Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая 81402582, Фондом естественных наук Шанхая 12D-2295100, 14YF1400600 и 18'1404500

Все процедуры животных были одобрены и следовали руководящим принципам Комитета по этике животных в Университете Фудан, и все образцы рака поджелудочной железы были получены из Фуданского университета Шанхайского онкологического центра. Этические утверждения были получены от комит?...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

Оба модели PDX и CDX являются жизненно важными платформами в области биологии опухоли22, и критический шаг успешной межвидовой трансплантации является улучшение выживания ксенотрансплантата.  Недавно некоторые исследования показали, что переходное выражение BCL2L1 (BCL-XL...

Точность онкологии стремится найти наиболее полезные терапевтические стратегии для отдельных пациентов1. В настоящее время, многочисленные доклинические модели, такие как в пробирке первичной культуры, в пробирке органоидной культуры2, и пациента полученных ксенотрансплантатов (PDX) у мышей до или после органоидной культуры предлагаются для диагностики и для проверки / оценки потенциала терапевтический выбор3. Модель PDX, генерируемая инъекцией первичных раковых клеток человека в иммунных мышей, является одним из наиболее перспективных инструментов для персонализированного скрининга наркотиков в клинической онкологии3,4. В отличие от культивируемой клеточной линии in vitro, модели PDX обычно сохраняют целостность и неоднородность опухолевой среды in vivo, лучше имитируя разнообразие и особенности различных опухолевых пациентов, и, следовательно, могут предсказать потенциальный медицинский исход пациентов4. Тем не менее, генерация моделей PDX у мышей требует высококачественных образцов пациентов и месяцев времени, чтобы собрать достаточное количество клеток и моделей для многогрупповых экспериментов, а клеточные/генетические композиции ксенотранспланта могут дрейфовать от исходных биопсии пациента. Уровень успеха для создания мышей PDX модель также низка, что затрудняет широкое внедрение в клинической практике. Для пациентов, перевозящих быстро прогрессирует рака, как рак поджелудочной железы, они не могут быть в состоянии получить ценную информацию из PDX экспериментов во времени.
В последние несколько лет, зебрафиш, как сообщается, потенциальные хозяева не только CDX (клеточная опухоль xenograft) модели, но и МОДЕЛИ PDX5,6,7,8,9, 10. Как позвоночных модели животных, зебра гавани достаточно общего с млекопитающими в генетике и физиологии, с двумя значительными преимуществами: прозрачность и небольшой размер11. Зебрафиш также очень плодовитость, и сотни инбредных личинок могут быть получены в течение нескольких дней из одной пары взрослых12. Несколько исследований использовали зебры для создания трансгенных и ксенотрансплантата модели онкологических заболеваний13,14. По сравнению с мышами ксенотрансплантатов, зебрафиш ксенотрансплантатов позволяют отслеживать в одном разрешении клеток. Определенное количество человеческих тканей способен генерировать сотни моделей зебры PDX (zPDXs), в то время как может быть достаточно только для создания нескольких мышей PDX модели15,16. Кроме того, личинки зебры при 2-5 dpf уже развивают сядочечные системы кровообращения и метаболические органы, такие как печень и почки, но не иммунная система17, в то время как оставшийся желтковый мешок является естественной 3D-средой, идеально подходит для скрининга наркотиков, наркотиков тесты на устойчивостьи наблюдения миграции опухоли 6,18,19,20,21.
С конечной попыткой использовать zPDX в качестве скрининга / тестирования платформы для клинического использования, здесь, мы описываем оптимизированное предложение для zPDX модель рака поджелудочной железы, которая позволяет in vivo кандидат оценки наркотиков в течение короткого времени, используя меньше клеток при меньших затратах. По сравнению с предыдущими ссылками о zPDX6,9,10, мы ввели несколько оптимизаций, чтобы сделать систему более осуществимой и надежной для клинической персонализированной диагностики: 1) предварительной сортировки различных клеток группы в первичных опухолевых тканях и стабилизация первичных клеток в течение одной недели до дальнейших экспериментов; 2) маркировка клеток человека и повышение жизнеспособности клеток в ксенотрансплантате с помощью лентивирусной генетической модификации; 3) оптимизация состояния культуры зебры как в пищевых добавках (глюкоза и глутамин) и температуре; 4) количественная оценка лекарственных реакций различных типов клеток в сравнительной манере. Мы также внесли изменения в инъекционное решение, добавив несколько дополнительных материалов. В целом, эти улучшения дают возможность быстро генерировать более терпеливый ксенотрансвант в хостах зебры, которые могут быть использованы в качестве надежного инструмента для оценки реакции кандидатов наркотиков.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

Пациент полученных опухоли ксенотрансплантат (PDX) и клеточной опухоли ксенотрансплантата (CDX) являются важными методами для доклинической оценки, лекарства руководства и основных исследований рака. Поколения моделей PDX у традиционных мышей-хозяев отнимают много времени и работают только на небольшую часть образцов. В последнее время зебрафиш PDX (zPDX) стала уникальной системой хоста, с характеристиками мелкомасштабной и высокой эффективности. Здесь мы описываем оптимизированную методологию для создания двойной модели ксенотранспланта опухоли с двойной флуоресценцией для сравнительной химиотерапии в моделях zPDX. Опухолевые клетки и фибробласты обогащались из свежесобранной или замороженной ткани рака поджелудочной железы в различных условиях культуры. Обе группы клеток были помечены лентивирусом, выражающим зеленые или красные флуоресцентные белки, а также антиапоптозным геном BCL2L1. Трансинфицированные клетки были предварительно смешаны и совместно введены в 2 dpf личильных зебры, которые затем были выведены в модифицированной среде E3 при 32 градусах Цельсия. Модели ксенотрансплантата лечились химиотерапевтическими препаратами и/или ингибитором BCL2L1, и одновременно исследовались возможности как опухолевых клеток, так и фибробластов. Таким образом, этот протокол позволяет исследователям быстро генерировать большое количество моделей zPDX с разнородной микросредой опухоли и обеспечивает более длинное окно наблюдения и более точную количественную оценку в оценке эффективности кандидатов на наркотики.

Схематизированный контур процедуры представлен на рисунке 1. Короче говоря, первичные клетки раковой ткани были посеяны в полной среде после пищеварения с или без добавления ингибиторов фибробластов рака поджелудочной железы. Раковые клетки и фиброб?...

Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Пациент полученных гетерогенных Xenograft Модель рака поджелудочной железы использованием черыщения зебрав в качестве хозяев для сравнительной оценки наркотиков

Этот протокол описывает процедуры оптимизации в вирусной двойной флуоресценции помечены опухоли ксенотрансплантат модели с использованием личиночных зебр в качестве хостов. Эта неоднородная модель ксенотрансплантата имитирует состав тканей микроокружения рака поджелудочной железы in vivo и служит более точным инструментом для оценки лекарственных реакций в персонализированных моделях zPDX (зебрафиш пациента, полученных ксенотрансплантатом).

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Сегодня мы собираемся представить личинки Зебрафиш PDX модели. Эта модель имеет важное значение, поскольку они могут лучше имитировать аналогичный клеточный состав в ксенотрансплантате для оценки реакции препарата, а также еще больше улучшает консистенцию результатов с помощью нашего сравнительного анализа. Есть два основных преимущества этой техники.Во-первых, мы используем различные стандартные химические красители для обозначения клеток в различные флуоресценции, что позволяет в режиме реального времени отслеживания клеточных композиций и способность фазы анаграфа. Во-вторых, это также улучшает общее время выживания клеток человека в зебрафиш, их генетическая модификация, которая обеспечивает более длинное окно наблюдения для тестирования на наркотики. Этот метод обеспечивает потенциальную модель персонализированной медицины для пациентов с раком поджелудочной железы, а также для предварительной оценки доклинического препарата опухоли.Этот метод также может быть использован для отслеживания других опухолевых клеток или нет опухолевых клеток, ксенотрансплантированных в зебрафиш in vivo и улучшить выживание клеток в течение более длительного времени наблюдения. Для приготовления инъекционной пластины приготовьте 50 миллилитровый раствор 1%agarose в растворе E3. Отварить раствор до тех пор, пока агароза не растворится.Налейте весь раствор в 10-сантиметровую чашку Петри, а затем поместите форму фиксации эмбриона Зебрафиш на поверхность. Когда раствор агарозы полностью затвердевает, удалите форму. Для подготовки иглы для инъекций используйте иглу для вытягивать 10-сантиметровую стеклянную капиллярную капиллярную часть с внутренним измерением 0,9 миллиметра на две иглы.Используя микроскоп и типсы, вырежьте конец иглы, чтобы создать отверстие. Во-первых, поместите одну-две пары взрослых зебры в брачный резервуар около семи-девяти вечера. На следующее утро в восемь утра собирайте оплодотворенные яйцеклетки. Перенесите оплодотворенные яйца в чашку Петри, содержащую 40 миллилитров свежего раствора Е3.Инкубация при 28,5 градусах по Цельсию. Во-первых, передать собранный образец рака поджелудочной железы в чашку Петри. Промыть ткани пять-шесть раз с PBS и использовать скальпель, чтобы сократить ткани на один миллиметр кубированных частей.Затем перенесите измельченную ткань в 50-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров HBSS. Добавьте коллагеназу типа 4, гиалуродиразу и ДНК-1 в окончательных концентрациях, показанных здесь. Pipette смесь вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать.Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода в течение 15-20 минут. Pipette смесь вверх и вниз несколько раз каждые пять минут. Добавьте в трубку семь миллилитров DMEM.Центрифуга при 110 градусах G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем, декант supernatant и повторно приостановить опухолевой смеси в DMEM. Плита смесь в два шести сантиметра Петри блюда, содержащие три миллилитров полного роста средств массовой информации имени группы 1 и второй группы.Инкубировать обе группы при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода 5%. После 48 часов, добавить 100x ингибитор рака поджелудочной железы фибробластов в среде группы 1, чтобы удалить заросшие фибробласты, в результате чего раковые клетки в качестве основных типов клеток. Продолжить инкубацию с использованием предыдущих условий.После производства лентивируса, семена клеток, которые будут инфицированы в 12-хорошо пластины с 30 до 40% плотности. Культура клетки ночь на 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа инкубатора. На следующий день замените среду 500 микролитров среды, свободной от сыворотки, содержащей полибрен при концентрации в восемь микрограмм на миллилитр.Инкубационный при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение четырех часов. Затем добавьте в среду еще 100 микролитров лентивируса и снова инкубировать в течение 12 часов. Через 12 часов замените носитель двумя миллилитровами полной среды и инкубировать еще на 36 часов.Через 36 часов проверьте маркеры флуоресценции. Урожай инфицированных клеток и смешать их в соотношении один к одному с окончательной концентрацией одного миллиона клеток на миллилитр. Центрифуга клетки в 110 раз G в течение пяти минут и повторно приостановить клеточной смеси в 50 микролитров инъекционного раствора.После анестезии личинок зебры, перенесите их в инъекционной пластине, которая заполнена модифицированным E3. Возьмите 25 микролитров подвески смешанных клеток в микрокапильярной иглы и вставьте иглу в манипулятор микроинъекции. Установите давление и время инъекций и ввимите от 50 до 80 клеток в желточный мешок 48 часов после оплодотворения зебры. Во-первых, перенесите послезенотрансплантированные личинки зебры в 40 миллилитров раствора смеси при 32 градусах Цельсия.Поместите 10 зенотрансплантированных личинок в каждый колодец из 12-хорошо пластины. Затем разделите личинки на четыре группы. Относитесь к контрольной группе с E3, содержащей 0,1%DMSO, и обработать другие группы гемцитабином и/или Navitoclax.Инкубировать все личинки при 32 градусах по Цельсию в течение двух дней. После анестезии зенотрансплантированных личинок после лечения поместите их в 3%метил-целлюлозу. Используйте флуоресценцию или конфокальный микроскоп для изображения личинок с бокового вида.Затем используйте программное обеспечение для панели изображений J и график для количественной оценки интенсивности красных и зеленых сигналов флуоресценции. В этом исследовании, первичные раковые клетки ткани посеяны в полной среде после пищеварения с или без добавления ингибиторов рака поджелудочной железы фибробластов. Раковые клетки и фибробласты обогащаются как две различные популяции.Население без ингибиторов преобладают фибробласты в то время как рост раковых клеток преобладает после добавления ингибиторов. Построены два вектора лентивирусной упаковки, которые выражают зеленые или красные флуоресцентные белки в BCL2L1. Флуоресценция на основе вируса представляет собой состояние выживания клеток.Смешанные раковые клетки и фибробласты вводятся в желточный мешок Зебрафиш в течение 48 часов после оплодотворения, а затем лечатся гемцитабином и/или Navitoclax в течение двух дней. Клеточной виабильности в различных популяциях и клеточного состава зенографта меняются в качестве ответов на лечение наркотиками. При обработке различных типов опухолей, Есть несколько шагов, которые, возможно, потребуется возразить, в том числе время пищеварения клеток, дозировка лечения наркотиков, и так далее.Этот метод помогает исследователям использовать Зебрафиш из стандартного анализа CGX или PDS. Это позволяет смешивать и инъекции различных клеток при фиксированных соотношениях для количественной оценки прогресса полос, сравнивая их с ростом клеток. Личная защита имеет большое значение, особенно при упаковке лентивируса.Носите маски и перчатки, когда это необходимо и постарайтесь не смешивать на коже.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Разработка и ведение доклинической пациента Derived Опухоль модели ксенотрансплантата для исследования принципиально новых видов лечения рака

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Меланома пациента-производные Ксенотрансплантат Модель

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Изоляция и характеристика пациента полученных поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома ОрганоидНые Модели

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Модель ксенотрансплантата мышиной оммая для изучения прямой таргетной терапии лептоменингеальной болезни

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Экспланты опухолей, полученные от пациентов, как «живая» доклиническая платформа для прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Создание и использование моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, для метастазирования в центральную нервную систему

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Личинки данио-рерио как модель для оценки потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...