Name: patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment
Uploaded: 2019-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Bu iş Çin 81402582 Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Şanghay 12DZ2295100, 14YF1400600 ve 18ZR1404500 doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir

Tüm hayvan prosedürleri onaylanmış ve Fudan Üniversitesi 'nde hayvan etiği Komitesi kuralları takip ve tüm pankreas kanseri numuneleri Fudan Üniversitesi Şangay Kanser Merkezi 'nden elde edildi. FUSCC Etik Komitesi 'nden etik onay alındı ve her hastada yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.
1. mikroenjeksiyon için ekipman hazırlanması
<ol><li>
Enjeksiyon plakasını hazırlıyorum.
	<ol>
<li>E3 solüsyonu (0,6 g/l akvaryum tuzu çift distile su + 0,01 mg/l ...

<ol>
	<li>Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+Precision+Medicine+in+the+Clinic:+From+Biomarker+Discovery+to+Novel+Therapeutics.">Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+xenograft+model+for+studying+human+cancer+stem+cells+in+distant+metastasis+and+therapy+response.">A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response.</a> Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).</li><li>Gaudenzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+neuroendocrine+tumors.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).</li><li>Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Assessment+of+the+Bioactivity+of+the+Anticancer+Coumarin+OT48+by+Spheroids,+Colony+Formation+Assays,+and+Zebrafish+Xenografts.">Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts.</a> Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte-Derived+Lipids+Mediate+Melanoma+Progression+via+FATP+Proteins.">Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins.</a> Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U0126+inhibits+pancreatic+cancer+progression+via+the+KRAS+signaling+pathway+in+a+zebrafish+xenotransplantation+model.">U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model.</a> Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+Signaling+Remodels+Lipid+Metabolism+in+Zebrafish+Hepatocytes+following+Ras+Oncogenic+Insult.">Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult.</a> Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+chemical+screening+in+zebrafish.">The new age of chemical screening in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Patient-Derived+Xenograft+(PDX)+of+Breast+Cancer+Bone+Metastasis+in+a+Zebrafish+Model.">Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+in+zebrafish+embryos:+a+new+platform+for+translational+research+in+gastric+cancer.">Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cancer+Angiogenesis+and+Metastasis+in+a+Zebrafish+Embryo+Model.">Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+in+larval+zebrafish+reveals+tissue-specific+distributions+of+fifteen+fluorescent+compounds.">Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds.</a> Disease Model&amp; Mechanisms. , 028811 (2017).</li><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Charo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+overexpression+enhances+tumor-specific+T-cell+survival.">Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival.</a> Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+contribute+to+embryonic+and+extraembryonic+lineages+in+mouse+embryos+upon+inhibition+of+apoptosis.">Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis.</a> Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).</li><li>Boise, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-x,+a+bcl-2-related+gene+that+functions+as+a+dominant+regulator+of+apoptotic+cell+death.">bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.</a> Cell. 74 (4), 597-608 (1993).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li></ol>

Hem PDX hem de CDX modelleri tümör biyoloji22alanında hayati platformlar ve başarılı bir türler arası transplantasyonun kritik adımı xenograft 'in hayatta kalmasının geliştirilmesi.  Son zamanlarda, bazı çalışmalar göstermiştir ki BCL2L1 geçici ifade (BCL-XL) veya BCL2 önemli ölçüde hücre kimliklerini etkilemeden fare ev sahibi insan embriyonik kök hücrelerinin canlılığı artırabilir ve kaderlerde23 , <s...

Hassas Onkoloji bireysel hasta için en yararlı terapötik stratejileri bulmayı amaçlamaktadır1. Şu anda, in vitro primer kültür, in vitro nevuslardır kültür2gibi sayısız preklinik model ve nevuslardır kültürden önce veya sonra farelerde hasta türevi xenograflar (PDX) teşhis için önerilen ve potansiyel olarak ekran/değerlendirme terapötik seçimler3. İnsan primer kanser hücrelerinin bağışıklık tehlikeye fareler içine enjeksiyon tarafından oluşturulan PDX modeli, klinik Onkoloji kişiselleştirilmiş ilaç taraması için en umut verici araçlardan biridir3,4. İn vitro kültürlü hücre hattının aksine, PDX modelleri genellikle in vivo tümör ortamının bütünlüğünü ve heterojenliğini korur, farklı tümör hastalarının çeşitliliğini ve idosynkratik özelliklerini daha iyi taklit eder ve bu nedenle Hastaların potansiyel tıbbi sonucu4. Ancak, fareler PDX modellerinin nesil yüksek kaliteli hasta örnekleri ve çoklu grup deneyleri için yeterli hücre ve model toplamak için ay zaman gerektirir ve xenograft hücresel/genetik kompozisyonlar orijinal bu drift olabilir hastanınbiyopsisi. Fare PDX modeli kurulması için başarı oranı da düşük, zor geniş klinik uygulamada uygulanması için yapma. Pankreas kanseri gibi hızla ilerlemiştir kanserleri taşıyan hastalar için, zaman içinde PDX deneylerinden değerli bilgiler elde etmek mümkün olmayabilir.
Son birkaç yıl içinde, zebra balığı sadece CDX (hücre türetilen tümör xenograft) modelleri için potansiyel ev sahipleri olduğu bildirilmiştir, aynı zamanda PDX modelleri5,6,7,8,9, 10. vertebral model hayvan olarak, zebra balığı hem genetik hem de fizyolojide memeliler ile yeterli benzerlikleri vardır, iki önemli avantajı vardır: şeffaflık ve küçük boyutu11. Zebrafish de son derece saflık, ve yüzlerce doğuştan larva birkaç gün içinde yetişkin12tek bir çift elde edilebilir. Çeşitli çalışmalar kanser hastalıkları hem transjenik ve xenograft modelleri oluşturmak için zebra balığı istihdam var13,14. Farexenografts ile karşılaştırıldığında, zebra balığı ksenogreft tek hücreli çözünürlükte izlemeyi sağlar. İnsan dokularının belirli bir miktar zebra balığı PDX modelleri yüzlerce üretebilmek yeteneğine sahiptir (zpdxs), sadece fare PDX modelleri bir çift oluşturmak için yeterli olabilir iken15,16. Ayrıca, 2-5 DPF 'de zebra balığı larvalar zaten tam dolaşım sistemleri ve karaciğer ve böbrek gibi metabolik organları geliştirmek, ancak bağışıklık sistemi17, kalan sarısı sac doğal bir 3D orta iken, ilaç taraması için ideal, ilaç direnç testleri ve tümör göç gözlemleri6,18,19,20,21.
Klinik kullanım için bir tarama/test platformu olarak zPDX kullanmak için nihai bir girişim ile, burada, pankreas kanseri zPDX modeli için optimize edilmiş bir öneri açıklamak, hangi izin verir in vivo aday ilaç değerlendirme kısa bir süre içinde düşük maliyetlerde daha az hücre kullanarak. Zpdx6,9,10hakkında önceki referanslar ile karşılaştırıldığında, biz sistem daha uygun ve güvenilir klinik kişiselleştirilmiş tanı için yapmak için birkaç optimizasyonlar tanıttı: 1) farklı hücre ön sıralama primer tümör dokularında gruplar ve daha fazla deneylerden önce bir hafta boyunca primer hücreleri stabilize; 2) insan hücrelerini etiketleme ve Lentivirus tabanlı genetik modifikasyon ile xenograft hücre canlılığı artırılması; 3) hem besin takviyeleri (glikoz ve glutamin) ve sıcaklık zebra balığı kültür durumu optimize; 4) farklı hücre türlerinin ilaç yanıtlarının karşılaştırmalı bir şekilde ölçülme. Ayrıca birkaç ek malzeme ekleyerek enjeksiyon çözümünde değişiklik yaptık. Tamamen, bu iyileştirmeler hızlı bir şekilde daha fazla hasta-xenograft zebra balığı hosts bu güvenilir bir araç olarak aday ilaçların tepkisi değerlendirmek için kullanılabilir oluşturmak için imkanı sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sv30087.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cliniscience</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rho kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>an antibiotic for primary cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>C10010500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14170112.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type IV</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17104019.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#8544;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pancreatic cancer fibroblasts inhibitor</td>
			<td>CHI Scientific</td>
			<td>FibrOUT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentration column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millipore UFC910008</td>
			<td>Concentrate the virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21051024.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gemcitabine</td>
			<td>Gemzan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navitoclax(ABT-263)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1001</td>
			<td>Bcl-xL inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived heterogeneous xenograft model of pancreatic cancer using zebrafish larvae as hosts for comparative drug assessment

Hasta türevi tümör xenograft (PDX) ve hücre türevi tümör xenograft (CDX) preklinik değerlendirme, ilaç rehberlik ve temel kanser araştırmaları için önemli tekniklerdir. Geleneksel ana fareler içinde PDX modellerinin nesiller zaman alıcı ve sadece numunelerin küçük bir oranı için çalışıyor. Son zamanlarda, zebra balığı PDX (zpdx), küçük ölçekli ve yüksek verimlilik özellikleri ile benzersiz bir ana bilgisayar sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Burada, zPDX modellerinde karşılaştırmalı kemoterapi değerlendirmesi için çift floresan etiketli bir tümör xenograft modeli oluşturmak için optimize edilmiş bir metodolojisi tarif ediyoruz. Tümör hücreleri ve fibroblastlar, farklı kültür koşullarında taze hasat edilen veya dondurulmuş pankreas kanseri dokusundan zenginleştirilmiştir. Her iki hücre grubu, yeşil veya kırmızı floresan proteinlerin yanı sıra bir anti-apoptozis geni BCL2L1ifade eden Lentivirus tarafından etiketlenmiştir. Transferleştirilmiş hücreler, 32 °c ' de modifiye E3 ortamında yetiştirilen 2 DPF larva zebra balığı içine önceden karıştırılmış ve ortak enjekte edildi. Xenograft modelleri kemoterapi ilaçları ve/veya BCL2L1 inhibitörü ile tedavi edildi ve hem tümör hücrelerinin hem de fibroblastların canları aynı anda incelenmiştir. Özetle, bu protokol, araştırmacılar hızlı bir şekilde heterojen bir tümör mikroçevre ile zPDX modelleri büyük miktarda oluşturmak için izin verir ve daha uzun bir gözlem penceresi ve ilaç adaylarının verimliliğini değerlendirirken daha hassas bir nicel sağlar.

Prosedür şemalandırılmış bir anahat Şekil 1' de temsil edilir. Kısacası, primer kanser dokusu hücreleri pankreas kanseri fibroblast inhibitörleri ilavesi ile veya olmadan sindirim sonra tam orta içine tohumlama edildi. Kanser hücreleri ve fibroblastlar, fibroblastların inhibitörler olmaksızın hakim olduğu iki farklı nüfus olarak zenginleştirilmiştir ve inhibitörlerin eklenmesinden sonra kanser hücresi büyümesi galip gelmiştir (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment at JoVE.com

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Karşılaştırmalı Ilaç değerlendirmesi için ev sahipleri olarak zebrafish larvaları kullanarak pankreas kanserinin hasta türevi heterojen xenograft modeli

Bu protokol, ev sahibi olarak larva zebra balığı kullanarak virüs tabanlı çift floresan etiketli tümör xenograft modelinde optimizasyon prosedürlerini açıklar. Bu heterojen xenograft modeli Pankreatik kanser mikroçevre in vivo doku bileşimi taklit ve kişiselleştirilmiş zPDX içinde ilaç yanıtlarını değerlendirmek için daha hassas bir araç olarak hizmet vermektedir (zebrafish hasta tarafından türetilen xenograft) modelleri.

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Bugün bir larva Zebrafish PDX Modeli tanıtmak için gidiyoruz. Bu model, ilaç yanıtlarını değerlendirmek için ksenogreftteki benzer bir hücresel bileşimi daha iyi taklit edebildikleri ve karşılaştırmalı analizlerimizle sonuçların tutarlılığını daha da artırdıkları için önemlidir. Bu tekniğin iki ana avantajı vardır.İlk olarak, hücreleri farklı floresanlara etiketlemek için çeşitli standart kimyasal boyalar kullanıyoruz, bu da hücresel bileşimlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve anagrafik fazın yeteneğinin izin inmesine olanak sağlıyor. İkinci olarak, aynı zamanda zebra balıkinsan hücrelerinin genel hayatta kalma süresini artırır, onların genetik modifikasyon, hangi ilaç testi için daha uzun bir gözlem penceresi sağlar. Bu teknik pankreas kanseri olan hastalar için kişiselleştirilmiş tıp için potansiyel bir model sağlar ve aynı zamanda pre-klinik tümör ilaç ön değerlendirmesi için.Bu yöntem aynı zamanda diğer tümör hücrelerini izlemek veya in vivo zebrabalığında ksenogreftli tümör hücresi yok ve daha uzun gözlem süresi için hücre sağkalımını iyileştirmek için de kullanılabilir. Enjeksiyon plakasını hazırlamak için, E3 çözeltisinde %1 agarose 50 mililitrelik bir çözelti hazırlayın. Agarose eriyene kadar çözeltiyi kaynatın.10 santimetre Petri kabına tüm çözeltiyi dökün ve zebrabalığı embriyo fiksasyon kalıbını yüzeye yerleştirin. Agarose çözeltisi tamamen katılanınca kalıbı çıkarın. Enjeksiyon iğneleri hazırlamak için, iki iğne içine 0,9 milimetrelik bir iç boyutu ile 10 santimetre cam kılcal çekmek için bir iğne çekmece kullanın.Bir mikroskop ve forceps kullanarak, bir açıklık oluşturmak için iğne ucunu kesti. İlk olarak, 7-9 PM civarında bir çiftleme tankı içine yetişkin Zebrafish bir ila iki çift yerleştirin. Ertesi sabah saat 8'de döllenmiş yumurtaları toplayın. Döllenmiş yumurtaları 40 mililitre taze E3 çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.28.5 santigrat derecede kuluçkaya yat. İlk olarak, bir Petri çanak içine toplanan pankreas kanseri örneği aktarın. PBS ile 5-6 kez doku durulayın ve bir milimetre küp parçalar halinde doku kesmek için bir neşter kullanın.Daha sonra, parçalanmış dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş mililitre HBSS içeren. Kollajenaz tip dört, hyalurodinaz ekleyin ve BURADA gösterilen son konsantrasyonlarda BIR DNaase. Pipet karışımı yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için.Karışımı %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 15-20 dakika kuluçkaya yatırın. Pipet karışımı her beş dakikada bir birkaç kez yukarı ve aşağı. Tüpe yedi mililitre DMEM ekleyin.Santrifüj 110 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika. Daha sonra, supernatant decant ve DMEM tümör karışımı yeniden askıya. Karışımı, grup bir ve grup 2 olarak adlandırılan üç mililitre tam büyüme ortamı içeren iki altı santimetrelik Petri kabına koyun.Her iki grubu da %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, büyük hücre tipleri olarak kanser hücrelerini bırakarak, aşırı büyümüş fibroblastlar kaldırmak için grup bir orta içine pankreas kanseri fibroblastlar 100x inhibitörü ekleyin. Önceki koşulları kullanarak kuluçkaya yatın.Lentivirüs ürettikten sonra, 30-40% yoğunluğu ile 12-iyi plaka içine enfekte hücreleri tohum. %5 karbondioksit kuvözde hücreleri bir gecede 37 derecede kültüredin. Ertesi gün, mililitre başına sekiz mikrogram konsantrasyonda polibren içeren serum içermeyen orta 500 mikrolitre ile orta değiştirin.4 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, orta ve 12 saat boyunca tekrar kuluçka ya da lentivirus ek 100 mikrolitre ekleyin. 12 saat sonra, ek bir 36 saat için tam orta ve kuluçka iki mililitre ile orta değiştirin.36 saat sonra floresan işaretlerini kontrol edin. Enfekte hücreleri hasat ve mililitre başına bir milyon hücrenin son konsantrasyonu ile bire bir oranında karıştırın. Hücreleri 110 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve 50 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi içinde hücre karışımını yeniden askıya alın.Zebrabalığı larvalarını anestezi ettikten sonra modifiye E3 ile dolu enjeksiyon plakasına aktarın. Mikrocapiller iğne içine karışık hücre süspansiyon 25 mikrolitre alın ve mikroenjeksiyon manipülatör içine iğne takın. Enjeksiyon basıncını ve zamanı ayarlayın ve 50 ila 80 hücreyi döllenme sonrası 48 saatlik zebra balığının sarısı kesesine enjekte edin. İlk olarak, post-zenografted Zebrafish larvaları 32 santigrat derecede 40 mililitre karışım çözeltisine aktarın.12 kuyulu bir plakanın her kuyuya 10 zenografted larva yerleştirin. Sonra larvaları dört gruba ayırın. Kontrol grubunu %0,1 DMSO içeren E3 ile tedavi edin ve diğer grupları Gemcitabine ve/veya Navitoclax ile tedavi edin.Tüm larvaları 32 derecede iki gün kuluçkaya yatırın. Tedavi sonrası zenogreftli larvalar anestezi den sonra %3 metil selüloza yerleştirin. Yanal görünümden larvagörüntü için bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın.Ardından, kırmızı ve yeşil floresan sinyallerinin yoğunluğunu ölçmek için resim J ve grafik ped yazılımı kullanın. Bu çalışmada, birincil kanser doku hücreleri pankreas kanseri fibroblastlar inhibitörleri eklenmesi olmadan veya sindirim sonrası tam orta içine tohumlu. Kanser hücreleri ve fibroblastlar iki farklı popülasyon olarak zenginleştirilmiştir.Inhibitörleri olmayan popülasyonda fibroblastlar hakimken, inhibitörlerin eklenmesinden sonra kanser hücresi büyümesi hakimdir. BCL2L1'de yeşil veya kırmızı floresan proteinleri ifade eden iki lentiviral ambalaj vektörü üretilmiştir. Virüs tabanlı floresan etiketleme hücrelerin hayatta kalma durumunu temsil eder.Karışık kanser hücreleri ve fibroblastlar 48 saat sonra döllenme zebrabalığı sarısı kesesi içine enjekte edilir ve daha sonra iki gün boyunca Gemcitabine ve / veya Navitoclax ile tedavi edilir. Farklı popülasyonlarda hücre viabilities ve zenogreft hücresel bileşimi ilaç tedavisine yanıt olarak değiştirilir. Tümörlerin farklı işleme, itiraz edilmesi gerekebilir çeşitli adımlar vardır, hücre sindirim süresi de dahil olmak üzere, ilaç tedavi dozu, ve benzeri.Bu teknik, araştırmacıların standart bir CGX veya PDS tsasından Zebrabalığı kullanmalarına yardımcı olur. Sabit oranlarda farklı hücrelerin karıştırılması ve enjeksiyonu sayesinde ilerleme bantlarını hücre büyümesi ile karşılaştırarak ölçer. Kişisel koruma büyük önem, özellikle ambalaj lentivirus.Uygun olduğunda maske ve eldiven takın ve cilde karışmamaya çalışın.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Bir Klinik öncesi Hasta Türetilmiş Tümör Roman Anti-Kanser Tedaviler Soruşturma Xenograftlarında Modeli Geliştirilmesi ve Bakımı

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Bir melanom hasta-türetilen xenograft model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Hasta Kaynaklı Pankreas Duktal Adenokarsinom Organoid Modellerinin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal Hastalığın Doğrudan Hedefli Tedavisini Incelemek için Bir Murine Ommaya Xenograft Modeli

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Hasta Kaynaklı Tümör, Hastalarda İlaç Direncini Tahmin Etmek İçin "Canlı" Preklinik Bir Platform Olarak Eksplantlar

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Santral Sinir Sistemi Metastazının Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Kurulması ve Kullanılması

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Potansiyel Radyosensitizörleri veya Koruyucuları Değerlendirmek için Bir Model Olarak Zebra Balığı Larvaları

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...