre, le larve di pesce zebra a 2-5 dpf già sviluppano sistemi circolatori completi e organi metabolici come fegato e reni, ma non il sistema immunitario17, mentre il sacco del tuorlo rimanente è un mezzo 3D naturale, ideale per lo screening farmacologico, farmaco test di resistenza e osservazioni di migrazione tumorale6,18,19,20,21.
Con un ultimo tentativo di utilizzare zPDX come piattaforma di screening/test per l'uso clinico, qui, descriviamo una proposta ottimizzata per il modello zPDX del cancro al pancreas, che consente la valutazione del farmaco candidato in vivo in breve tempo utilizzando meno cellule a costi inferiori. Rispetto ai precedenti riferimenti su zPDX6,9,10, abbiamo introdotto diverse ottimizzazioni per rendere il sistema più fattibile e affidabile per la diagnosi clinica personalizzata: 1) pre-ordinamento di diverse cellule gruppi nei tessuti tumorali primari e stabilizzare le cellule primarie per una settimana prima di ulteriori esperimenti; 2) etichettare le cellule umane e migliorare la vitalità cellulare in xenotrapianto tramite modificazione genetica basata su lentivirus; 3) ottimizzare la condizione di coltura del pesce zebra sia negli integratori di nutrimento (glucosio e glutammina) che nella temperatura; 4) quantificare le risposte ai farmaci di diversi tipi di cellule in modo comparativo. Abbiamo anche apportato modifiche alla soluzione di iniezione aggiungendo diversi materiali supplementari. Complessivamente, tali miglioramenti offrono la possibilità di generare rapidamente uno xenotrapianto più simile a quello del paziente negli ospiti di pesci zebra che può essere utilizzato come strumento affidabile per valutare la risposta dei farmaci candidati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

Lo xenotrapianto tumorale derivato dal paziente (PDX) e lo xenotrapianto tumorale derivato dalle cellule (CDX) sono tecniche importanti per la valutazione preclinica, la guida medica e le ricerche di base sul cancro. Generazioni di modelli PDX in topi host tradizionali richiedono molto tempo e lavorano solo per una piccola parte di campioni. Recentemente, il PDX del pesce zebra (zPDX) è emerso come un sistema host unico, con le caratteristiche di piccola e alta efficienza. Qui, descriviamo una metodologia ottimizzata per la generazione di un modello di xenotrapianto tumorale a doppia fluorescenza per la valutazione chemioterapia comparativa nei modelli zPDX. Le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati arricchiti da tessuti tumorali pancreatici appena raccolti o congelati in diverse condizioni di coltura. Entrambi i gruppi cellulari sono stati etichettati dal lentivirus che esprime proteine fluorescenti verdi o rosse, così come un gene anti-apoptosi BCL2L1. Le cellule trasfette sono state pre-miscelate e co-iniettate nel pesce zebra larvale 2 dpf che sono stati poi allevati in un mezzo E3 modificato a 32 gradi centigradi. I modelli di xenotrapianto sono stati trattati con farmaci chemioterapici e/o inibitori di BCL2L1, e le vibilità di entrambe le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati studiati simultaneamente. In sintesi, questo protocollo consente ai ricercatori di generare rapidamente una grande quantità di modelli zPDX con un microambiente tumorale eterogeneo e fornisce una finestra di osservazione più lunga e una quantificazione più precisa nella valutazione dell'efficienza dei farmaci candidati.

Nella figura 1è presente una struttura schematizzata della procedura. In breve, le cellule del tessuto tumorale primario sono state semiate nel mezzo completo dopo la digestione con o senza l'aggiunta di inibitori fibroblasti del cancro al pancreas. Le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati arricchiti come due distinte popolazioni che i fibroblasti dominavano senza inibitori, e la crescita delle cellule tumorali ha prevalso dopo l'aggiunta di inibitori ...

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Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modello Xenotrapianto eterogeneo derivato dal paziente del cancro pancreatico utilizzando larve di pesce zebra come ospiti per la valutazione comparativa del farmaco

Questo protocollo descrive le procedure di ottimizzazione in un modello di xenotrapianto tumorale a doppia fluorescenza basato su virus utilizzando il pesce zebra larva come ospiti. Questo modello xenotrapianto eterogeneo imita la composizione tissutale del microambiente del cancro al pancreas in vivo e funge da strumento più preciso per valutare le risposte ai farmaci in modelli personalizzati zPDX (zebrafish patient-derived xenogrft).

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Oggi presenteremo un modello ZEBRAFISH PDX di larve. Questo modello è significativo perché possono imitare meglio una composizione cellulare simile nello xenograft per valutare le risposte ai farmaci e migliorano ulteriormente la coerenza dei risultati con la nostra analisi comparativa. Ci sono due vantaggi principali di questa tecnica.In primo luogo, utilizziamo vari coloranti chimici standard per etichettare le cellule in diversa fluorescenza, consentendo il tracciamento in tempo reale delle composizioni cellulari e la capacità della fase anagrafica. In secondo luogo, migliora anche il tempo generale di sopravvivenza delle cellule umane nei pesci zebra, la loro modificazione genetica, che fornisce una finestra di osservazione più lunga per i test farmacologici. Questa tecnica fornisce un potenziale modello per la medicina personalizzata per i pazienti con cancro al pancreas e anche per la pre-valutazione del farmaco tumorale pre-clinico.Questo metodo può anche essere utilizzato per rintracciare altre cellule tumorali o nessuna cellula tumorale xenografata in zebrafish in vivo e per migliorare la sopravvivenza cellulare per un tempo di osservazione più lungo. Per preparare la piastra di iniezione, preparare una soluzione da 50 millilitri dell'1%agarosio in soluzione E3. Far bollire la soluzione fino a quando l'agarosio si dissolve.Versare l'intera soluzione in una piastra di Petri di 10 centimetri e quindi posizionare lo stampo di fissazione dell'embrione Zebrafish sulla superficie. Quando la soluzione di agarosio si solidifica completamente, rimuovere lo stampo. Per preparare gli aghi di iniezione, utilizzare un estrattore di ago per tirare un capillare di vetro di 10 centimetri con una dimensione interna di 0,9 millimetri in due aghi.Utilizzando un microscopio e pini, tagliare l'estremità dell'ago per creare un'apertura. Per prima cosa, metti da una a due paia di Zebrafish adulti in un serbatoio di accoppiamento intorno alle 19:00. Alle otto del mattino successivo, raccogli le uova fecondate. Trasferire le uova fecondate in una piastra di Petri contenente 40 millilitri di soluzione E3 fresca.Incubare a 28,5 gradi Celsius. In primo luogo, trasferire il campione di cancro al pancreas raccolto in una piastra di Petri. Risciacquare il tessuto da cinque a sei volte con PBS e utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto in pezzi a cubetti di un millimetro.Successivamente, trasferire il tessuto triturato in un tubo da 50 millilitri contenente cinque millilitri di HBSS. Aggiungere collagenasi di tipo quattro, ialurodinasi e DNAsi uno alle concentrazioni finali mostrate qui. Pipettare la miscela su e giù per mescolare bene.Incubare la miscela a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% per 15-20 minuti. Pipettare la miscela su e giù un paio di volte ogni cinque minuti. Aggiungere sette millilitri di DMEM al tubo.Centrifuga a 110 volte G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, decantare il supernatante e sospendere di nuovo la miscela tumorale in DMEM. Placcare la miscela in due piastre di Petri di sei centimetri contenenti tre millilitri di mezzi di crescita completi denominati gruppo uno e gruppo due.Incubare entrambi i gruppi a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Dopo 48 ore, aggiungere 100x inibitore dei fibroblasti del cancro al pancreas nel mezzo del primo gruppo per rimuovere i fibroblasti ricoperti di vegetazione, lasciando le cellule tumorali come i principali tipi di cellule. Continuare a incubare utilizzando le condizioni precedenti.Dopo aver prodotto il lentivirus, seminare le cellule da infettare in una piastra da 12 po 'con una densità dal 30 al 40%. Coltura delle cellule durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con 500 microlitri di mezzo privo di siero contenente polibrene ad una concentrazione di otto microgrammi per millilitro.Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per quattro ore. Quindi, aggiungere altri 100 microlitri del lentivirus al mezzo e incubare di nuovo per 12 ore. Dopo 12 ore, sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo completo e incubare per altre 36 ore.Dopo 36 ore, controllare i marcatori di fluorescenza. Raccogliere le cellule infette e mescolarle con un rapporto uno a uno con una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro. Centrifugare le cellule a 110 volte G per cinque minuti e sospendere di nuovo la miscela cellulare in 50 microlitri di soluzione di iniezione.Dopo aver anestetizzato le larve di Zebrafish, trasferirle nella piastra di iniezione, che viene riempita con E3 modificata. Prendere 25 microlitri della sospensione a celle miste nell'ago microcapillare e inserire l'ago nel manipolatore di microiniezione. Impostare la pressione e il tempo di iniezione e iniettare da 50 a 80 cellule nel sacco vitellino di 48 ore dopo la fecondazione Zebrafish. In primo luogo, trasferire le larve di Zebrafish post-zenografate in 40 millilitri di soluzione di mix a 32 gradi Celsius.Posizionare 10 larve zenografate in ogni pozzo di un piatto di 12 po '. Successivamente, dividi le larve in quattro gruppi. Trattare il gruppo di controllo con E3 contenente lo 0,1%DMSO e trattare gli altri gruppi con Gemcitabina e/o Navitoclax.Incubare tutte le larve a 32 gradi Celsius per due giorni. Dopo aver anestetizzato le larve zenografate dopo il trattamento, mettile in cellulosa metile al 3%.. Utilizzare una fluorescenza o un microscopio confocale per immagini le larve dalla vista laterale.Quindi, utilizzare il software image J e graph pad per quantificare l'intensità dei segnali di fluorescenza rossi e verdi. In questo studio, le cellule primarie del tessuto tumorale vengono sementi in mezzo completo dopo la digestione con o senza l'aggiunta di inibitori dei fibroblasti del cancro al pancreas. Le cellule tumorali e i fibroblasti sono arricchiti come due popolazioni distinte.La popolazione senza inibitori è dominata dai fibroblasti mentre prevale la crescita delle cellule tumorali dopo l'aggiunta di inibitori. Sono costruiti due vettori di imballaggio lentivirale che esprimono proteine fluorescenti verdi o rosse in BCL2L1. L'etichettatura a fluorescenza a base di virus rappresenta lo stato di sopravvivenza delle cellule.Le cellule tumorali miste e i fibroblasti vengono iniettati nel sacco tuorlo Zebrafish a 48 ore dopo la fecondazione e quindi trattati con Gemcitabina e/o Navitoclax per due giorni. Le viabilità cellulari in diverse popolazioni e la composizione cellulare dello zenograft sono cambiate come risposte al trattamento farmacologico. Quando si elaborano diversi tipi di tumori, ci sono diversi passaggi che potrebbero dover essere oggettivati, tra cui il tempo di digestione cellulare, il dosaggio del trattamento farmacologico e così via.Questa tecnica aiuta i ricercatori ad utilizzare Zebrafish da un saggio CGX o PDS standard. Consente la miscelazione e l'iniezione di diverse cellule a rapporti fissi per quantificare le bande di avanzamento confrontandole con la crescita cellulare. La protezione personale è di grande importanza, specialmente quando si confeziona il lentivirus.Indossare maschere e guanti quando appropriato e cercare di non mescolare sulla pelle.

Research

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Cancer Research

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