Name: a melanoma patient-derived xenograft model
Uploaded: 2019-05-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model at JoVE.com

De auteurs bedanken het Wistar Institute dieren faciliteit, microscopie faciliteit, Histotechnologie faciliteit, en Research Supply Center. Deze studie werd deels gefinancierd door subsidies van de U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), de Dr. Miriam en Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, en de melanoma Research Foundation.

De volgende dieren protocollen volgen de richtlijnen van het Wistar Institute humane ethische Commissie en Dierenzorg richtlijnen.
1. melanoma tumorweefsel collectie
<ol><li>Verzamel tumorweefsel (zogenaamde passage 0) van melanoom patiënten door een van de volgende chirurgie of biopsie methoden.<ol>
<li>Houd voor chirurgisch excisie weefsel minimaal 1 g weefsel (uitzaaiingen en primaire laesies) in transport opslagmedia (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamicin) bij 4 °C of op ijs.</l...

<ol>
	<li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Genomic+Characterization+of+462+Melanoma+Patient-Derived+Xenografts,+Tumor+Biopsies,+and+Cell+Lines.">Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li><li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma.">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Paraiso, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+phospho-ERK+activity+allows+melanoma+cells+to+escape+from+BRAF+inhibitor+therapy.">Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy.</a> British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).</li><li>Long, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Outcomes+in+Patients+With+BRAF+V600-Mutant+Metastatic+Melanoma+Who+Received+Dabrafenib+Combined+With+Trametinib.">Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Hausser, H. J., Brenner, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+instability+of+Saos-2+cells+in+long-term+culture.">Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).</li><li>Fiebig, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+three+human+small+cell+lung+cancer+models+in+nude+mice.">Development of three human small cell lung cancer models in nude mice.</a> Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).</li><li>Izumchenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenografts+effectively+capture+responses+to+oncology+therapy+in+a+heterogeneous+cohort+of+patients+with+solid+tumors.">Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors.</a> Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+and+clonal+evolution+in+melanoma+during+BRAF+inhibitor+therapy.">Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy.</a> Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).</li><li>Monsma, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+patient+derived+xenografts+acquire+distinct+Vemurafenib+resistance+mechanisms.">Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms.</a> American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).</li><li>Das Thakur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+vemurafenib+resistance+in+melanoma+reveals+a+strategy+to+forestall+drug+resistance.">Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance.</a> Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>De La Rochere, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+for+the+Study+of+Immuno-Oncology.">Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology.</a> Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).</li></ol>

We hebben hierin beschreven het genereren van PDX-modellen van melanoom met patiënt weefsel afgeleid van primaire en gemetastaseerde tumoren, kern biopsieën en Fna's. Wanneer rechtstreeks in NSG-muizen worden geënt, presenteren tumoren vergelijkbare morfologische, genomische en biologische eigenschappen aan die waargenomen bij de patiënt. In het geval dat slechts een kleine hoeveelheid weefsel beschikbaar is voor onderzoekers, zoals vaak voorkomt bij Fna's, zorgt de PDX-techniek voor de uitbreiding van het tumorweefs...

Preklinische modellen zijn van cruciaal belang voor alle aspecten van translationeel kankeronderzoek, waaronder ziekte karakterisering, ontdekking van bruikbare kwetsbaarheden die uniek zijn voor kanker versus normale cellen, en de ontwikkeling van werkzame therapieën die misbruik maken van Deze kwetsbaarheden om de algehele overleving van patiënten te verhogen. In het melanoom-veld zijn tienduizenden cellijn modellen intensief gebruikt voor het screenen van drugs, met > 4000 bijgedragen door onze groep alleen (WMXXX-serie). Deze cellijn modellen werden afgeleid van melanoom patiënten met verschillende vormen van cutane melanoom (d.w.z. acral, ukalfs en oppervlakkige verspreiding) en diverse genotypen (d.w.z. brafV600-Mutant en neuroblastoom RAS virale oncogen homo [ Nri's Q61R-Mutant]), die het spectrum van de ziekte aanwezig in de kliniek1,2omvatten.
Ondubbelzinnig, de meest succesvolle, gerichte therapie strategie in het melanoom veld is voortgekomen uit 1) de genomische karakterisering van patiënten ' tumoren identificeren van braf mutaties in ~ 50% van melanomen3 en van 2) preklinisch onderzoek gebruik maken van melanoom Cell line modellen4. De combinatie van braf/MEK-remmer was Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurd in 2014 voor de behandeling van patiënten bij wie de melanomen Harbor brafV600E/K -mutaties activeert en een > 75% responsratio5heeft. Ondanks deze initiële werkzaamheid, ontstaat er snel resistentie in bijna elk geval als gevolg van multifarische intrinsieke en verworven resistentiemechanismen en intratumoreel heterogeniteit. Helaas, cellijn modellen niet recapituleren representatieve biologische heterogeniteit wanneer geteeld in de tweedimensionale cultuur in kunststof vaten, die maskeert hun klinisch voorspellend potentieel wanneer onderzoekers proberen om experimenteel te bepalen therapieën die effectief kunnen zijn bij patiënten met een specifieke vorm of genotype van melanoom6. Begrijpen hoe het beste model patiënt intratumoral heterogeniteit zal onderzoekers in staat stellen om beter te ontwikkelen therapeutische modaliteiten die kunnen doden therapie-resistente subpopulaties die het falen van de huidige standaard-van-zorg therapieën rijden.
Essentieel voor de beperkte voorspellende waarde van cellijn modellen is hoe ze in eerste instantie worden vastgesteld. Onomkeerbare veranderingen optreden in het tumor klonale landschap wanneer een eencellige suspensie van de tumor van een patiënt wordt geteeld op tweedimensionale, kunststof weefselkweek vaten, inclusief veranderingen in proliferatief en invasief potentieel, de eliminatie van specifieke subpopulaties en de wijziging van genetische informatie7. Xenografts in muizen van deze melanoom cellijn modellen vertegenwoordigen de meest gebruikte in vivo platform voor preklinische studies; echter, deze strategie lijdt ook aan de slechte recapitulatie van complexe tumor heterogeniteit waargenomen klinisch. Om deze tekortkoming te overwinnen, is er een groeiende belangstelling voor het opnemen van geavanceerdere preklinische modellen van melanoom, waaronder het PDX-model. PDX-modellen zijn gebruikt voor > 30 jaar, met zaad studies bij longkanker patiënten die overeenstemming aantonen tussen de respons van de patiënten op cytotoxische middelen en de respons van het PDX-model dat is afgeleid van dezelfde patiënt8. Onlangs is er een drive geweest om PDX-modellen te gebruiken als het instrument van keuze voor preklinisch onderzoek, zowel in de industrie als in academische centra. PDX-modellen zijn, vanwege hun superieure recapitulatie van tumor heterogeniteit bij humane patiënten, meer klinisch relevant voor gebruik in therapie optimaliserings inspanningen dan cellijn xenotransplantaten9. Bij melanoom zijn er immense hindernissen die het therapeutische beheer van gevorderde ziekte10botte. Klinisch relevante PDX-modellen zijn gebruikt om klinische resistentie te modelleren en therapeutische strategieën te identificeren met klinisch beschikbare agenten voor de behandeling van therapieresistente tumoren11,12. In het kort, het protocol hier gepresenteerd voor het genereren van PDX modellen vereist de subcutane implantatie van vers weefsel van primaire of gemetastaseerde melanomen (verzameld door biopsie of chirurgie) in NOD/scid/IL2-receptor Null (NSG) muizen. Verschillende variaties in methodologische benadering worden door verschillende groepen gebruikt; Er bestaat echter een fundamentele kern van13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1104px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:352px;">1 M Hepes</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td style="width:344px;">Cat # H0887-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100x PenStrep&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)</td>
			<td>MED</td>
			<td>Cat # MT21-023-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:62px;">2.5% Trypsin&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # T4549-100ML</td>
			<td>10 mL aliquots stored at &#8211;20oC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # A9418-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chlorhexidine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 50-118-0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase IV (2,000 u/mL)</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>Cat #4189</td>
			<td>make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # C6295-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N&#8217;N&#8217;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat # 324626.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fungizone</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gentamicin</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat # BW17518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>Cat # 050031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leibovitz&#39;s L15 media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354230</td>
			<td>Artificial extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Meloxicam</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein</td>
			<td>Cat # 025115</td>
			<td>1-5mg/kg, as painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice</td>
			<td>The Wistar Institute, animal facility</td>
			<td></td>
			<td>breeding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVA (polyvinyl alcohol)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# MT10041CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>Cat # 2976-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Virkon</td>
			<td>GALLARD-SCHLESINGER IND</td>
			<td>Cat # 222-01-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wound clips</td>
			<td>MikRon</td>
			<td>Cat #427631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a melanoma patient-derived xenograft model

Accumulatie van bewijs suggereert dat moleculaire en biologische eigenschappen verschillen in melanoom cellen gekweekt in traditionele tweedimensionale weefselkweek vaten versus in vivo bij menselijke patiënten. Dit komt door de knelpunt selectie van klonale populaties melanoom cellen die in vitro in de afwezigheid van fysiologische omstandigheden krachtig kunnen groeien. Verder reflecteren de reacties op therapie in tweedimensionale weefselculturen over het algemeen niet getrouw de reacties op therapie bij melanoom patiënten, waarbij de meerderheid van de klinische proeven niet de werkzaamheid van therapeutische combinaties laat zien die effectief blijken te zijn in Vitro. Hoewel het xenotransplanteren van melanoom cellen in muizen de fysiologische in vivo context bevat die afwezig is in de tweedimensionale weefsel cultuurassays, hebben de melanoom-cellen die worden gebruikt voor engraftment al een knelpunt selectie ondergaan voor cellen die kunnen groeien onder twee-dimensionale voorwaarden wanneer de cellijn werd vastgesteld. De onomkeerbare veranderingen die zich voordoen als gevolg van het knelpunt zijn veranderingen in de groei en invasie eigenschappen, evenals het verlies van specifieke subpopulaties. Daarom kunnen modellen die de menselijke toestand in vivo beter recapituleren, beter therapeutische strategieën voorspellen die de totale overleving van patiënten met gemetastaseerd melanoom effectief verhogen. De patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) techniek omvat de directe implantatie van tumorcellen van de menselijke patiënt aan een muis ontvanger. Op deze manier, tumorcellen worden consequent geteeld onder fysiologische spanningen in vivo en nooit ondergaan de tweedimensionale knelpunt, die behoudt de moleculaire en biologische eigenschappen aanwezig wanneer de tumor in de menselijke patiënt was. Opmerkelijke, PDX-modellen afgeleid van orgaan sites van metastasen (d.w.z. hersenen) vertonen vergelijkbare metastatische capaciteit, terwijl PDX-modellen afgeleid van therapie-naïeve patiënten en patiënten met verworven resistentie tegen therapie (d.w.z. BRAF/MEK-remmer therapie) weergeven vergelijkbare gevoeligheid voor therapie.

Tumor weefsel voor melanoom PDX modellen kan afkomstig zijn uit een verscheidenheid van verschillende bronnen en kan ook worden verwerkt per de groeidynamiek van individuele modellen en het gewenste gebruik van het PDX-weefsel. De prioriteit bij het opzetten van een PDX-model is dat er voldoende materiaal is voor de Bank voor toekomstig gebruik en DNA voor karakterisering (Figuur 1).
Zodra voldoende materiaal is banked, tumorweefsel kan worden uitgebreid in een va...

Watch this Scientific Journal Video about A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model at JoVE.com

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Patiënten-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen meer robuust even melanoom moleculaire en biologische kenmerken en zijn meer voorspellend van therapie respons in vergelijking met traditionele kunststof weefselcultuur gebaseerde assays. Hier beschrijven we ons standaard Besturingsprotocol voor de oprichting van nieuwe PDX-modellen en de karakterisatie/experimenten van bestaande PDX-modellen.

Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

De PDX heeft een revolutie teweeggebracht in de kanker experimentele pre-klinische studies. We kunnen nu, in het laboratorium, nabootsen wat er bij de patiënten gebeurt. En nu kunnen we werken aan hoe we de weerstand kunnen overwinnen en hoe we op de lange termijn de overleving van patiënten kunnen verhogen.Het demonstreren van de procedure zal Min Xiao zijn. Om te beginnen, overdracht eerder verzameld melanoom weefsel naar een steriele petrischaal. Werken met chirurgische schaar, scalpel mes, en tangen, eerst verwijderen van normaal weefsel uit het normale weefsel zoveel mogelijk.En verwijder dan het necrotische weefsel geïdentificeerd door bleek wit-achtig weefsel centraal gelegen in de tumor. Gebruik vervolgens een scalpel om een eerste tumorbrok in ongeveer gelijke stukken onder te verdelen voor chirurgische muisimplantatie. Als het tumorweefsel te hard is voor mechanische dissociatie, gebruik dan een scalpel om de tumorbrokken zo fijn mogelijk te gehakt om een drijfmest te vormen.Breng de drijfmest in een buis van 50 milliliter met koude Hank's Balanced Salt Solution zonder calcium- en magnesiumionen. Centrifuge op 220 keer g gedurende vier minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van de supernatant, opnieuw opschorten de drijfmest in 10 milliliter van opgewarmde, verse verteren media per een gram tumorweefsel.Plaats de buis in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 20 minuten en meng krachtig om de vijf minuten met een wegwerp pipet. Was de drijfmest met behulp van maximaal 50 milliliter HBSS, centrifuge op 220 keer g gedurende vier minuten op vier graden Celsius, en verwijder vervolgens de supernatant. Voeg vijf milliliter voorverwarmde TEG-buffer per een gram tumorweefsel toe, schud om voorzichtig opnieuw op te schorten en plaats de buis gedurende twee minuten op 37 graden Celsius, zonder te mengen.Om de trypsine te blussen, voeg ten minste een gelijk volume van koude kleuring media en centrifuge op 220 keer g gedurende vier minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van de supernatant, voeg 10 milliliter kleuring media per een gram tumorweefsel, en opnieuw opschorten van de pellet door pipetting op en neer. Filter het door een 40 micrometer celzeef om een enkele celopsusopening te krijgen voor muisinjectie.Om chirurgische excisie of chirurgisch biopsieweefsel te implanteren, scheert u eerst haar van de onderrug van NSG zes tot acht weken oude verdoofde muizen, waardoor een gebied van ongeveer 1,5 centimeter tot drie centimeter zonder haar overblijft. Bereid tumorbrokken voor en verdeel tumordrijfmest in een petri in individuele heuvels voor chirurgische implantatie. Met behulp van een scalpelblad, maak een ongeveer vijf millimeter lange incisie op het midden van de achterkant van de muis.Met een paar tangen, het leven van de huid aan de zijkant van de incisie tegenover de operator. Met een schaar in de andere hand, scheid de huid van de spierlaag door het fasciale membraan voorzichtig te snijden met kleine schaarsneden, waardoor een zak voor het tumorweefsel ontstaat. Gebruik een scalpel mes op te halen een tumor chuck, evenals een individuele heuvel van tumor drijfmestweefsel, en voorzichtig plaats het weefsel in de gecreëerde zak.Voeg vervolgens 100 microliters van kunstmatige extracellulaire matrix op de tumorweefsel heuvel in de zak. Met behulp van twee paar tangen, trek de incisie aan beide uiteinden, zodat de wond randen komen dicht bij elkaar. Breng vervolgens een of twee wondclips aan om de wond te sluiten.Onderhuids injecteren een tot vijf milligram per kilogram pijnstillen. Wanneer de genezing volledig is, na ongeveer zeven dagen, verwijder de wondclips. Monitor muizen een keer per week om te controleren op voelbare tumoren.Zodra tumoren een gewenst volume bereiken, gebruik maken van chirurgische tangen om de huid te tillen naast de tumor van de geëuthanaseerde muis en maak een horizontale snede met behulp van gebogen schaar. Gebruik een botte scheidingstechniek om de huid aan beide zijden van de tumor en over de tumor te mobiliseren, waardoor de tumor wordt bloot. Gebruik schaar en een scalpel mes om de tumor te scheiden van de fascia.Knip de tumor eruit en breng deze over naar een steriel petrischaaltje. Snijd de tumor in kleine stukjes en verwijder necrotisch weefsel uit de tumor. Om tumorweefsel te bank voor toekomstige implantatie, neem twee tot drie kleine tumor stukken en gehakt ze in stukken kleiner dan een voor een millimeter.Breng al het gehakt weefsel naar een twee milliliter cryogene verachtelijke. Voeg een milliliter van bevriezing media en meng goed. Plaats de flacons in een vooraf gekoelde isopropanol-gebaseerde cel vriescontainer op droog ijs, bewaar de container in een min 80 graden Celsius vriezer 's nachts, en breng de flesjes naar vloeibare stikstof opslag.Om vriesweefsel voor downstream-tests te breken, plaatst u de stukjes tumorweefsel in een cryogene flacon, plaatst u de cryogene vilten onmiddellijk in vloeibare stikstof en slaat u de flesjes op in een vriesvriezer van min 80 graden Celsius. Wanneer drie verschillende methoden van groeiende tumorweefsel werden vergeleken, eencellige suspensie van tumorcellen met het gebruik van enzymatische spijsvertering was het meest succesvol. Naast het toestaan van een snellere tumorgroei, was het ook voldoende om één initiële tumor uit te breiden tot 10 tot 20 muizen, terwijl de tumors chuck en drijfmestmethode alleen kunnen worden uitgebreid tot vijf tot 10 muizen.Melanoom patiënt-afgeleide xenograft modellen weerspiegelen vaak de gevoeligheid van het geneesmiddel van de patiënt weergegeven wanneer op therapie. Een xenograft afgeleid van melanoom patiënt die in eerste instantie gereageerd op een BRAF-remmer, maar uiteindelijk teruggevallen, ook weergegeven initiële gevoeligheid voor BRAF eiwitremming, plus MEK kinaseremmer, maar de tumoren uiteindelijk teruggevallen. Het is van cruciaal belang om voorzichtig te zijn bij de voorbereiding van PDX-weefsel voor het bankwezen, omdat dit succes zal garanderen in toekomstige PDX-uitbreidingen, therapieproeven en karakterisering.Met PDX-materiaal, single cell RNA sequencing, hele exome sequencing, en proteomische karakterisering, behoren tot de vele methoden ons lab maakt gebruik van therapie resistentie te ontleden. De PDX-techniek stelt onderzoekers in staat om therapieresistentie te onderzoeken met behulp van tumorcellen die de tumorbiologie beter samenvatten bij een menselijke patiënt ten opzichte van traditionele kankermodellen die op plastic worden gekweekt. Dit voordeel zorgt voor meer voorspellende inzichten.Onderzoekers moeten altijd zorg en gebruik bioveiligheid niveau twee voorzorgsmaatregelen bij de behandeling van tumorweefsel afkomstig van een menselijke patiënt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Ontwikkeling en onderhoud van een preklinisch Patient Afgeleid Tumor xenograft model voor onderzoek naar nieuwe anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Generatie van een lever Orthotopic humaan Ukalfs melanoom xenograft platform in Immunodeficiënte muizen

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

De oprichting en het gebruik van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van metastasen van het centrale zenuwstelsel

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...