Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

この研究は、中国国立自然科学財団81402582、上海自然科学財団12DZ2295100、14YF1400600および18ZR1404500によって支援されました。

すべての動物の手順が承認され、復旦大学の動物倫理委員会のガイドラインに従い、すべての膵臓癌標本は復旦大学上海癌センターから得られました。FUSCC倫理委員会から倫理的承認を得て、各患者から書面によるインフォームド・コンセントが得られた。
1. マイクロインジェクション用機器の準備
<ol><li>
射出プレートを準備する。
	<ol>
<li>E3溶液に溶解し...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

PDXおよびCDXモデルはいずれも腫瘍生物学22の分野における重要なプラットフォームであり、種間移植の成功の重要なステップは異種移植片の生存率を改善することである。 最近、いくつかの研究は、BCL2L1(BCL-XL)またはBCL2の一過性発現が細胞の同一性および運命に影響を与えることなくマウス宿主におけるヒト胚性幹細胞の生存率を有意に改善する可能性...

精密腫瘍学は、個々の患者1のための最も有益な治療戦略を見つけることを目指しています。現在、インビトロ一次培養、インビトロオルガノイド培養2、およびオルガノイド培養前後のマウスにおける患者由来異種移植片(PDX)などの多数の前臨床モデルが、診断およびスクリーニング/評価のために提案されている。治療上の選択肢3.ヒト原発癌細胞を免疫侵害マウスに注射することによって生成されるPDXモデルは、臨床腫瘍学3、4におけるパーソナライズされた薬物スクリーニングのための最も有望なツールの1つである。インビトロの培養細胞株とは異なり、PDXモデルは通常、生体内腫瘍環境の完全性と不均一性を維持し、異なる腫瘍患者の多様性および特異的特性をより良く模倣し、したがって、患者4の潜在的な医学的結果.しかし、マウスにおけるPDXモデルの生成は、多集団実験のための十分な細胞およびモデルを集めるために高品質の患者サンプルと数ヶ月の時間を必要とし、異種移植片の細胞/遺伝的組成物は、元のものから漂流する可能性がある患者の生検。マウスPDXモデルの確立に向けた成功率も低く、臨床現場での広く実施することが困難です。膵臓癌のような急速に進行した癌を運ぶ患者のために、彼らは時間内にPDX実験から貴重な情報を得ることができないかもしれません。
ここ数年、ゼブラフィッシュはCDX(細胞由来腫瘍異種移植片)モデルだけでなく、PDXモデル5、6、7、8、9の潜在的な宿主であると報告されている。10.脊椎動物モデル動物として、ゼブラフィッシュは遺伝学と生理学の両方で哺乳類と十分な類似性を抱き、2つの重要な利点を有する:透明性および小さいサイズ11。ゼブラフィッシュはまた、非常にフェクティビティであり、何百もの繁殖幼虫は、成人12の単一のペアから数日以内に得ることができます。いくつかの研究は、癌疾患のトランスジェニックおよび異種移植片モデルの両方を生成するためにゼブラフィッシュを採用しています13,14.マウス異種移植片と比較して、ゼブラフィッシュ異種移植片は、単一細胞分解能での追跡を可能にする。ある程度の量のヒト組織は、数百のゼブラフィッシュPDXモデル(zPDX)を生成することができるが、マウスPDXモデル15、16のカップルを生成するだけで十分でありうる。また、2-5 dpfのゼブラフィッシュ幼虫は、すでに肝臓や腎臓などの完全な循環系と代謝器官を開発していますが、免疫系17ではなく、残りの黄身嚢は天然の3D培地であり、薬物スクリーニングに最適です。抵抗試験および腫瘍移動観察6,18,19,20,21.
zPDXを臨床用スクリーニング/検査プラットフォームとして使用する究極の試みとして、ここでは、より少ない細胞を低コストで使用して短時間で生体内候補薬の評価を可能にする膵臓癌のzPDXモデルに対する最適化された提案について説明します。zPDX6,9,10に関する以前の参考文献と比較して、臨床個別診断のためのシステムをより実現可能で信頼性の高い方法にするために、いくつかの最適化を導入しました: 1) 異なる細胞を事前にソートする原発性腫瘍組織のグループとさらなる実験の前に1週間の原発細胞を安定化;2)ヒト細胞を標識し、レンチウイルスベースの遺伝子改変を介して異種移植片における細胞生存率を高める;3)栄養サプリメント(グルコースとグルタミン)と温度の両方でゼブラフィッシュ培養条件を最適化します。4)比較的な方法で異なる細胞タイプの薬物応答を定量化する。また、いくつかの補足材料を追加して注入液に変更を加えました。全体として、これらの改善は、候補薬の応答を評価するための信頼性の高いツールとして使用することができるゼブラフィッシュ宿主において、より患者様の異種移植片を迅速に生成する可能性を提供する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

患者由来腫瘍異種移植片(PDX)および細胞由来腫瘍異種移植片(CDX)は、前臨床評価、投薬指導および基礎癌研究のための重要な技術である。従来の宿主マウスにおけるPDXモデルの世代は時間がかかり、サンプルのごく一部に対してのみ働いています。近年、ゼブラフィッシュPDX(zPDX)は、小規模かつ高効率の特性を持つ独自のホストシステムとして登場しています。ここでは、zPDXモデルにおける比較化学療法評価のための二重蛍光標識腫瘍異種移植片モデルを生成するための最適化された方法論について説明する。腫瘍細胞および線維芽細胞は、異なる培養条件で新たに採取または凍結した膵臓癌組織から濃縮された。両方の細胞基は、緑色または赤色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス、ならびに抗アポトーシス遺伝子BCL2L1によって標識された。トランスフェクトされた細胞を予め混合し、次いで32°Cで修飾されたE3培地で飼育した2dpf幼虫ゼブラフィッシュに共注入した。異種移植片モデルは化学療法薬および/またはBCL2L1阻害剤によって治療され、腫瘍細胞と線維芽細胞の両方の生存率を同時に調べた。要約すると、このプロトコルは、研究者が異種腫瘍微小環境を持つ大量のzPDXモデルを迅速に生成することを可能にし、薬物候補の効率を評価する際に、より長い観察ウィンドウとより正確な定量を提供します。

プロシージャの概略化されたアウトラインを図 1に示します。要するに、原発癌組織細胞は、膵臓癌線維芽細胞阻害剤の添加の有無にかかわらず消化後に完全培地に播種した。癌細胞と線維芽細胞は、線維芽細胞が阻害剤なしで支配した2つの異なる集団として濃縮され、阻害剤の添加後に癌細胞の増殖が優勢であった(図2)?...

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Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

比較薬評価の宿主としてゼブラフィッシュ幼虫を用いた膵臓癌の患者由来異種異種移植片モデル

このプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュを宿主として用いたウイルスベースの二重蛍光標識腫瘍異種移植片モデルにおける最適化手順について説明する。この異種異種異種移植片モデルは、生体内の膵臓癌微小環境の組織組成を模倣し、パーソナライズされたzPDX(ゼブラフィッシュ患者由来異種移植片)モデルにおける薬物応答を評価するためのより正確なツールとして機能する。

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

今日は幼虫ゼブラフィッシュPDXモデルを紹介します。このモデルは、薬物応答を評価するための異種移植片の同様の細胞組成をよりよく模倣し、比較分析による結果の一貫性をさらに向上させることができるため、重要です。この手法には、主に 2 つの利点があります。まず、さまざまな標準的な化学染料を使用して細胞を異なる蛍光に標識し、細胞組成のリアルタイムトレースとアナグラフ段階の能力を可能にします。第二に、それはまた、ゼブラフィッシュのヒト細胞の一般的な生存時間を改善し、その遺伝子改変は、薬物検査のためのより長い観察ウィンドウを提供する。この技術は、膵臓癌患者のためのパーソナライズされた医療のための潜在的なモデルを提供し、また、前臨床腫瘍薬の事前評価のために。この方法はまた、生体内のゼブラフィッシュに異種化された他の腫瘍細胞または全く腫瘍細胞を追跡し、より長い観察時間のために細胞生存率を改善するために使用することができる。注入プレートを調製するには、E3溶液に1%アガロースの50ミリリットル溶液を調製する。アガロースが溶けるまで溶液を沸騰させます。溶液全体を10センチメートルのペトリ皿に注ぎ、ゼブラフィッシュ胚固定金型を表面に置きます。アガロース溶液が完全に固まったら、金型を取り除きます。注射針を準備するには、針の引き手を使用して、0.9ミリメートルの内側の寸法の10センチメートルのガラス毛細血管を2本の針に引き出します。顕微鏡と鉗子を使用して、針の端を切って開口部を作ります。まず、午後7時から9時頃に1~2足の成体ゼブラフィッシュを交配タンクに入れます。翌朝8時に受精卵を採取する。受精卵を40ミリリットルの新鮮なE3溶液を含むペトリ皿に移します。摂氏28.5度でインキュベートします。まず、採取した膵臓癌サンプルをペトリ皿に移す。PBSで組織を5〜6回リンスし、メスを使用して組織を1ミリメートル立方体に切断します。次に、細断された組織を5ミリリットルのHBSSを含む50ミリリットルのチューブに移す。コラゲターゼ4型、ヒアルロジナーゼ、およびDNAseを最終濃度で1つ追加します。よく混ぜるために上下に混合物をピペット。5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで15〜20分間インキュベートします。5分ごとに数回、混合物を上下にピペットします。チューブに7ミリリットルのDMEMを加えます。110倍Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。次いで、上清をデカントし、DMEMで腫瘍混合物を再懸濁する。グループ1とグループ2と名付けられた完全な成長培地の3ミリリットルを含む2つの6センチメートルペトリ皿に混合物をプレートします。5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で両方のグループをインキュベートする。48時間後、膵臓癌線維芽細胞の100x阻害剤をグループ1の培地に加えて、生い茂った線維芽細胞を除去し、癌細胞を主要な細胞タイプとして残す。前の条件を使用してインキュベートを続けます。レンチウイルスを産生した後、感染する細胞を30〜40%の密度の12ウェルプレートに播種する。5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞を一晩培養する。翌日、ポリブレンを含む無血清培地500マイクロリットルの培地を1ミリリットル当たり8マイクログラムの濃度で交換する。5%の二酸化炭素で摂氏37度で4時間インキュベートします。その後、レンチウイルスを100マイクロリットル追加して培地に加え、再び12時間インキュベートする。12時間後、培地を2ミリリットルの完全培地に交換し、さらに36時間インキュベートします。36時間後、蛍光マーカーを確認してください。感染した細胞を収穫し、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終的な濃度で1対1の比率でそれらを混合します。細胞を110倍Gで5分間遠心し、50マイクロリットルの注入溶液で細胞混合物を再懸濁する。ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔した後、それらを注入プレートに移し、改変E3で満たします。混合細胞懸濁液の25マイクロリットルをマイクロキャピラリー針に取り込み、マイクロインジェクションマニピュレータに針を挿入します。注射圧力と時間を設定し、受精後48時間の黄身嚢に50〜80個の細胞を注入します。まず、ゼノグラフト後のゼブラフィッシュの幼虫を摂氏32度で40ミリリットルの混合溶液に移します。ゼノ移植した幼虫を12ウェルプレートの各ウェルに10個入れる。次に、幼虫を4つのグループに分けます。0.1%DMSOを含むE3でコントロールグループを扱い、ゲムシタビンおよび/またはナビトクラックスで他のグループを扱います。すべての幼虫を摂氏32度で2日間インキュベートする。ゼノ移植された幼虫を治療後に麻酔した後、3%メチルセルロースに入れる。蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、幼虫を横視から画像化します。次に、画像Jとグラフパッドソフトウェアを使用して、赤と緑の蛍光信号の強度を定量化します。本研究では、原発癌組織細胞は、膵臓癌線維芽細胞阻害剤の添加の有無にかかわらず消化後に完全な培地に播種される。がん細胞と線維芽細胞は、2つの異なる集団として濃縮される。阻害剤を含まない集団は線維芽細胞によって支配され、癌細胞の増殖は阻害剤の添加後に優勢である。BCL2L1で緑色または赤色の蛍光タンパク質を発現する2つのレンチウイルス包装ベクターが構築されています。ウイルスベースの蛍光標識は、細胞の生存状態を表す。混合癌細胞と線維芽細胞は、受精後48時間でゼブラフィッシュ黄身嚢に注入され、その後、ゲムシタビンおよび/またはナビトクラックスで2日間治療される。ゼノ移植片の異なる集団および細胞組成における細胞の生存率は、薬物治療に対する応答として変化する。異なるタイプの腫瘍を処理する場合、細胞消化時間、薬物治療用量など、異議を唱える必要があるいくつかのステップがあります。この技術は、研究者が標準的なCGXまたはPDSアッセイからゼブラフィッシュを採用するのに役立ちます。これは、細胞の成長と比較することによって進歩バンドを定量化するために、固定比率で異なる細胞の混合および注入を可能にする。個人保護は、特にレンチウイルスを包装する場合に非常に重要です。適宜マスクと手袋を着用し、肌に混ぜないようにしてください。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

黒色腫患者由来異種移植片モデル

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

レプトメニンゲレス病の直接標的療法を研究するマウス・オンマヤ異種移植片モデル

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

患者の薬剤耐性を予測するための「生きた」前臨床プラットフォームとしての患者由来腫瘍エクスプラント

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

ゼブラフィッシュの幼生を潜在的な放射線増感剤またはプロテクターを評価するためのモデルとして

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...