Name: a melanoma patient-derived xenograft model
Uploaded: 2019-05-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model at JoVE.com

Författarna tackar Wistar Institute djur anläggning, mikroskopi anläggning, Histotechnology anläggning, och forskning Supply Center. Denna studie finansierades delvis av bidrag från U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Dr. Miriam och Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, och melanom Research Foundation.

Följande djur protokoll följer riktlinjerna från Wistar Institutes humana etikkommitté och riktlinjer för djuromsorg.
1. melanom tumör vävnad insamling
<ol><li>Samla tumör vävnad (kallas passage 0) från melanom patienter med en av följande kirurgi eller biopsi metoder.<ol>
<li>För kirurgisk excision vävnad, upprätthålla minst 1 g vävnad (resect metastaser och primära lesioner) i transport lagringsmedia (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamicin) vid 4 ° c eller på is.</...

<ol>
	<li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Genomic+Characterization+of+462+Melanoma+Patient-Derived+Xenografts,+Tumor+Biopsies,+and+Cell+Lines.">Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li><li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma.">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Paraiso, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+phospho-ERK+activity+allows+melanoma+cells+to+escape+from+BRAF+inhibitor+therapy.">Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy.</a> British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).</li><li>Long, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Outcomes+in+Patients+With+BRAF+V600-Mutant+Metastatic+Melanoma+Who+Received+Dabrafenib+Combined+With+Trametinib.">Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Hausser, H. J., Brenner, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+instability+of+Saos-2+cells+in+long-term+culture.">Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).</li><li>Fiebig, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+three+human+small+cell+lung+cancer+models+in+nude+mice.">Development of three human small cell lung cancer models in nude mice.</a> Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).</li><li>Izumchenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenografts+effectively+capture+responses+to+oncology+therapy+in+a+heterogeneous+cohort+of+patients+with+solid+tumors.">Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors.</a> Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+and+clonal+evolution+in+melanoma+during+BRAF+inhibitor+therapy.">Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy.</a> Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).</li><li>Monsma, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+patient+derived+xenografts+acquire+distinct+Vemurafenib+resistance+mechanisms.">Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms.</a> American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).</li><li>Das Thakur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+vemurafenib+resistance+in+melanoma+reveals+a+strategy+to+forestall+drug+resistance.">Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance.</a> Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>De La Rochere, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+for+the+Study+of+Immuno-Oncology.">Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology.</a> Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).</li></ol>

Vi har häri beskrivs genererar PDX modeller av melanom med patient vävnad som härrör från primära och metastaserande tumörer, kärnbiopsier, och FNAs. När direkt inympas i NSG-möss, tumörer uppvisar liknande morfologiska, genomiska, och biologiska egenskaper till de som observerats i patienten. I fallet när endast en liten mängd vävnad är tillgänglig för utredare, som ofta sker med FNAs, tillåter PDX tekniken för utbyggnad av tumör vävnad för DNA, RNA, och proteinkarakterisering, samt för behandling...

Prekliniska modeller är kritiska för alla aspekter av Translationell Cancerforskning, inklusive sjukdomkaraktärisering, upptäckt av angripbara sårbarheter som är unika för cancer kontra normala celler, och utveckling av effektiva terapier som utnyttjar dessa sårbarheter för att öka patienternas totala överlevnad. I melanom fältet, tiotusentals cellinjer modeller har varit tungt utnyttjas för Drug screening, med > 4000 bidragit med vår grupp ensam (WMXXX-serien). Dessa cellinjer modeller härstammar från melanom patienter med olika former av kutana melanom (dvs., acral, ukalv, och ytliga spridning) och olika genotyper (dvs., BRAFV600-Mutant och neuroblastom ras viral onkogen homolog [ Nationella regleringsmyndigheter Q61R-Mutant]), som spänner över det spektrum av sjukdomar som finns i kliniken1,2.
Otvetydigt, den mest framgångsrika, riktade terapi strategi i melanom fältet har uppstått från 1) den genomiska karakteriseringen av patienternas tumörer som identifierar BRAF -mutationer i ~ 50% av melanom3 och från 2) preklinisk undersökning utnyttja melanom cell linje modeller4. Kombinationen BRAF/MEK-hämmare var Food and Drug Administration (FDA)-godkänd i 2014 för behandling av patienter vars melanom Harbor aktiverande BRAFV600E/K- mutationer och ståtar med en > 75% svarsfrekvens5. Trots denna initiala effekt, resistens uppstår snabbt i nästan alla fall på grund av mångskiftande inneboende och förvärvade resistensmekanismer och intratumorala heterogenitet. Tyvärr, cellinjer modeller inte recapitulate representativa biologiska heterogenitet när odlas i tvådimensionell kultur i plast fartyg, som döljer sin kliniskt prediktiva potential när utredare försök att experimentellt avgöra terapier som kan vara effektiva hos patienter med en specifik form eller genotyp av melanom6. Förstå hur man bäst modell patienten intratumorala heterogenitet kommer att göra det möjligt för utredare att bättre utveckla terapeutiska modaliteter som kan döda behandlingsresistenta subpopulationer som driver underlåtenhet att nuvarande standard-of-Care terapier.
Avgörande för den begränsade prediktiva värdet av cellinjer modeller är hur de ursprungligen fastställts. Irreversibla förändringar förekommer i tumörens klonala landskap när en encellig suspension av en patient tumör odlas på tvådimensionella, plast vävnad kultur fartyg, inklusive förändringar i proliferativ och invasiv potential, eliminering av specifika subpopulationer, och förändringen av genetisk information7. Xenografts till möss av dessa melanom cell linje modeller representerar den mest använda in vivo plattform för prekliniska studier; men denna strategi lider också av den fattiga rekapitulation av komplexa tumör heterogenitet observerats kliniskt. För att övervinna denna brist har det funnits ett växande intresse av att införliva mer sofistikerade prekliniska modeller av melanom, inklusive PDX-modellen. PDX-modellerna har använts i > 30 år, med seminala studier på lungcancerpatienter som demonstrerade överensstämmelse mellan patienternas respons på cytotoxiska medel och responsen hos PDX-modellen som härrör från samma patient8. Nyligen har det varit en enhet att använda PDX modeller som verktyg för val för prekliniska utredningar både i branschen och i akademiska centra. PDX modeller, på grund av deras överlägsna rekapitulation av tumör heterogenitet hos mänskliga patienter, är mer kliniskt relevanta att använda i terapi optimering insatser än cellinjer xenograft9. I melanom, det finns enorma hinder som trubbigt den terapeutiska hanteringen av avancerad sjukdom10. Kliniskt relevanta PDX-modeller har använts för att modellera kliniskt motstånd och identifiera terapeutiska strategier med kliniskt tillgängliga medel för behandling av behandlingsresistenta tumörer11,12. Kortfattat, det protokoll som presenteras här för att generera PDX modeller kräver subkutan implantation av färsk vävnad från primära eller metastaserande melanom (samlas in av biopsi eller kirurgi) till nod/scid/IL2 nätters-receptor null (NSG) möss. Olika grupper använder sig av skilda variationer i metodologisk metod. emellertid finns en grund kärna13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1104px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:352px;">1 M Hepes</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td style="width:344px;">Cat # H0887-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100x PenStrep&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)</td>
			<td>MED</td>
			<td>Cat # MT21-023-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:62px;">2.5% Trypsin&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # T4549-100ML</td>
			<td>10 mL aliquots stored at &#8211;20oC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # A9418-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chlorhexidine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 50-118-0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase IV (2,000 u/mL)</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>Cat #4189</td>
			<td>make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # C6295-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N&#8217;N&#8217;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat # 324626.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fungizone</td>
			<td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>Cat # 15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gentamicin</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat # BW17518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>Cat # 050031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leibovitz&#39;s L15 media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # 21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354230</td>
			<td>Artificial extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Meloxicam</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein</td>
			<td>Cat # 025115</td>
			<td>1-5mg/kg, as painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice</td>
			<td>The Wistar Institute, animal facility</td>
			<td></td>
			<td>breeding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVA (polyvinyl alcohol)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td>
			<td>Cat # P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# MT10041CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>Cat # 2976-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Virkon</td>
			<td>GALLARD-SCHLESINGER IND</td>
			<td>Cat # 222-01-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wound clips</td>
			<td>MikRon</td>
			<td>Cat #427631</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a melanoma patient-derived xenograft model

Ackumulerande bevis tyder på att molekylära och biologiska egenskaper skiljer sig i melanomceller som odlas i traditionella tvådimensionella vävnadsodling fartyg kontra in vivo hos mänskliga patienter. Detta beror på flaskhalsen urvalet av klonala populationer av melanomceller som robust kan växa in vitro i avsaknad av fysiologiska tillstånd. Vidare, svar på behandling i tvådimensionella vävnadskulturer övergripande inte troget återspeglar svar på behandling hos melanom patienter, med majoriteten av kliniska prövningar inte visar effekten av terapeutiska kombinationer visat sig vara effektiva i In vitro. Även om xenograftering av melanomceller till möss ger den fysiologiska in vivo-kontexten frånvarande från tvådimensionella vävnads odlings analyser, har de melanomceller som används för inympning redan genomgått flaskhals val för celler som kan växa under två-dimensionella förhållanden när cell linjen upprättades. De oåterkalleliga förändringar som uppstår till följd av flaskhalsen inkluderar förändringar i tillväxt-och invasions egenskaper, liksom förlusten av specifika subpopulationer. Därför kan modeller som bättre recapitulate människans villkor in vivo bättre förutsäga terapeutiska strategier som effektivt öka den totala överlevnaden för patienter med metastaserande melanom. Den patient-härledda xenograft (PDX) teknik innebär direkt implantation av tumörceller från den mänskliga patienten till en mus mottagare. På detta sätt, tumörceller ständigt odlas under fysiologiska spänningar in vivo och aldrig genomgå den tvådimensionella flaskhalsen, som bevarar de molekylära och biologiska egenskaper som finns när tumören var i den mänskliga patienten. Anmärkningsvärda, PDX-modeller härledda från organ platser av metastaser (dvs. hjärnan) uppvisar likartad metastaserande kapacitet, medan PDX-modeller som härrör från behandlingsnaiva patienter och patienter med förvärvad resistens mot behandling (dvs. BRAF/MEK-hämmare) visar liknande känslighet för behandling.

Tumör vävnad för melanom PDX modeller kan komma från en mängd olika källor och kan också bearbetas per tillväxtdynamik enskilda modeller och önskad användning av PDX vävnad. Prioriteringen vid upprättande av en PDX-modell är att ha tillräckligt med material till banken för framtida användning och DNA för karakterisering (figur 1).
När tillräckligt material är bankas, tumör vävnad kan utökas i en av tre huvudsakliga metoder för att växa til...

Watch this Scientific Journal Video about A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model at JoVE.com

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Patienter som härrör xenograft (PDX) modeller mer robust recapitulate melanom molekylära och biologiska egenskaper och är mer prediktiva för behandlingssvar jämfört med traditionella plast vävnad kulturbaserade analyser. Här beskriver vi vårt standard drifts protokoll för etablering av nya PDX-modeller och karakterisering/experimenterande av befintliga PDX-modeller.

En melanom patient-derived xenograft modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

PDX har revolutionerat de cancer experimentella prekliniska studierna. Vi kan nu härma, i laboratoriet, vad som händer i patienterna. Och nu kan vi arbeta på hur vi kan övervinna motståndet och hur vi på lång sikt kan öka överlevnaden för patienterna.Demonstrera förfarandet kommer att Min Xiao. Till att börja, överför tidigare insamlade melanom vävnad till en steril Petri-skålen. Arbeta med kirurgisk sax, skalpell blad, och tulktorer, först ta bort normal vävnad från den normala vävnaden så mycket som möjligt.Och sedan ta bort den nekrotiska vävnaden som identifierats av blek vit-ish vävnad som ligger centralt i tumören. Använd sedan en skalpell för att dela upp en första tumörbit i ungefär lika stora bitar för kirurgisk musimplantation. Om tumörvävnaden är för hårt för mekanisk dissociation, använd en skalpell för att finhacka tumörbitarna så fint som möjligt för att bilda en slurry.Överför uppslamningen till ett 50 milliliter rör med kalla Hanks Balanced Salt Solution utan kalcium- och magnesiumjoner. Centrifugera vid 220 gånger g i fyra minuter vid fyra grader Celsius. Efter att ha tagit bort supernatanten, åter avbryta slurry i 10 milliliter av uppvärmda, färska smälta media per ett gram tumörvävnad.Placera röret i en 37 grader Celsius vattenbad i 20 minuter och blanda kraftigt var femte minut med en engångspipett. Tvätta uppslamningen med upp till 50 milliliter HBSS, centrifug vid 220 gånger g i fyra minuter vid fyra grader Celsius och ta sedan bort supernatanten. Tillsätt fem milliliter av förvörd TEG buffert per ett gram tumörvävnad, skaka för att försiktigt åter upphäva, och placera röret på 37 grader Celsius i två minuter, utan att blanda.För att släcka trypsin, tillsätt minst en lika stor volym av kallfärgning media och centrifug vid 220 gånger g i fyra minuter vid fyra grader Celsius. Efter att ha tagit bort supernatanten, tillsätt 10 milliliter färgningsmedia per ett gram tumörvävnad, och åter upphäva pelleten genom pipettering upp och ner. Filtrera den genom en 40 mikrometer cell sil för att få en enda cell suspension för musinjektion.För att implantera kirurgiska excision eller kirurgisk biopsi vävnad, först raka hår från nedre delen av ryggen av NSG sex till åtta veckor gamla sövda möss, lämnar en cirka 1,5 centimeter till tre centimeter område utan hår. Förbered tumör bitar, och dela tumör slurry i en Petri i enskilda högar för kirurgisk implantation. Med hjälp av en skalpell blad, gör en cirka fem millimeter långt snitt på mitten av baksidan av musen.Med ett par tuppar, livet upp huden på sidan av snittet mittemot operatören. Med sax i den andra handen, separera huden från muskelskiktet genom att försiktigt skära fascial membranet med små saxskär, och därigenom skapa en ficka för tumörvävnaden. Använd en skalpell blad för att plocka upp en tumör chuck, samt en enskild hög av tumör slurry vävnad, och försiktigt placera vävnaden i den skapade fickan.Tillsätt sedan 100 mikroliter av konstgjord extracellulär matris på tumörvävnadshögen i fickan. Med hjälp av två par tärna, dra upp snittet i båda ändarna så att såret kanterna kommer nära varandra. Applicera sedan ett eller två sårklämmor för att stänga såret.Subkutant injicera en till fem milligram per kilo smärtstillande. När läkning är helt, efter cirka sju dagar, ta bort sårklämmorna. Övervaka möss en gång i veckan för att kontrollera om det finns påtagliga tumörer.När tumörer når en önskad volym, använd kirurgiska tes för att lyfta huden intill tumören av avlivade musen och göra en horisontell snitt med hjälp av böjda saxar. Använd en trubbig separationsteknik för att mobilisera huden på båda sidor av tumören och över tumören, utsätta tumören. Använd sax och en skalpell blad för att skilja tumören från fascian.Skär ut tumören och överför den till en steril Petriskål. Skär tumören i små bitar och ta bort nekrotisk vävnad från tumören. Att bank tumörvävnad för framtida implantation, ta två till tre små tumör bitar och finhacka dem i bitar mindre än en efter en millimeter.Överför all hackad vävnad till en två milliliter kryogen vile. Tillsätt en milliliter frysning media och blanda väl. Placera injektionsflaskan i en förkyld isopropanolbaserad cellfrysbehållare på torris, förvara behållaren i en frys med minus 80 grader Celsius över natten och överför sedan injektionsflaskan till lagring av flytande kväve.För att knäppa frysa vävnad för nedströms analyser, placera tumörvävnad bitar i en kryogen injektionsflaska, sätta kryogena avskyvärda i flytande kväve omedelbart, och lagra injektionsflaskan i en minus 80 grader Celsius frys. När tre olika metoder för växande tumör vävnad jämfördes, var enda cell suspension av tumörceller med användning av enzymatisk matsmältning mest framgångsrika. Förutom att möjliggöra snabbare tumörtillväxt, var det också tillräckligt för en inledande tumör som skall utökas till 10 till 20 möss, medan tumörchucken och slurrymetoden endast kan utökas till fem till 10 möss.Melanom patient-härledda xenograft modeller återspeglar ofta drogen känslighet patienten visas när på terapi. En xenograft härrör från melanom patient som ursprungligen svarat på en BRAF-hämmare, men i slutändan återfallit, visas också inledande känslighet för BRAF protein hämning, plus MEK kinas hämmare, men tumörerna slutligen återfallit. Det är viktigt att ta hand när man förbereder PDX vävnad för bank, eftersom detta kommer att säkerställa framgång i framtida PDX expansioner, terapi prövningar, samt karakterisering.Med PDX material, enda cell RNA sekvensering, hela exome sekvensering, och proteomic karakterisering, är bland de många metoder vårt labb utnyttjar att dissekera terapi motstånd. PDX-tekniken gör det möjligt för forskare att undersöka terapiresistens med hjälp av tumörceller som bättre rekapitulerar tumörbiologin hos en mänsklig patient i förhållande till traditionella cancermodeller som odlas på plast. Denna fördel möjliggör mer prediktiva insikter.Forskare bör alltid ta hand och använda biosäkerhet nivå två försiktighetsåtgärder vid hantering av tumörvävnad som härrör från en mänsklig patient.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utveckling och underhåll av en preklinisk patient Derived Tumör xenograft modell för undersökning av nya anti-cancerterapier

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumör Engraftment i en Xenograft musmodell av mänskliga mantelcellslymfom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Inrättandet av en primär kultur av patientderiverade mjukdelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom sfäroid hud modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patient-härledda ortotopiska xenograft-modeller för Human Urotelial cellkarcinom och kolorektal cancer tumörtillväxt och spontan metastaser

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Generering av en lever Ortoämne humant uvealt melanom xenograft plattform i Immunobristfällig möss

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Etablering och användning av patienthärledda xenograftmodeller av metastaser i centrala nervsystemet

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Bedömning av chimär antigenreceptor T-cellassocierad toxicitet med hjälp av en akut lymfoblastisk leukemi patient-härledd xenograftmusmodell

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...