Name: a melanoma patient-derived xenograft model
Uploaded: 2019-05-20T14:30:00
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Die Autoren danken dem Wistar Institute Animal Facility, Microscopy Facility, Histotechnology Facility und Research Supply Center. Diese Studie wurde zum Teil durch Stipendien der U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), der Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation und der Melanoma Research Foundation finanziert.

Die folgenden Tierprotokolle folgen den Richtlinien der humanen Ethikkommission des Wistar-Instituts und den Richtlinien für Tierpflege.
1. Melanom-Tumorgewebe-Sammlung
<ol><li>Sammeln Sie Tumorgewebe (als Passage 0 bezeichnet) von Melanompatienten durch eine der folgenden Chirurgischen oder Biopsiemethoden.<ol>
<li>Für chirurgisches Exzisionsgewebe mindestens 1 g Gewebe (Resektemetastasen und primäre Läsionen) in Transportspeichermedien (RPMI 1640 + 0,1% Pilzzone + 0,2% Gentamicin) bei ...

<ol>
	<li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Genomic+Characterization+of+462+Melanoma+Patient-Derived+Xenografts,+Tumor+Biopsies,+and+Cell+Lines.">Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li><li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma.">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Paraiso, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+phospho-ERK+activity+allows+melanoma+cells+to+escape+from+BRAF+inhibitor+therapy.">Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy.</a> British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).</li><li>Long, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Outcomes+in+Patients+With+BRAF+V600-Mutant+Metastatic+Melanoma+Who+Received+Dabrafenib+Combined+With+Trametinib.">Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Hausser, H. J., Brenner, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+instability+of+Saos-2+cells+in+long-term+culture.">Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).</li><li>Fiebig, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+three+human+small+cell+lung+cancer+models+in+nude+mice.">Development of three human small cell lung cancer models in nude mice.</a> Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).</li><li>Izumchenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenografts+effectively+capture+responses+to+oncology+therapy+in+a+heterogeneous+cohort+of+patients+with+solid+tumors.">Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors.</a> Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+and+clonal+evolution+in+melanoma+during+BRAF+inhibitor+therapy.">Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy.</a> Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).</li><li>Monsma, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+patient+derived+xenografts+acquire+distinct+Vemurafenib+resistance+mechanisms.">Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms.</a> American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).</li><li>Das Thakur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+vemurafenib+resistance+in+melanoma+reveals+a+strategy+to+forestall+drug+resistance.">Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance.</a> Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>De La Rochere, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+for+the+Study+of+Immuno-Oncology.">Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology.</a> Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).</li></ol>

Wir haben hier in beschrieben, dass PDX-Modelle von Melanomen mit Patientengewebe aus primären und metastasierenden Tumoren, Kernbiopsien und FNAs generiert werden. Bei direkter Eindringung in NSG-Mäuse stellen Tumoren ähnliche morphologische, genomische und biologische Eigenschaften dar wie die beim Patienten beobachteten. In dem Fall, in dem den Forschern nur eine geringe Menge Gewebe zur Verfügung steht, wie es bei FNAs häufig der Fall ist, ermöglicht die PDX-Technik die Erweiterung des Tumorgewebes für die DNA...

Präklinische Modelle sind entscheidend für alle Aspekte der translationalen Krebsforschung, einschließlich der Charakterisierung von Krankheiten, der Entdeckung umsetzbarer Schwachstellen, die für Krebs im Vergleich zu normalen Zellen einzigartig sind, und der Entwicklung wirksamer Therapien, die diese Schwachstellen, um das Gesamtüberleben der Patienten zu erhöhen. Im Melanombereich wurden Zehntausende von Zelllinienmodellen stark für das Arzneimittelscreening genutzt, wobei >4.000 von unserer Gruppe allein beigesteuert wurden (WMXXX-Serie). Diese Zelllinienmodelle wurden von Melanompatienten mit verschiedenen Formen des kutanen Melanoms (d. h. acral, uveal und oberflächliche Ausbreitung) und verschiedenen Genotypen (d. h. BRAFV600-mutant und Neuroblastom RAS viralen Onkogenhomolog [ NRAS Q61R-mutant]), die das Spektrum derKrankheit in der Klinik 1,2.
Die erfolgreichste, zielgerichtetese Therapiestrategie im Melanombereich ist eindeutig aus der genomischen Charakterisierung von Tumoren von Patienten hervorgegangen, die BRAF-Mutationen bei 50 % der Melanome3 und aus 2) präklinischen Untersuchungen identifiziert. Nutzung der Melanom-Zelllinienmodelle4. Die KOMBINATION braF/MEK-Hemmer wurde 2014 von der Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von Patienten zugelassen, deren Melanome braFV600E/K-Mutationen aktivieren und eine Ansprechrate von >75%von 5aufweisen. Trotz dieser anfänglichen Wirksamkeit entsteht in fast jedem Fall eine Resistenz durch vielfältige intrinsische und erworbene Resistenzmechanismen und intratumorale Heterogenität. Leider rekapitulieren Zelllinienmodelle keine repräsentative biologische Heterogenität, wenn sie in zweidimensionaler Kultur in Kunststoffgefäßen angebaut werden, was ihr klinisch vorausschauendes Potenzial verschleiert, wenn Forscher versuchen, experimentell zu bestimmen Therapien, die bei Patienten mit einer bestimmten Form oder einem Genotyp des Melanoms wirksam sein könnten6. Das Verständnis, wie die intratumorale Heterogenität von Patienten am besten modelliert werden kann, wird es den Forschern ermöglichen, bessere therapeutische Modalitäten zu entwickeln, die therapieresistente Subpopulationen abtöten können, die das Scheitern aktueller Standardtherapien antreiben.
Der begrenzte Vorhersagewert von Zelllinienmodellen ist die Art und Weise, wie sie ursprünglich festgelegt werden. Irreversible Veränderungen treten in der klonalen Tumorlandschaft auf, wenn eine einzellige Suspension eines Patiententumors auf zweidimensionalen, plastischen Gewebekulturgefäßen angebaut wird, einschließlich Veränderungen des proliferativen und invasiven Potenzials, die Eliminierung spezifischer Subpopulationen und die Veränderung der genetischen Information7. Xenografts in Mäuse dieser Melanom-Zelllinienmodelle stellen die am häufigsten verwendete In-vivo-Plattform für präklinische Studien dar; Diese Strategie leidet jedoch auch unter der schlechten Rekapitulation komplexer Tumorheterogenität, die klinisch beobachtet wurde. Um dieses Manko zu überwinden, besteht ein wachsendes Interesse an der Integration ausgefeilterer präklinischer Melanommodelle, einschließlich des PDX-Modells. PDX-Modelle werden seit >30 Jahren verwendet, wobei wegweisende Studien an Lungenkrebspatienten eine Übereinstimmung zwischen dem Ansprechen der Patienten auf zytotoxische Wirkstoffe und der Reaktion des PDX-Modells vom selben Patienten 8 zeigten. In jüngster Zeit gab es den Antrieb, PDX-Modelle als Werkzeug der Wahl für präklinische Untersuchungen sowohl in der Industrie als auch in akademischen Zentren zu nutzen. PDX-Modelle sind aufgrund ihrer überlegenen Rekapitulation der Tumorheterogenität bei menschlichen Patienten klinisch relevanter für die Therapieoptimierung als Zelllinien-Xenografts9. Bei Melanomen gibt es immense Hürden, die das therapeutische Management fortgeschrittener Krankheiten stumpf machen10. Klinisch relevante PDX-Modelle wurden verwendet, um klinische Resistenzen zu modellieren und therapeutische Strategien mit klinisch verfügbaren Wirkstoffen zur Behandlung therapieresistenter Tumoren zu identifizieren11,12. Kurz gesagt, das hier vorgestellte Protokoll zur Generierung von PDX-Modellen erfordert die subkutane Implantation von frischem Gewebe aus primären oder metastasierenden Melanomen (die durch Biopsie oder Operation gesammelt werden) in NOD/scid/IL2-Receptor NULL (NSG) Mäuse. Verschiedene Variationen des methodischen Ansatzes werden von verschiedenen Gruppen verwendet; es existiert jedoch ein grundlegender Kern13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1104px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:352px;">1 M Hepes</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td style="width:344px;">Cat # H0887-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100x PenStrep&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)</td>
			<td>MED</td>
			<td>Cat # MT21-023-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:62px;">2.5% Trypsin&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # T4549-100ML</td>
			<td>10 mL aliquots stored at &#8211;20oC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # A9418-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chlorhexidine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 50-118-0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase IV (2,000 u/mL)</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>Cat #4189</td>
			<td>make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # C6295-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N&#8217;N&#8217;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat # 324626.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fungizone</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gentamicin</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat # BW17518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>Cat # 050031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leibovitz&#39;s L15 media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354230</td>
			<td>Artificial extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Meloxicam</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein</td>
			<td>Cat # 025115</td>
			<td>1-5mg/kg, as painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice</td>
			<td>The Wistar Institute, animal facility</td>
			<td></td>
			<td>breeding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVA (polyvinyl alcohol)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# MT10041CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>Cat # 2976-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Virkon</td>
			<td>GALLARD-SCHLESINGER IND</td>
			<td>Cat # 222-01-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wound clips</td>
			<td>MikRon</td>
			<td>Cat #427631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a melanoma patient-derived xenograft model

Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass sich molekulare und biologische Eigenschaften in Melanomzellen unterscheiden, die in traditionellen zweidimensionalen Gewebekulturgefäßen angebaut werden, im Vergleich zu in vivo bei menschlichen Patienten. Dies ist auf die Engpassauswahl von klonalen Populationen von Melanomzellen zurückzuführen, die in Abwesenheit physiologischer Bedingungen in vitro robust wachsen können. Darüber hinaus spiegeln die Reaktionen auf die Therapie in zweidimensionalen Gewebekulturen insgesamt nicht die Reaktionen auf die Therapie bei Melanompatienten wider, wobei die Meisten klinischen Studien die Wirksamkeit therapeutischer Kombinationen nicht Vitro. Obwohl die Xenogtransplantation von Melanomzellen in Mäuse den physiologischen In-vivo-Kontext liefert, der in zweidimensionalen Gewebekultur-Assays fehlt, haben die für die Engraftmentierung verwendeten Melanomzellen bereits eine Engpassauswahl für Zellen durchlaufen, die unter zweidimensionale Bedingungen, wenn die Zelllinie festgelegt wurde. Zu den irreversiblen Veränderungen, die als Folge des Engpasses auftreten, gehören Veränderungen der Wachstums- und Invasionseigenschaften sowie der Verlust bestimmter Teilpopulationen. Daher können Modelle, die den menschlichen Zustand in vivo besser rekapitulieren, therapeutische Strategien besser vorhersagen, die das Gesamtüberleben von Patienten mit metastasierendem Melanom effektiv erhöhen. Die vom Patienten abgeleitete Xenograft-Technik (PDX) beinhaltet die direkte Implantation von Tumorzellen vom menschlichen Patienten zu einem Mausempfänger. Auf diese Weise werden Tumorzellen konsequent unter physiologischen Belastungen in vivo angebaut und erleiden nie den zweidimensionalen Engpass, der die molekularen und biologischen Eigenschaften bewahrt, die beim menschlichen Patienten vorhanden sind. Bemerkenswerte PDX-Modelle, die von Organstandorten von Metastasen (d. h. Gehirn) abgeleitet wurden, zeigen eine ähnliche metastasierende Kapazität, während PDX-Modelle, die von therapienaiven Patienten und Patienten mit erworbener Therapieresistenz (d. h. BRAF/MEK-Hemmertherapie) abgeleitet wurden, ähnliche Empfindlichkeit gegenüber der Therapie.

Tumorgewebe für Melanom-PDX-Modelle kann aus einer Vielzahl unterschiedlicher Quellen stammen und kann auch pro Wachstumsdynamik einzelner Modelle und der gewünschten Verwendung des PDX-Gewebes verarbeitet werden. Die Priorität bei der Erstellung eines PDX-Modells besteht darin, über genügend Material für die zukünftige Verwendung und DNA für die Charakterisierung zu verfügen (Abbildung 1).
Sobald genügend Material auf der Bank liegt, kann Tumorgewebe in...

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Patienten-abgeleitete Xenograft -Modelle (PDX) rekapitulieren die molekularen und biologischen Merkmale des Melanoms robuster und sind prädiktiver für die Therapiereaktion im Vergleich zu herkömmlichen auf Kunststoffgewebekulturen basierenden Assays. Hier beschreiben wir unser Standard-Betriebsprotokoll für die Etablierung neuer PDX-Modelle und die Charakterisierung/Experimentierung bestehender PDX-Modelle.

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Die PDX hat die krebsexperimentellen präklinischen Studien revolutioniert. Wir können jetzt im Labor nachahmen, was bei den Patienten vor sich geht. Und jetzt können wir daran arbeiten, wie wir den Widerstand überwinden können und wie wir langfristig das Überleben der Patienten erhöhen können.Demonstrierend wird das Verfahren Min Xiao sein. Um zu beginnen, übertragen Sie zuvor gesammeltes Melanomgewebe auf eine sterile Petrischale. Arbeiten mit chirurgischer Schere, Skalpellklinge und Zange, entfernen Sie zuerst normales Gewebe aus dem normalen Gewebe so weit wie möglich.Und dann entfernen Sie das nekrotische Gewebe, das durch blasses weiß-ish Gewebe identifiziert wird, das sich zentral im Tumor befindet. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen anfänglichen Tumorbrocken in etwa gleiche Stücke für die chirurgische Mausimplantation zu unterteilen. Wenn das Tumorgewebe zu hart für die mechanische Dissoziation ist, verwenden Sie ein Skalpell, um die Tumorbrocken so fein wie möglich zu zerkleinern, um eine Gülle zu bilden.Die Gülle in ein 50-Milliliter-Rohr mit kalter Hank es Balanced Salt Solution ohne Calcium- und Magnesiumionen geben. Zentrifuge bei 220 mal g für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstandes, setzen Sie die Gülle in 10 Milliliter erwärmten, frischen Verdauungsmedien pro Gramm Tumorgewebe wieder auf.Das Rohr 20 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad geben und alle fünf Minuten mit einer Einwegpipette kräftig vermischen. Waschen Sie die Gülle mit bis zu 50 MilliliterHBSS, Zentrifuge bei 220 mal g für vier Minuten bei vier Grad Celsius, und entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie fünf Milliliter vorgewärmten TEG-Puffer pro Gramm Tumorgewebe hinzu, schütteln Sie, um sanft wieder aufzuhängen, und legen Sie das Rohr zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius, ohne zu mischen.Um das Trypsin zu löschen, fügen Sie mindestens ein gleiches Volumen von kalten Färbemedien und Zentrifuge bei 220 mal g für vier Minuten bei vier Grad Celsius hinzu. Nach dem Entfernen des Überstandes 10 Milliliter Färbemittel pro Gramm Tumorgewebe hinzufügen und das Pellet durch Pipetieren nach oben und unten wieder aufhängen. Filtern Sie es durch ein 40 Mikrometer-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension für die Mausinjektion zu erhalten.Um chirurgische Exzision oder chirurgisches Biopsiegewebe zu implantieren, rasieren Sie zuerst Haare aus dem unteren Rücken von NSG sechs bis acht Wochen alte anästhesierte Mäuse, so dass eine etwa 1,5 Zentimeter bis drei Zentimeter Bereich ohne Haare. Bereiten Sie Tumorbrocken vor und teilen Sie Tumorschlämme in einem Petri in einzelne Hügel für die chirurgische Implantation auf. Mit einem Skalpellblatt, machen Sie einen etwa fünf Millimeter langen Schnitt auf der Mitte der Rückseite der Maus.Mit einem Paar Zange, Leben bis die Haut auf der Seite des Schnittes gegenüber dem Bediener. Mit der Schere in der anderen Hand, trennen Sie die Haut von der Muskelschicht, indem Sie sanft schneiden Sie die Faszienmembran mit kleinen Scherenschnitten, wodurch eine Tasche für das Tumorgewebe. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um ein Tumorfutter sowie einen einzelnen Hügel aus Tumorschlämmgewebe aufzunehmen und das Gewebe vorsichtig in die erstellte Tasche zu legen.Dann fügen Sie 100 Mikroliter künstliche extrazelluläre Matrix auf dem Tumorgewebehügel in der Tasche. Ziehen Sie mit zwei Zangenpaaren den Schnitt an beiden Enden hoch, so dass die Wundkanten näher zusammenrücken. Wenden Sie dann ein oder zwei Wundclips an, um die Wunde zu schließen.Subkutan injizieren ein bis fünf Milligramm pro Kilogramm Schmerzmittel. Wenn die Heilung vollständig ist, entfernen Sie nach etwa sieben Tagen die Wundclips. Überwachen Sie Mäuse einmal wöchentlich, um auf spürbare Tumore zu überprüfen.Sobald Tumore ein gewünschtes Volumen erreichen, verwenden Sie chirurgische Zangen, um die Haut neben dem Tumor der eingeschläferten Maus zu heben und einen horizontalen Schnitt mit einer gekrümmten Schere zu machen. Verwenden Sie eine stumpfe Trenntechnik, um die Haut auf beiden Seiten des Tumors und über den Tumor zu mobilisieren und den Tumor freizulegen. Verwenden Sie eine Schere und eine Skalpellklinge, um den Tumor von der Faszie zu trennen.Schneiden Sie den Tumor aus und übertragen Sie ihn in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke und entfernen Sie nekrotisches Gewebe aus dem Tumor. Um Tumorgewebe für die zukünftige Implantation zu überführen, nehmen Sie zwei bis drei kleine Tumorstücke und zerkleinern Sie sie in Stücke kleiner als eins mal ein Millimeter.Übertragen Sie das gesamte gehackte Gewebe auf eine zwei Milliliter kryogene Abscheuliche. Fügen Sie einen Milliliter gefrierenden Mediums hinzu und mischen Sie gut. Legen Sie die Fläschchen in einen vorgekühlten Isopropanol-basierten Zellgefrierbehälter auf Trockeneis, lagern Sie den Behälter über Nacht in einem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius und übertragen Sie die Durchstechflaschen dann in die Flüssigkeitsstickstofflagerung.Um Gefriergewebe für nachgeschaltete Tests zu schnappen, legen Sie die Tumorgewebestücke in eine kryogene Durchstechflasche, legen Sie den kryogenen Übelinfall sofort in flüssigen Stickstoff und lagern Sie die Fläschchen in einem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Wenn drei verschiedene Methoden des Wachsenden von Tumorgewebe verglichen wurden, war die einzellige Suspension von Tumorzellen mit der Anwendung der enzymatischen Verdauung am erfolgreichsten. Neben der Möglichkeit eines schnelleren Tumorwachstums reichte es auch aus, einen Anfangstumor auf 10 bis 20 Mäuse auszudehnt zu haben, während die Tumorfutter- und Güllemethode nur auf fünf bis zehn Mäuse erweitert werden kann.Melanom-Patienten-abgeleitete Xenograft-Modelle spiegeln oft die Arzneimittelempfindlichkeit wider, die der Patient während der Therapie anzeigt. Ein Xenograft, das von Melanompatienten abgeleitet wurde, die zunächst auf einen BRAF-Hemmer angingen, aber letztlich zurückfielen, zeigte ebenfalls eine anfängliche Empfindlichkeit gegenüber BRAF-Proteinhemmung sowie MEK-Kinase-Inhibitor, aber die Tumore fielen schließlich zurück. Bei der Vorbereitung von PDX-Gewebe für das Bankwesen ist Vorsicht zu beachten, da dies den Erfolg zukünftiger PDX-Erweiterungen, Therapiestudien sowie Der Charakterisierung sicherstellen wird.Mit PDX-Material gehören einzellige RNA-Sequenzierung, gesamte Exome-Sequenzierung und proteomische Charakterisierung zu den vielen Methoden, die unser Labor nutzt, um Therapieresistenzen zu sezieren. Die PDX-Technik ermöglicht es Forschern, Therapieresistenzen mit Tumorzellen zu untersuchen, die die Tumorbiologie bei einem menschlichen Patienten besser rekapitulieren, verglichen mit traditionellen Krebsmodellen, die auf Kunststoff angebaut werden. Dieser Vorteil ermöglicht vorausschauende Einblicke.Forscher sollten immer vorsichtig sein und Biosicherheitsstufe zwei Vorsichtsmaßnahmen verwenden, wenn tumorgewebe von einem menschlichen Patienten abgeleitet behandelt wird.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies (Video) | JoVE

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Forschung

Krebsforschung

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies (Video) | JoVE

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma (Video) | JoVE

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma (Video) | JoVE

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model (Video) | JoVE

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis (Video) | JoVE

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment (Video) | JoVE

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines (Video) | JoVE

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice (Video) | JoVE

Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis (Video) | JoVE

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...