Name: a melanoma patient-derived xenograft model
Uploaded: 2019-05-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model at JoVE.com

ويشكر المؤلفون مرفق معهد ويستار للحيوانية، ومرفق الفحص المجهري، ومرفق التكنولوجيا الهيستوجية، ومركز إمدادات البحوث. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من المنح المقدمة من U54 (CA224070-01)، وSPORE (CA174523)، P01 (CA114046-07)، والدكتور ميريام وشيلدون ج. أديلسون مؤسسة البحوث الطبية، ومؤسسة أبحاث الورم الميلانيني.

تتبع البروتوكولات الحيوانية التالية المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات الإنسانية في معهد ويستار والمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات.
1. جمع أنسجة الورم الميلانيني
<ol><li>جمع أنسجة الورم (تسمى ممر 0) من مرضى الورم الميلانيني من قبل واحدة من الجراحة التالية أو طرق خزعة.<ol>
<li>ب?...

<ol>
	<li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Genomic+Characterization+of+462+Melanoma+Patient-Derived+Xenografts,+Tumor+Biopsies,+and+Cell+Lines.">Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li><li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma.">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Paraiso, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+phospho-ERK+activity+allows+melanoma+cells+to+escape+from+BRAF+inhibitor+therapy.">Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy.</a> British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).</li><li>Long, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Outcomes+in+Patients+With+BRAF+V600-Mutant+Metastatic+Melanoma+Who+Received+Dabrafenib+Combined+With+Trametinib.">Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Hausser, H. J., Brenner, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+instability+of+Saos-2+cells+in+long-term+culture.">Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).</li><li>Fiebig, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+three+human+small+cell+lung+cancer+models+in+nude+mice.">Development of three human small cell lung cancer models in nude mice.</a> Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).</li><li>Izumchenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenografts+effectively+capture+responses+to+oncology+therapy+in+a+heterogeneous+cohort+of+patients+with+solid+tumors.">Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors.</a> Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+and+clonal+evolution+in+melanoma+during+BRAF+inhibitor+therapy.">Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy.</a> Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).</li><li>Monsma, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+patient+derived+xenografts+acquire+distinct+Vemurafenib+resistance+mechanisms.">Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms.</a> American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).</li><li>Das Thakur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+vemurafenib+resistance+in+melanoma+reveals+a+strategy+to+forestall+drug+resistance.">Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance.</a> Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>De La Rochere, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+for+the+Study+of+Immuno-Oncology.">Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology.</a> Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).</li></ol>

لقد وصفنا هنا توليد نماذج PDX من الورم الميلانيني مع أنسجة المريض المستمدة من الأورام الأولية والنقيلية، والخزعات الأساسية، وFNAs. عندما يتم تطعيمها مباشرة في الفئران NSG، والأورام تقديم خصائص مورفولوجية وجينية وبيولوجية مماثلة لتلك التي لوحظت في المريض. في حالة توافر كمية صغيرة فقط من الأنس...

النماذج ما قبل السريرية حاسمة لجميع جوانب أبحاث السرطان الترجمة، بما في ذلك توصيف المرض، واكتشاف نقاط الضعف القابلة للتنفيذ فريدة من نوعها للسرطان مقابل الخلايا الطبيعية، وتطوير العلاجات الفعالة التي تستغل هذه نقاط الضعف لزيادة البقاء على قيد الحياة عموما للمرضى. في مجال الورم الميلانيني، تم استخدام عشرات الآلاف من نماذج خط الخلية بشكل كبير لفحص المخدرات، مع > 4000 ساهمت بها مجموعتنا وحدها (سلسلة WMXXX). تم اشتقاق نماذج خط الخلية هذه من مرضى الورم الميلانيني الذين يعانون من أشكال مختلفة من الورم الميلانيني الجلدي (أي، الآكر، أوفيال، وانتشار السطحية) والأنماط الجينية المتنوعة (أي BRAFV600-متحولةوالورم الأرومي العصبي RAS الفيروسية الأنكيوجينية المتجانسة [ فى الانمازى Q61R-متحولة)،والتي تمتد طيف من الأمراض الموجودة في العيادة1،2.
بشكل لا لبس فيه، ظهرت استراتيجية العلاج الأكثر نجاحا والمستهدفة في مجال الورم الميلانيني من 1) التوصيف الجيني لأورام المرضى تحديد طفرات BRAF في ~ 50٪ من الأورام الميلانينية3 ومن 2) التحقيق قبل السريرية الاستفادة من نماذج خط الخلية الميلانوما4. وكان مزيج مثبطات BRAF / MEK إدارة الغذاء والدواء (FDA) المعتمدة في عام 2014 لعلاج المرضى الذين الأورام الميلانينية ميناء تفعيل الطفرات BRAFV600E / K وتفتخر > 75٪ معدل الاستجابة5. على الرغم من هذه الفعالية الأولية، والمقاومة تنشأ بسرعة في كل حالة تقريبا بسبب آليات المقاومة الجوهرية والمكتسبة متعددة والتباين داخل الورم. لسوء الحظ، نماذج خط الخلية لا تلخص التغاير البيولوجي التمثيلي عندما تزرع في ثقافة ثنائية الأبعاد في الأوعية البلاستيكية، والتي تخفي إمكاناتها التنبؤية سريريا عندما يحاول المحققون تحديد تجريبيا العلاجات التي قد تكون فعالة في المرضى الذين يعانون من شكل معين أو النمط الجيني من الورم الميلانيني6. إن فهم كيفية تحسين عدم تجانس المريض داخل الأورام سوف يسمح للمحققين بتطوير الطرائق العلاجية التي يمكن أن تقتل التجمعات السكانية الفرعية المقاومة للعلاج التي تدفع الفشل في العلاجات الحالية لمعيار الرعاية.
ومن الأهمية بمكان بالنسبة للقيمة التنبؤية المحدودة لنماذج خطوط الخلايا كيفية إنشائها في البداية. تحدث تعديلات لا رجعة فيها في المشهد الكلوني الورم عندما يتم زراعة تعليق خلية واحدة من ورم المرضى على ثنائي الأبعاد، والأوعية زراعة الأنسجة البلاستيكية، بما في ذلك التغيرات في إمكانات التكاثر والغازية، والقضاء على محددة التجمعات السكانية الفرعية، وتغيير المعلومات الوراثية7. Xenografts في الفئران من هذه النماذج خط الخلية الورم الميلانيني تمثل الأكثر استخداما في منصة الجسم الحي للدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية تعاني أيضا من التلخيص الفقراء من عدم تجانس الورم معقدة لوحظ سريريا. وللتغلب على هذا القصور، كان هناك اهتمام متزايد بدمج نماذج أكثر تطوراً قبل السريرية للميلانوما، بما في ذلك نموذج PDX. وقد استخدمت نماذج PDX لمدة [30 عاماً)، مع دراسات أساسية في مرضى سرطان الرئة مما يدل على التوافق بين استجابةالمرضى للعوامل السامة للخلايا واستجابة نموذج PDX المستمدة من نفس المريض 8. في الآونة الأخيرة، كان هناك حملة لاستخدام نماذج PDX كأداة الاختيار للتحقيقات ما قبل السريرية سواء في هذه الصناعة وفي المراكز الأكاديمية. نماذج PDX، بسبب تلخيصها متفوقة من عدم تجانس الورم في المرضى البشر، هي أكثر ملاءمة سريريا لاستخدامها في جهود تحسين العلاج من خط الخلية xenografts9. في الورم الميلانيني ، هناك عقبات هائلة أن الحدة من الإدارة العلاجية للمرض المتقدم10. وقد استخدمت نماذج PDX ذات الصلة سريريا لنموذج المقاومة السريرية وتحديد الاستراتيجيات العلاجية مع العوامل المتاحة سريريا لعلاج الأورام المقاومة للعلاج11،12. باختصار، يتطلب البروتوكول المعروض هنا لتوليد نماذج PDX زرع تحت الجلد من الأنسجة الطازجة من الأورام الميلانينية الأولية أو النقيلية (التي تم جمعها عن طريق خزعة أو جراحة) في NOD / scid / IL2 مستقبلات فارغة (NSG) الفئران. وتستخدم مجموعات مختلفة تباينات مختلفة في النهج المنهجي؛ ومع ذلك، يوجد جوهر أساسي13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1104px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:352px;">1 M Hepes</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td style="width:344px;">Cat # H0887-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100x PenStrep&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)</td>
			<td>MED</td>
			<td>Cat # MT21-023-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:62px;">2.5% Trypsin&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # T4549-100ML</td>
			<td>10 mL aliquots stored at &#8211;20oC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # A9418-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chlorhexidine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 50-118-0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase IV (2,000 u/mL)</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>Cat #4189</td>
			<td>make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # C6295-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N&#8217;N&#8217;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat # 324626.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fungizone</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gentamicin</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat # BW17518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>Cat # 050031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leibovitz&#39;s L15 media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354230</td>
			<td>Artificial extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Meloxicam</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein</td>
			<td>Cat # 025115</td>
			<td>1-5mg/kg, as painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice</td>
			<td>The Wistar Institute, animal facility</td>
			<td></td>
			<td>breeding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVA (polyvinyl alcohol)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# MT10041CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>Cat # 2976-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Virkon</td>
			<td>GALLARD-SCHLESINGER IND</td>
			<td>Cat # 222-01-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wound clips</td>
			<td>MikRon</td>
			<td>Cat #427631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a melanoma patient-derived xenograft model

تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الخصائص الجزيئية والبيولوجية تختلف في خلايا الورم الميلانيني التي تنمو في أوعية زراعة الأنسجة التقليدية ثنائية الأبعاد مقابل في الجسم الحي في المرضى البشر. ويرجع ذلك إلى اختيار عنق الزجاجة من السكان clonal من خلايا الورم الميلانيني التي يمكن أن تنمو بقوة في المختبر في غياب الظروف الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، فإن الاستجابات للعلاج في الثقافات الأنسجة ثنائية الأبعاد عموما لا تعكس بأمانة الاستجابات للعلاج في مرضى الورم الميلانيني، مع غالبية التجارب السريرية فشل في إظهار فعالية تركيبات العلاجية أظهرت أن تكون فعالة في المختبر. على الرغم من أن xenografting خلايا الورم الميلانيني في الفئران يوفر الفسيولوجية في سياق الجسم الحي غائبة عن اختبارات زراعة الأنسجة ثنائية الأبعاد، خلايا الورم الميلانيني المستخدمة للتطعيم قد خضعت بالفعل لاختيار عنق الزجاجة للخلايا التي يمكن أن تنمو تحت ثنائي الأبعاد الظروف عندما تم تأسيس خط الخلية. وتشمل التعديلات التي لا رجعة فيها التي تحدث نتيجة للاختناق التغيرات في خصائص النمو والغزو، فضلا عن فقدان مجموعات فرعية محددة. ولذلك، فإن النماذج التي تُزيّن بشكل أفضل الحالة الإنسانية في الجسم الحي قد تتنبأ بشكل أفضل بالاستراتيجيات العلاجية التي تزيد بشكل فعال من البقاء الكلي للمرضى الذين يعانون من الورم الميلانيني النقيلي. تتضمن تقنية xenograft (PDX) المشتقة من المريض الزرع المباشر للخلايا السرطانية من المريض البشري إلى متلقي الماوس. وبهذه الطريقة ، تنمو الخلايا السرطانية باستمرار تحت ضغوط فسيولوجية في الجسم الحي ولا تخضع أبدا ً للاختناق الثنائي الأبعاد ، الذي يحافظ على الخصائص الجزيئية والبيولوجية الموجودة عندما كان الورم في المريض البشري. ملحوظة، نماذج PDX المستمدة من مواقع الأعضاء من الانبثاث (أي الدماغ) عرض قدرة النقيلي مماثلة، في حين نماذج PDX المستمدة من المرضى السذاجة العلاج والمرضى الذين يعانون من مقاومة المكتسبة للعلاج (أي BRAF / MEK العلاج المانع) عرض حساسية مماثلة للعلاج.

أنسجة الورم لنماذج PDX الورم الميلانيني يمكن أن تأتي من مجموعة متنوعة من مصادر مختلفة، ويمكن أيضا أن تعالج وفقا لديناميات النمو من النماذج الفردية والاستخدام المطلوب من أنسجة PDX. وتتمثل الأولوية عند إنشاء نموذج PDX في الحصول على ما يكفيمن المواد لاستخدامها في المستقبل والحم?...

Watch this Scientific Journal Video about A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model at JoVE.com

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

نماذج xenograft المستمدة من المريض (PDX) أكثر قوة تلخيص الميزات الجزيئية والبيولوجية الورم الميلانيني وأكثر تنبؤا من استجابة العلاج مقارنة مع الاختبارات التقليدية القائمة على ثقافة الأنسجة البلاستيكية. هنا نقوم بوصف بروتوكول التشغيل القياسي الخاص بنا لإنشاء نماذج PDX جديدة وتحديد خصائص/تجريب نماذج PDX الموجودة.

نموذج Xenograft مشتق من سرطان الجلد

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

وقد أحدثت PDX ثورة في دراسات السرطان التجريبية قبل السريرية. يمكننا الآن محاكاة، في المختبر، ما يحدث في المرضى. والآن يمكننا العمل على كيفية التغلب على المقاومة وكيف يمكننا، على المدى الطويل، زيادة بقاء المرضى.إثبات الإجراء سيكون مين شياو. للبدء، نقل سابقا جمع أنسجة سرطان الجلد إلى طبق بيتري العقيمة. العمل مع مقص الجراحية، شفرة مشرط، والملقط، أولا إزالة الأنسجة الطبيعية من الأنسجة الطبيعية قدر الإمكان.ثم إزالة الأنسجة النخرية التي حددتها الأنسجة البيضاء العش شاحب تقع مركزيا داخل الورم. ثم استخدم مشرط لتقسيم قطعة ورم أولية إلى قطع متساوية تقريبًا لزرع فأر جراحي. إذا كان نسيج الورم صعبًا جدًا على الانفصام الميكانيكي ، فاستخدم مشرطًا لتلخيط قطع الورم بدقة قدر الإمكان لتشكيل الطين.نقل الطين في أنبوب 50 ملليلتر مع محلول الملح المتوازن هانك الباردة دون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم. أجهزة الطرد المركزي في 220 مرة ز لمدة أربع دقائق في أربع درجات مئوية. بعد إزالة المابير، إعادة تعليق الطين في 10 ملليلتر من الدافئة، وسائل الإعلام هضم الطازجة لكل غرام واحد من أنسجة الورم.ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة واخلطه بقوة كل خمس دقائق مع ماصة يمكن التخلص منها. اغسل الملاط باستخدام ما يصل إلى 50 ملليلتر من HBSS ، والطرد المركزي بمعدل 220 مرة ز لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم قم بإزالة المابير الفائقة. إضافة خمسة ملليلتر من العازلة TEG قبل الدافئة لكل غرام واحد من أنسجة الورم، ويهز إلى بلطف إعادة تعليق، ووضع الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين، دون خلط.لإخماد التربسين، إضافة واحد على الأقل على قدم المساواة حجم من وسائل الإعلام تلطيخ الباردة والطرد المركزي في 220 مرات ز لمدة أربع دقائق في أربع درجات مئوية. بعد إزالة ناظر، إضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام تلطيخ لكل غرام واحد من أنسجة الورم، وإعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. تصفية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 40 للحصول على تعليق خلية واحدة لحقن الماوس.لزرع الختان الجراحي أو نسيج الخزعة الجراحية، حلق الشعر أولاً من أسفل الظهر من NSG ستة إلى ثمانية أسابيع الفئران تخدير عمرها، وترك ما يقرب من 1.5 سنتيمتر إلى ثلاثة سنتيمترات منطقة دون شعر. إعداد قطع الورم، وتقسيم الطين الورم في بيتري في تلال الفردية لزرع الجراحية. باستخدام شفرة مشرط، وجعل شق ما يقرب من خمسة ملليمتر طويلة على مركز الجزء الخلفي من الماوس.مع زوج واحد من ملقط، والحياة حتى الجلد على جانب شق مقابل المشغل. مع مقص في اليد الأخرى، وفصل الجلد من طبقة العضلات عن طريق قطع بلطف الغشاء اللفافة مع مقص صغير التخفيضات، وبالتالي خلق جيب للأنسجة الورم. استخدام شفرة مشرط لالتقاط تشاك الورم واحد، فضلا عن تلة واحدة فردية من نسيج ملاط الورم، ووضع بلطف الأنسجة في الجيب الذي تم إنشاؤه.ثم إضافة 100 ميكرولترات من مصفوفة خارج الخلية الاصطناعية على كومة أنسجة الورم في الجيب. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، وسحب ما يصل شق على كلا الطرفين بحيث حواف الجرح تأتي قريبة معا. ثم ضعي مقطعاً أو مقطعين من الجروح لإغلاق الجرح.حقن تحت الجلد 1-5 ملليغرام لكل كيلوغرام من مسكن. عندما يكون الشفاء تماما، بعد ما يقرب من سبعة أيام، وإزالة لقطات الجرح. مراقبة الفئران مرة واحدة أسبوعيا للتحقق من الأورام واضحة.مرة واحدة الأورام تصل إلى حجم المطلوب، واستخدام ملقط الجراحية لرفع الجلد المجاورة للورم من الفأر القتل الرحيم وجعل قطع أفقي باستخدام مقص المنحني. استخدم تقنية فصل حادة لتعبئة الجلد على جانبي الورم وعلى الورم، مما يعرض الورم. استخدم المقص وشفرة مشرط لفصل الورم عن اللفافة.قطع الورم ونقله إلى طبق بيتري العقيم. قطع الورم إلى قطع صغيرة وإزالة الأنسجة النخرية من الورم. للبنوك أنسجة الورم لزرعها في المستقبل، واتخاذ اثنين إلى ثلاث قطع ورم صغيرة و mince لهم إلى قطع أصغر من واحد في ملليمتر واحد.نقل جميع الأنسجة المفروم إلى اثنين من المليلتر cryogenic الخسيس. إضافة ملليلتر واحد من تجميد وسائل الإعلام ومزيج جيد. ضع القنينات في حاوية تجميد الخلايا القائمة على الأيزوبروبانول التي تم تبريدها مسبقًا على الجليد الجاف، واحفظ الحاوية في ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ثم نقل القنينات إلى تخزين النيتروجين السائل.لالتقاط الأنسجة تجميد للمصب المقايسة، ووضع قطع أنسجة الورم في قارورة المبردة، ووضع الخسيس المبرد في النيتروجين السائل على الفور، وتخزين قوارير في ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية. عندما تم مقارنة ثلاث طرق مختلفة لزراعة أنسجة الورم ، كان تعليق الخلايا المفردة للخلايا السرطانية مع استخدام الهضم الأنزيمي هو الأكثر نجاحًا. إلى جانب السماح لنمو الورم أكثر سرعة، كان كافيا أيضا لورم واحد أولي ليتم توسيعه إلى 10 إلى 20 الفئران، في حين أن الورم تشاك وطريقة الطين يمكن إلا أن يوسع إلى خمسة إلى 10 الفئران.الميلانوما المريض المستمدة من نماذج xenograft غالبا ما تعكس حساسية المخدرات المريض عرض عندما على العلاج. A xenograft المستمدة من مريض سرطان الجلد الذي استجاب في البداية لمثبط BRAF، ولكن في نهاية المطاف انتكست، كما أظهرت حساسية أولية لتثبيط البروتين BRAF، بالإضافة إلى مثبطات كيناز MEK، ولكن الأورام انتكست في نهاية المطاف. من المهم للغاية توخي الحذر عند إعداد أنسجة PDX للبنوك ، لأن هذا سيضمن النجاح في توسعات PDX المستقبلية ، والتجارب العلاجية ، بالإضافة إلى التوصيف.مع مواد PDX ، تسلسل RNA خلية واحدة ، تسلسل إكسوم كله ، وتوصيف البروتيوم ، هي من بين العديد من الطرق التي رواه مختبرنا لتشريح مقاومة العلاج. تسمح تقنية PDX للباحثين بالتحقيق في مقاومة العلاج باستخدام الخلايا السرطانية التي تُخص بيولوجيا الورم بشكل أفضل في مريض بشري نسبة إلى نماذج السرطان التقليدية التي تزرع على البلاستيك. هذه الميزة تسمح لمزيد من الرؤى التنبؤية.يجب على الباحثين دائماً العناية واستخدام مستوى السلامة البيولوجية اثنين من الاحتياطات عند التعامل مع أنسجة الورم المستمدة من مريض بشري.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

تطوير وصيانة للورم المريض قبل السريرية المستمدة طعم أجنبي نموذج للتحقيق في رواية مكافحة السرطان العلاج

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

ورم انجرافتمينت في نموذج الفأر إكسينوجرافت من عباءة البشرية الخلية اللمفاوية

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

نماذج Xenograft المتوارثية المستمدة من المريض لسرطان الخلايا البولية البشرية ونمو ورم سرطان القولون والمستقيم وورم الانبثاث العفوي

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

جيل من الكبد البشرية العظام الإنسان الجلد البقري النظام الأساسي في الفئران نقص المناعة

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

إنشاء واستخدام نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

تقييم السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام نموذج فأر Xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...