Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 81402582, 상하이 12DZ2295100, 14YF1400600 및 18ZR1404500의 자연 과학 재단에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 절차는 푸단 대학의 동물 윤리위원회의 지침에 따라 승인되고 따라졌으며 모든 췌장암 표본은 푸단 대학 상하이 암 센터에서 얻었습니다. FUSCC 윤리위원회로부터 윤리적 승인을 받았으며, 각 환자로부터 서면 동의를 얻었습니다.
1. 미세 주입을위한 장비 준비
<ol><li>
사출 플레이트를 준비합니다.
	<ol>
<li>E3 용액에 용해된 1% 아가로즈 용액 50 mL 용액을 ?...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

PDX 및 CDX 모델 모두 종양생물학(22)분야에서 중요한 플랫폼이며, 성공적인 종 간 이식의 중요한 단계는 이종이식의 생존을 개선하는 것이다.  최근, 일부 연구는 BCL2L1 (BCL-XL) 또는 BCL2의 과도 발현이 세포 정체성과 운명에 영향을 미치지 않고 마우스 숙주에서 인간 배아 줄기 세포의 생존력을 크게 향상시킬 수 있음을 보여주었다23 , <...

정밀 종양학은 개별 적인 환자를 위한 가장유익한 치료 전략을 찾아내기 위하여 목표 1. 현재, 시험관내 1차 배양, 체외 오르가노이드배양 2, 및 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 수많은 전임상 모델이 유기체 배양 전후의 마우스에서 진단 및 스크리컬/평가전형에 대해 제안되고 있다. 치료 선택3. 면역성 면역성 마우스로 인간 원발성 암세포를 주사하여 생성된 PDX 모델은 임상 종양학에서 맞춤 약물 스크리닝을 위한 가장 유망한 도구 중 하나이며,4. 시험관내 배양된 세포주와는 달리, PDX 모델은 일반적으로 생체 내 종양 환경의 무결성과 이질성을 보존하고, 상이한 종양 환자의 다양성 및 특이성 특성을 더 잘 모방하고, 따라서, 환자의 잠재적 인 의료 결과4. 그러나, 마우스에 있는 PDX 모형의 생성은 다중 단 실험을 위한 충분한 세포 그리고 모형을 집합하기 위하여 고품질 참을성 있는 견본 및 달의 달을 요구하고, 이종이식의 세포/유전 조성은 본래의 그것에서 표류할 수 있습니다 환자의생검. 마우스 PDX 모형을 설치하기위한 성공률은 또한 낮습니다, 임상 사례에서 광범위하게 실행되기 어렵게 만들기. 췌장암 같이 급속하게 진행된 암을 운반하는 환자를 위해, 그(것)들은 PDX 실험에서 시간에 귀중한 정보를 장악하지 못할 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 제브라피쉬는 CDX(세포 유래 종양 이종이식) 모델뿐만 아니라 PDX 모델5,6,7,8,9, 10. 척추 동물로, 제브라피쉬는 유전학과 생리학 모두에서 포유류와 충분한 유사성을 항구, 두 가지 중요한 장점 : 투명성과 크기11작은. Zebrafish는 또한 매우 fecundity, 그리고 근친 유충의 수백 성인의 한 쌍에서 몇 일 이내에 얻을 수 있습니다12. 여러 연구는 암 질환의 형질 전환 및 이종이식 모델을 모두 생성하기 위해 제브라피시를 고용했다13,14. 마우스 이종이식에 비해, 제브라피시 이종이식은 단일 세포 해상도에서 추적을 허용합니다. 일정량의 인간 조직은 수백 개의 제브라피시 PDX 모델(zPDXs)을 생성할 수 있는 반면, 단지 몇 마리의 마우스 PDX모델(15,16)을생성하기에 충분할 수 있다. 게다가, 2-5 dpf에 있는 제브라피시 유충은 이미 간 및 신장과 같은 완전한 순환계 및 신진 대사 기관을 개발하고, 그러나 면역 계통 17은, 나머지 노른자 낭은 자연적인 3D 매체인 동안, 약물 검열, 약 에 이상적 저항성 검사 및종양 이동 관찰 6,18,19,20,21.
임상 사용을 위한 검열/시험 플랫폼으로 zPDX를 사용하는 궁극적인 시도로, 여기에서, 우리는 더 적은 비용으로 더 적은 세포를 사용하여 짧은 시간 안에 생체 내 후보 약물 평가를 허용하는 췌장암의 zPDX 모형을 위한 최적화된 제안을 기술합니다. zPDX 6,9,10에대한 이전 참조와 비교하여, 우리는 임상 개인화 진단을위한 시스템을 보다 실현 가능하고 신뢰할 수 있도록 몇 가지 최적화를 도입했습니다 : 1) 다른 세포를 미리 분류 1 차적인 종양 조직에 있는 단 및 추가 실험의 앞에 1 주일 세포를 위한 안정화; 2) 인간 세포를 표지하고 렌티바이러스 기반 의 유전자 변형을 통해 이종이식에서 세포 생존능력을 향상시키는 단계; 3) 영양 보충제 (포도당 및 글루타민) 및 온도 모두에서 제브라피시 배양 상태를 최적화; 4) 비교 방식으로 상이한 세포 유형의 약물 반응을 정량화한다. 우리는 또한 몇 가지 보충 재료를 추가하여 사출 용액을 변경했습니다. 전부, 그 개선은 후보 약물의 반응을 평가하기 위하여 믿을 수 있는 공구로 이용될 수 있는 zebrafish 호스트에 있는 더 참을성 있는 이종이식을 빨리 생성하는 가능성을 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

환자 유래 종양 이종이식(PDX) 및 세포 유래 종양 이종이식(CDX)은 전임상 평가, 약물 지도 및 기초 암 연구를 위한 중요한 기술입니다. 전통적인 호스트 마우스에 있는 PDX 모형의 세대는 시간 소모적이고 견본의 작은 비율을 위해서만 작동합니다. 최근에는 제브라피쉬 PDX(zPDX)가 소규모 및 고효율의 특성을 가진 독특한 숙주 시스템으로 부상하고 있다. 여기서, 우리는 zPDX 모델에서 비교 화학요법 평가를 위한 이중 형광 표지종양 이종이식 모델을 생성하기 위한 최적화된 방법론을 기술한다. 종양 세포 및 섬유아세포는 상이한 배양 조건에서 갓 수확되거나 냉동된 췌장암 조직으로부터 농축되었다. 두 세포 군 모두 녹색 또는 적색 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스뿐만 아니라 항세포자멸 유전자 BCL2L1에의해 표지되었다. 형질감염된 세포를 미리 혼합하고 32°C에서 변형된 E3 배지에서 사육한 2dpf 애벌레 제브라피시내로 공동 주입하였다. 이종이식 모델은 화학요법 약물 및/또는 BCL2L1 억제제에 의해 처리되었고, 종양 세포와 섬유아세포의 부동체를 동시에 조사하였다. 요약하면, 이 프로토콜은 연구원이 이기종 종양 미세 환경을 가진 다량의 zPDX 모델을 신속하게 생성할 수 있게 하고 약물 후보의 효율성을 평가하는 데 있어 더 긴 관찰 창과 보다 정확한 정량을 제공한다.

프로시저의 스키마 윤곽은 그림 1에표시됩니다. 요컨대, 원발성 암 조직 세포는 췌장암 섬유아세포 억제제의 첨가 유무에 관계없이 소화 후 완전한 배지내로 파종하였다. 암세포와 섬유아세포는 억제제 없이 섬유아세포가 지배하는 2개의 뚜렷한 집단으로서 농축되었고, 암세포성장은 억제제첨가 후 우세하였다(도 2). 2개의 렌?...

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Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment (Video) | JoVE

비교 약물 평가를 위한 호스트로 Zebrafish 애벌레를 사용하여 췌장암의 환자 유래 이종 이종이식 모형

이 프로토콜은 애벌레 얼룩말어를 숙주로서 사용하여 바이러스 기반 이중 형광 표지 종양 이종이식 모델에서 최적화 절차를 설명합니다. 이 이기종 이종이식 모델은 생체 내 췌장암 미세환경의 조직 조성을 모방하고 맞춤형 zPDX(제브라피쉬 환자 유래 이종이식) 모델에서 약물 반응을 평가하기 위한 보다 정밀한 도구역할을 한다.

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

오늘은 유충 제브라피쉬 PDX 모델을 소개할 예정입니다. 이 모델은 약물 반응을 평가하기 위해 xenograft에서 유사한 세포 조성을 더 잘 모방할 수 있고 또한 우리의 비교 분석을 가진 결과의 일관성을 더 향상하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점이 있습니다.첫째, 다양한 표준 화학 염료를 사용하여 세포를 다른 형광으로 라벨링하여 세포 조성물의 실시간 추적과 분석 단계의 능력을 허용합니다. 둘째, 그것은 또한 제브라피시에 있는 인간 세포의 일반적인 생존 시간을 향상합니다, 그들의 유전자 수정, 약 시험을 위한 더 긴 관측 창을 제공합니다. 이 기술은 췌장암을 가진 환자를 위한 개인화한 약및 또한 전임상 종양 약의 사전 평가를 위한 잠재적인 모형을 제공합니다.이 방법은 또한 생체 내의 제브라피시에 이식된 다른 종양 세포 또는 종양 세포 이종이없는 세포를 추적하고 더 긴 관찰 시간 동안 세포 생존을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 사출 플레이트를 준비하려면 E3 용액으로 1%의 아가로즈 50밀리리터 용액을 준비하십시오. 아가로즈가 녹을 때까지 용액을 끓입니다.전체 용액을 10센티미터 페트리 접시에 붓고 Zebrafish 배아 고정 금형을 표면에 놓습니다. 아가로즈 용액이 완전히 고화되면 금형을 제거합니다. 주사 바늘을 준비하려면 바늘 풀러를 사용하여 10센티미터 유리 모세관을 내치인 0.9 밀리미터를 두 개의 바늘로 당깁니다.현미경과 집게를 사용하여 바늘끝을 잘라 개구부를 만듭니다. 첫째, 성인 제브라피쉬 를 7~9시 경에 짝짓기 탱크에 1-2쌍의 성인 제브라피시를 넣습니다. 다음날 아침 8시에 수정란을 채취합니다. 수정란을 신선한 E3 용액 40밀리리터가 들어있는 페트리 접시에 옮기다.섭씨 28.5도에서 배양하십시오. 먼저 수집된 췌장암 샘플을 페트리 접시에 옮기다. PBS로 조직을 5~6번 헹구고 메스를 사용하여 조직을 1밀리미터 큐브 조각으로 자른다.다음으로, 파쇄된 조직을 5밀리리터의 HBSS를 포함하는 50 밀리리터 튜브로 옮기. 여기에 표시된 최종 농도에서 콜라게나아제 4형, 히알루로디나아제, DNAse를 추가합니다. 혼합물을 위아래로 피펫하여 잘 섞습니다.15~20분 동안 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도의 감양으로 혼합물을 배양합니다. 혼합물을 5분마다 몇 번 위아래로 피펫합니다. 튜브에 DMEM의 7 밀리리터를 추가합니다.원심분리기는 G 110회, 섭씨 4도에서 5분간. 이어서, 상체를 감소시키고 DMEM에서 종양 혼합물을 다시 중단한다. 혼합물을 그룹 1과 그룹 2라는 이름의 전체 성장 미디어의 3 밀리리터를 포함하는 두 개의 6센티미터 페트리 접시에 접시를 접시.이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 두 그룹을 배양합니다. 48 시간 후에, 췌장암 섬유아세포의 100x 억제제를 그룹 1의 배지에 추가하여 자란 섬유아세포를 제거하고 암세포를 주요 세포 유형으로 남깁니다. 이전 조건을 사용하여 계속 인큐베이팅을 계속합니다.렌티바이러스를 제조한 후, 세포를 30 내지 40% 밀도로 12웰 플레이트에 감염시종하였다. 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음 날, 밀리리터 당 8 마이크로 그램의 농도에서 폴리 브레인을 포함하는 혈청없는 매체의 500 마이크로 리터로 배지를 교체하십시오.섭씨 37도에서 4시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그런 다음, 렌즈바이러스의 100 마이크로리터를 배지에 추가하고 12시간 동안 다시 배양한다. 12시간 후, 배지를 완전한 중간 크기의 2밀리리터로 교체하고 36시간 동안 인큐베이션을 추가로 사용할 수 있습니다.36시간 후에형광 마커를 확인하십시오. 감염된 세포를 수확하고 밀리리터 당 백만 세포의 최종 농도와 일대일 비율로 혼합. 원심 분리는 5 분 동안 110 배 G에서 세포를 원심 분리하고 주입 용액의 50 마이크로 리터에서 세포 혼합물을 다시 중단합니다.Zebrafish 애벌레를 마취한 후, 이를 수정된 E3로 채워진 주사판으로 옮기습니다. 혼합 세포 현탁액의 25 마이크로리터를 마이크로모세피 바늘에 넣고 바늘을 미세 주입 조작기에 삽입하십시오. 사출 압력과 시간을 설정하고 48 시간 후 수정 얼룩말 피시의 노른자 낭에 50 ~ 80 세포를 주입한다. 먼저, 제노이식 후 Zebrafish 애벌레를 섭씨 32도에서 40밀리리터의 혼합 용액으로 옮기습니다.12웰 접시의 각 우물에 10개의 광이식 애벌레를 놓습니다. 다음으로 애벌레를 4개의 그룹으로 나눕니다. 대조군을 0.1%DMSO가 함유한 E3로 처리하고 다른 그룹을 젬시타빈 및/또는 Navitoclax로 처리합니다.모든 애벌레를 섭씨 32도에서 이틀 동안 배양합니다. 제노이식 애벌레를 치료 후 마취한 후 3%의 메틸 셀룰로오스에 넣습니다. 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 측면 보기에서 애벌레를 이미지시하십시오.그런 다음 이미지 J 및 그래프 패드 소프트웨어를 사용하여 빨간색 및 녹색 형광 신호의 강도를 정량화합니다. 이 연구에서, 1 차암 조직 세포는 췌장암 섬유아세포 억제제의 추가 없이 소화 후 완전한 배지로 종자된다. 암세포와 섬유아세포는 2개의 명백한 인구로 풍부하게 됩니다.억제제가 없는 인구는 섬유아세포에 의해 지배되고 암세포 성장은 억제제를 첨가한 후에 우세합니다. BCL2L1에서 녹색 또는 빨간색 형광 단백질을 표현하는 두 개의 렌즈피바이러스 포장 벡터가 생성됩니다. 바이러스 기반 형광 라벨링은 세포의 생존 상태를 나타냅니다.혼합 암세포와 섬유아세포는 수정 후 48시간 후에 Zebrafish 노른자 낭에 주입된 다음 젬시타빈 및/또는 Navitoclax로 2일 동안 치료됩니다. 제노이식의 상이한 인구 및 세포 조성에 있는 세포 vi책임은 약물 처리에 대한 응답으로 변경됩니다. 종양의 다른 모형을 처리할 때, 세포 소화 시간, 약 처리 복용량 등을 포함하여 반대될 필요가 있을 지도 모르다 몇몇 단계가 있습니다.이 기술은 연구원이 표준 CGX 또는 PDS 분석에서 Zebrafish를 사용하는 데 도움이됩니다. 그것은 세포 성장에 그들을 비교하여 진행 대역을 정량화 고정 된 비율로 다른 세포의 혼합 및 주입을 허용합니다. 개인 보호는 특히 렌티 바이러스를 포장 할 때 큰 의미가 있습니다.적절한 경우 마스크와 장갑을 착용하고 피부에 섞이지 않도록 노력하십시오.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies (Video) | JoVE

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

연구

암 연구학

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model (Video) | JoVE

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells (Video) | JoVE

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines (Video) | JoVE

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models (Video) | JoVE

환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform (Video) | JoVE

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish (Video) | JoVE

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease (Video) | JoVE

렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients (Video) | JoVE

환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis (Video) | JoVE

중추신경계 전이의 환자 유래 이종이식 모델의 확립 및 활용

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...