Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina 81402582, Natural Science Foundation i Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 og 18ZR1404500

Alle dyr prosedyrer ble godkjent og fulgt retningslinjene i Animal etikk Committee ved Fudan University og alle kreft i bukspyttkjertelen ble innhentet fra Fudan University Shanghai Cancer Center. Etisk godkjenning ble innhentet fra FUSCC etikk komité, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
1. klargjøre utstyret for Microinjection
<ol><li>
Klargjøring av injeksjons platen.
	<ol>
<li>Forbered en 50 mL oppløsning på 1% agarose oppløst i E3-løsni...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

Både PDX og CDX-modeller er viktige plattformer innen tumor biologi22, og det kritiske trinnet i en vellykket Inter-arter transplantasjon er å forbedre overlevelsen av xenograft.  Nylig har noen studier vist at forbigående uttrykk for BCL2L1 (BCL-XL) eller BCL2 kan betydelig forbedre levedyktigheten til menneskelige embryonale stamceller i mus verter uten å påvirke cellen identiteter og skjebne23 , 24 prise...

Precision onkologi tar sikte på å finne de mest fordelaktige terapeutiske strategier for individuell pasient1. For tiden er tallrike prekliniske modeller som in vitro primær kultur, in vitro organoid Culture2, og pasient-avledet XENOTRANSPLANTATER (PDX) i mus før eller etter organoid kultur foreslått for diagnostisering og til skjerm/vurdere potensialet terapeutiske valg3. PDX modell generert av injeksjon av menneskelige primær kreftceller i uimottakelig-kompromittert mus, er en av de mest lovende verktøy for personlig narkotika screening i klinisk onkologi3,4. I motsetning til den kultivert cellelinjen in vitro, beholder PDX-modellene vanligvis integriteten og heterogenitet i in vivo tumor miljø, bedre etterligne mangfoldet og idiosynkratiske karakteristikker av ulike tumor pasienter, og derfor kan forutsi potensielle medisinske utfallet av pasientene4. Generering av PDX-modeller i mus krever imidlertid høykvalitets pasientprøver og måneders tid for å samle inn tilstrekkelige celler og modeller for eksperimenter med flere grupper, og de cellulære/genetiske komposisjoner av xenograft kan drive fra de opprinnelige pasientensbiopsi. Suksessraten for å etablere mus PDX-modellen er også lav, noe som gjør det vanskelig å bli bredt implementert i klinisk praksis. For pasientene som har raskt utviklet kreft som kreft i bukspyttkjertelen, kan de ikke være i stand til å innhente verdifull informasjon fra PDX-eksperimentene i tide.
I de siste årene, sebrafisk har blitt rapportert å være potensielle verter for ikke bare CDX (Cell-avledet tumor xenograft) modeller, men også PDX modeller5,6,7,8,9, 10. som en virveldyr modell dyr, sebrafisk havner tilstrekkelige likheter med pattedyr i både genetikk og fysiologi, med to vesentlige fordeler: åpenhet og små i størrelse11. Sebrafisk er også svært fekunditet, og hundrevis av innavlet larver kan fås i løpet av få dager fra et enkelt par voksne12. Flere studier har ansatt sebrafisk å generere både transgene og xenograft modeller av kreft sykdommer13,14. Sammenlignet med mus xenotransplantater, sebrafisk xenotransplantater tillate sporing på én celle oppløsning. En viss mengde menneskelig vev er i stand til å generere hundrevis av sebrafisk PDX modeller (zPDXs), mens kan bare være tilstrekkelig til å generere et par mus PDX modeller15,16. Dessuten, sebrafisk larver på 2-5 DPF allerede utvikle komplette sirkulasjonssystemer og metabolske organer som lever og nyre, men ikke immunsystemet17, mens de resterende eggeplomme SAC er en naturlig 3D medium, ideell for narkotika screening, narkotika motstands tester og tumor migrasjon observasjoner6,18, 19,20,21.
Med et ultimate forsøk på å bruke zPDX som en plattform for screening/testing for klinisk bruk, her beskriver vi en optimalisert forslag til zPDX modell av kreft i bukspyttkjertelen, som gjør at in vivo kandidat narkotika vurdering i løpet av kort tid bruker færre celler til lavere kostnader. Sammenlignet med tidligere referanser om zPDX6,9,10, introduserte vi flere optimaliseringer for å gjøre systemet mer gjennomførbart og pålitelig for klinisk personlig diagnose: 1) forhånds sortering av annen celle grupper i den primære tumor vev og stabilisere primær celler i en uke før videre eksperimenter; 2) merking av humane celler og forbedre celle levedyktigheten i xenograft via lentivirus-basert genetisk modifisering; 3) optimalisere sebrafisk kultur tilstand i både nutriment kosttilskudd (glukose og glutamin) og temperatur; 4) kvantifisere stoffet responser av forskjellige celletyper i en komparativ måte. Vi har også gjort endringer i injeksjons løsningen ved å legge til flere supplerende materialer. Til sammen gir disse forbedringene muligheten til raskt å generere en mer tålmodig-lignende xenograft i sebrafisk verter som kan brukes som et pålitelig verktøy for å vurdere responsen fra kandidat stoffene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

Pasient-avledet tumor xenograft (PDX) og celle-avledet tumor xenograft (CDX) er viktige teknikker for prekliniske vurdering, medisinering veiledning og grunnleggende kreftforskning. Generasjoner av PDX-modeller i tradisjonelle verts mus er tidkrevende og fungerer bare for en liten andel av prøvene. Nylig har sebrafisk PDX (zPDX) dukket opp som et unikt vertssystem, med egenskapene til småskala og høy effektivitet. Her beskriver vi en optimalisert metodikk for å generere en dobbel fluorescens-merket tumor xenograft modell for sammenlignende kjemoterapi vurdering i zPDX modeller. Tumor celler og fibroblaster ble beriket av fersk høstet eller frossen kreft i bukspyttkjertelen ved ulike kultur forhold. Begge celle gruppene ble merket med lentivirus som uttrykte grønne eller røde fluorescerende proteiner, samt et anti-apoptose gen BCL2L1. De transfekterte cellene var pre-blandet og co-injisert i 2 DPF larvestadiet sebrafisk som ble så avlet i modifisert E3 medium ved 32 ° c. De xenograft modellene ble behandlet av kjemoterapi narkotika og/eller BCL2L1 inhibitor, og viabilities av både tumorceller og fibroblaster ble undersøkt samtidig. Oppsummert tillater denne protokollen forskerne å raskt generere en stor mengde zPDX modeller med en heterogen tumor mikromiljøet og gir en lengre observasjon vindu og en mer presis kvantifisering i vurderingen effektiviteten av stoffet kandidater.

En Schematized omriss av prosedyren er representert i figur 1. Kort sagt, den primære kreft vev celler ble sådd i hele medium etter fordøyelsen med eller uten tilsetning av bukspyttkjertelkreft Fibroblast hemmere. Kreftceller og fibroblaster ble beriket som to distinkte populasjoner som fibroblaster dominert uten hemmere, og kreftcelle vekst seiret etter tilsetning av hemmere (figur 2). To lentiviral emballasje vektorer ble ko...

Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Pasient-avledet heterogen Xenograft modell av bukspyttkjertelen Cancer bruke sebrafisk larver som verter for sammenlignende Drug Assessment

Denne protokollen beskriver optimaliserings prosedyrer i en virus BAS ert dual fluorescens-merket tumor xenograft modell ved hjelp av larvestadiet sebrafisk som verter. Denne heterogene xenograft modellen etterligner vev sammensetningen av bukspyttkjertelkreft mikromiljøet in vivo og fungerer som et mer presist verktøy for å vurdere narkotika responser i personlig zPDX (sebrafisk pasient-avledet xenograft) modeller.

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

I dag skal vi introdusere en larver Zebrafish PDX Model. Denne modellen er betydelig fordi de bedre kan etterligne en lignende cellulær sammensetning i xenograft for å vurdere legemiddelresponser og forbedrer også konsistensen av resultatene ytterligere med vår komparative analyse. Det er to hovedfordeler med denne teknikken.For det første bruker vi ulike standard kjemiske fargestoffer til å merke celler i forskjellig fluorescens, slik at sanntidssporing av cellulære sammensetninger og evnen til anagraffasen. For det andre forbedrer det også den generelle overlevelsestiden til menneskelige celler i sebrafisk, deres genetiske modifikasjon, som gir et lengre observasjonsvindu for narkotikatesting. Denne teknikken gir en potensiell modell for personlig medisin for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og også for pre-vurdering av preklinisk tumormedisin.Denne metoden kan også brukes til å spore andre tumorceller eller ingen tumorcelle xenografted i sebrafisk in vivo og for å forbedre celleoverlevelse for lengre observasjonstid. For å forberede injeksjonsplaten, lag en 50 milliliter løsning på 1% agarose i E3-oppløsning. Kok løsningen til agarose oppløses.Hell hele løsningen i en 10 centimeter petriskål og plasser deretter Zebrafish embryofikseringsformen på overflaten. Når agaroseløsningen stivner helt, fjern formen. For å forberede injeksjonsnåler, bruk en nåletrekker til å trekke en 10 centimeter glasskapillær med en indre dimensjon på 0,9 millimeter i to nåler.Bruk et mikroskop og tang, kutt enden av nålen for å skape en åpning. Først plasserer du ett til to par voksen sebrafisk i en paringstank rundt klokken 17 til 20.00. Klokken åtte neste morgen samler du de befruktede eggene. Overfør de befruktede eggene til en petriskål som inneholder 40 milliliter frisk E3-løsning.Inkuber på 28,5 grader Celsius. Først overfører du den innsamlede kreftprøven i bukspyttkjertelen til en petriskål. Skyll vevet fem til seks ganger med PBS og bruk en skalpell til å kutte vevet i en millimeter cubed stykker.Deretter overfører du det strimlede vevet til et 50 milliliter rør som inneholder fem milliliter HBSS. Legg collagenase type fire, hyalurodinase, og DNAse en på de endelige konsentrasjonene vist her. Pipette blandingen opp og ned for å blande godt.Inkuber blandingen ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidinkubator i 15 til 20 minutter. Pipette blandingen opp og ned et par ganger hvert femte minutt. Tilsett syv milliliter DMEM til røret.Sentrifuge ved 110 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Deretter dekanterer du overnaturanten og re-suspenderer tumorblandingen i DMEM. Plate blandingen i to seks centimeter Petri retter som inneholder tre milliliter full vekst media navngitt gruppe en og gruppe to.Inkuber begge gruppene ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidinkubator. Etter 48 timer, legg til 100x hemmer av kreftfibroblaster i mediet i gruppe en for å fjerne de overgrodde fibroblastene, og etterlater kreftcellene som de viktigste celletypene. Fortsett å inkubere ved hjelp av de tidligere forholdene.Etter å ha produsert lentiviruset, frø cellene som skal bli smittet inn i en 12-brønns plate med 30 til 40% tetthet. Kultur cellene over natten på 37 grader Celsius i en 5% karbondioksid inkubator. Neste dag erstatter du mediet med 500 mikroliter serumfritt medium som inneholder polybryn i en konsentrasjon på åtte mikrogram per milliliter.Inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i fire timer. Deretter legger du til ytterligere 100 mikroliter av lentiviruset til mediet og inkuberer igjen i 12 timer. Etter 12 timer, erstatt mediet med to milliliter komplett medium og inkuber i ytterligere 36 timer.Etter 36 timer, sjekk fluorescensmarkørene. Høst de infiserte cellene og bland dem i et en-til-en-forhold med en endelig konsentrasjon på en million celler per milliliter. Sentrifuger cellene ved 110 ganger G i fem minutter og re-suspendere celleblandingen i 50 mikroliter injeksjonsvæske.Etter å ha bedøvet Sebrafisk larver, overføre dem til injeksjonsplaten, som er fylt med modifisert E3. Ta opp 25 mikroliter av den blandede celleopphengen inn i mikrokapillæreålen og sett nålen inn i mikroinjeksjonsmanipulatoren. Sett injeksjonstrykket og tiden og injiser 50 til 80 celler i eggeplommeseken på 48 timer etter befruktning Sebrafisk. Først overfører du de post-zenografted Sebrafisk larver til 40 milliliter mix løsning ved 32 grader Celsius.Plasser 10 zenografted larver i hver brønn av en 12-brønns plate. Deretter deler larvene i fire grupper. Behandle kontrollgruppen med E3 som inneholder 0,1 %DMSO og behandle de andre gruppene med Gemcitabin og/eller Navitoclax.Inkuber alle larver ved 32 grader Celsius i to dager. Etter å ha bedøvet zenografted larver etter behandling, plasser dem i 3% metylcellulose. Bruk et fluorescens eller konfokal mikroskop for å bilde larver fra sidevisningen.Deretter bruker du bilde J og graf pad programvare for å kvantifisere intensiteten av røde og grønne fluorescens signaler. I denne studien seedes primære kreftvevsceller inn i komplett medium etter fordøyelsen med eller uten tilsetning av kreftfibroblaster i bukspyttkjertelen. Kreftceller og fibroblaster er beriket som to forskjellige populasjoner.Befolkningen uten inhibitorer domineres av fibroblaster mens kreftcellevekst råder etter tilsetning av inhibitorer. To lentiviral emballasje vektorer er konstruert som uttrykker grønne eller røde fluorescerende proteiner i BCL2L1. Den virusbaserte fluorescensmerkingen representerer cellenes overlevelsesstatus.De blandede kreftcellene og fibroblastene injiseres i sebrafiskeeplommesekten ved 48 timer etter befruktning og behandles deretter med Gemcitabin og/eller Navitoclax i to dager. Cellefevnene i ulike populasjoner og cellulær sammensetning av zenograften endres etter hvert som responsen på legemiddelbehandlingen. Ved behandling av ulike typer svulster, det er flere trinn som må protesteres, inkludert celle fordøyelsetid, narkotikabehandling dosering, og så videre.Denne teknikken hjelper forskere til å bruke Sebrafisk fra en standard CGX- eller PDS-analyse. Det gjør det mulig for blanding og injeksjon av forskjellige celler ved faste forhold for å kvantifisere fremdriftsbåndene ved å sammenligne dem med cellevekst. Personlig beskyttelse er av stor betydning, spesielt når du pakker lentivirus.Bruk masker og hansker når det passer og prøv å ikke blande på huden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utvikling og vedlikehold av en Preklinisk Pasient Avledet Tumor Xenotransplantat Modell for Undersøkelse av Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

En melanom pasient-avledet Xenograft modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering av pasient-avledet bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

En Murine Ommaya Xenograft-modell for å studere direkte målrettet terapi av leptomeningeal sykdom

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Pasientavledede tumor utviser som en "levende" preklinisk plattform for å forutsi legemiddelresistens hos pasienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Etablering og utnyttelse av pasientavledede xenograftmodeller av metastaser i sentralnervesystemet

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Sebrafisk larver som en modell for å evaluere potensielle radiosensibilisatorer eller beskyttere

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...