Name: culturing and measuring fetal and newborn murine long bones
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

ونود ان نشكر الكسندرا جوينر علي دعمها عندما تم إنشاء هذا البروتوكول ، Edwina McGlinn ويي تشنغ تشانغ لتقاسم حمض الريتينويك. ويدعم المعهد الأسترالي للطب التجديدي بمنح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الاستراليه.

وينبغي تنفيذ جميع التجارب بعد المبادئ التوجيهية الحكومية والمؤسسية المحلية للتعامل الأخلاقي مع الماشية المختبرية.
1. التحضيرات قبل يوم ثقافة العظام
<ol><li>اعداد تزاوج الماوس موقوتة للحصول علي الاجنه والجراء من اليوم الجنيني 14.5 (ه 14.5) فصاعدا. ملاحظه: ثقافة العظام ا...

<ol>
	<li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endochondral+skeleton.">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).</li><li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+ossification:+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton.">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li><li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+chondrogenesis.">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+a+multi-functional+complex+organ:+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification.">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).</li><li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats.">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li><li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+1alpha,+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora.">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).</li><li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage.">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography.">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li><li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals:+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification.">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies.">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone &amp; Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions.">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).</li><li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways.">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).</li><li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice.">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates.">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system.">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).</li><li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage.">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression.">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li><li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis.">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li><li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance.">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li><li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).</li><li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes.">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li><li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+strain+history+of+bone:+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains.">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li><li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain.">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li></ol>

وقد استخدمت العظام السابقين الجسم الحيوي أساليب الثقافة لبعض الوقت لتقييم بيولوجيا نمو العظام28, ولكن نادرا ما طبقت علي العظام الطويلة murine. مع تطوير تقنيات التصوير ، تقدم ثقافة العظام السابقة الفيفو طريقه جذابة لدراسة نمو العظام في الوقت الحقيقي في وضع يشبه بشكل وثيق في ظروف ?...

نمو الجهاز يجب ان يتم ضبطها باحكام لمنع ظهور اضطرابات النمو, وينطوي علي تنظيم أنواع متعددة من الخلايا, المسارات الجزيئية والمتقاطعة بين أجزاء مختلفه من الجسم. تقنيات التصوير ضرورية لمعالجه التغيرات التي تحدث مع مرور الوقت في الاجنه المتنامية ، في الظروف العادية ، وكذلك بعد الاضطراب المستحث في النظام. الاجنه مع النمو في الرحم ، مثل نماذج القوارض المستخدمة علي نطاق واسع ، تشكل تحديا إضافيا للتصوير الحي والعلاج من المخدرات ، والتي يمكن التغلب عليها جزئيا عن طريق استخدام تقنيات الثقافة المجرية السابقة. لتلخيص بنجاح في العمليات المجرية والحصول علي نتائج ذات مغزى ، يصبح من الضروري العثور علي الظروف المناسبة لزراعه لكل عضو أو الانسجه.
تنمو معظم عظام الهيكل العظمي الثدييات من خلال تعظم داخل التحجر ، حيث الغضروف الجنيني (تتالف من خلايا تسمي غضروفي) محركات النمو الطولي ويتم استبدال تدريجيا بالعظم. تحدث هذه العملية في لوحات النمو ، وتقع في نهاية العظام الطويلة ، حيث يمكن تمييز ثلاث مناطق: يستريح ، التكاثري ، وفرط التغذية1،2. أولا ، غضروفي الطليعة المستديرة في الانتقال إلى منطقه الراحة في الغضروفي عمودي الدراجات في المنطقة التكاثرية. خلال المرحلة التالية من التمايز ، وهذه غضروفي تصبح فرط التغذية والبدء في إفراز نوع X الكولاجين. الغضروفي المفرطة تنسق الخطوات التالية من التحجر: انها تفرز جزيئات الإشارات الرئيسية ، مثل عامل نمو النسيج الضام ، والبروتينات العظمية والقنفذ الهندي ، وتوجيه المعادن من المصفوفة ، وتجنيد الاوعيه الدموية إلى الجزء الأوسط من العظم ، وعند موت الخلايا المبرمج ، والسماح عظم (العظام تشكيل الخلية) لغزو المصفوفة لتشكيل مركز التحجر الابتدائي3،4. المصفوفة المعدنية تسهل تغلغل الاوعيه الدموية التي من خلالها عظم تهاجر لتحل محل هذا الغضروف المتدهور مع مصفوفة العظام5. معظم عظم تغزو مصفوفة الغضروف من البيريتشوندريوم ، طبقه ليفية التي يلتف الغضروف6. بدلا من ذلك ، فان نسبه من فرط الغضروفي قادره علي البقاء علي قيد الحياة والتفريق إلى عظم7،8،9. ويرجع الطول النهائي للعظام إلى النمو المتراكم للغضروف العابر ، الذي يعتمد معدل نموه بدوره علي عدد وحجم الغضروفي التضخمية ، وإنتاج مصفوفة10. بالاضافه إلى ذلك, وقد تبين مؤخرا ان مده المرحلة الاخيره تضخم يرتبط مع الطول النهائي للعظام11. ولذلك ، فان التنظيم المحكم لانتشار وتمايز هذه الخلايا مطلوب لضمان الحجم السليم للعظام.
علي الرغم من المعرفة الكبيرة التي اكتسبت علي مر السنتين علي تنظيم وتطوير لوحات النمو ، وتستند معظم هذه الاستنتاجات علي مراقبه الأقسام النسيجية الثابتة. يوفر المناديل الورقية معلومات قيمه حول هذه العملية ، ولكن يمكن ان تكون مليئه التحف الفنية ، لذلك لا يمكن ان تكون دائما تستخدم بشكل موثوق لتقدير التغيرات المورفولوجية أو حجم بين مراحل مختلفه. بالاضافه إلى ذلك ، مع نمو العظام هو عمليه ديناميكية ، والصور الثابتة ثنائيه الابعاد (2D) تقدم نظره محدوده في حركه الخلايا في لوحه النمو ، في حين ان التصوير الفاصل الزمني علي الانسجه الحية يمكن ان توفر معلومات قيمه عن سلوك غضروفي في لوحه النمو.
كل هذه القيود يمكن حلها باستخدام ثقافات العظام الجسم السابق. في حين تم تطوير بروتوكولات ثقافة العظام منذ بعض الوقت ، فقد تم تطبيقها بشكل محدود علي العظام الطويلة للمونين. معظم الدراسات استخدام العظام الفرخ بسبب المزايا التقنية التي تقدمها الفرخ نموذج12,13. طبقت ثقافات [ارغميك] (هواء/سائله واجهه) كان إلى فرخ [فيورس] جنينيه, اي كان حافظت في ثقافة ل 10 أيام14. الاداات الوراثية المتطورة المتاحة في الماوس جعل هذا النموذج جذابة جدا لاستخدامها في ثقافة العظام الجسم السابق. الدراسات التي استخدمت الفئران للنظر في نمو العظام عملت في الغالب مع عظام المشط15, ربما بسبب صغر حجمها والحصول علي اعداد أكبر لكل جنين16. علي الرغم من ان تعتبر تقليديا العظام الطويلة ، والمشط دخول الشيخوخة (تتميز بانخفاض الانتشار والتفاف من لوحه النمو17) في وقت سابق من العظام الطويلة الأخرى في الجسم الآخر ، التالي نموها المستمر السابق الفيفو لا تلخيص حقا في عمليه الجسم المجري. لأغراض هذه المادة ، وسوف نستخدم مصطلح عظام طويلة للعظام من مناطق الأطراف القريبة والمتوسطة. استخدمت العديد من الدراسات السابقة العظام murine طويلة ، مثل الساق ، في الثقافات السابقة المجرية ولاحظت نموا كبيرا في الغضروف ولكن التحجر قليلا18. كما استخدمنا الظنبوبي الثقافات مؤخرا ، أساسا لدراسة ديناميات غضروفي19. دراسات أخرى استخدمت رؤوس الفخذ من الفئران الصغيرة20 أو فقط الجزء البعيد من عظم الفخذ للثقافة21. بعض أكثر الاعمال الاخيره بنجاح الجمع بين الثقافة الحية السابقة من العظام الكامل مع التصوير الفاصل الزمني للحصول علي ثلاثه ابعاد (3d) الأفلام من غضروفي في انسجه الفار المعيشة22,23. وتمكن المؤلفون من مراقبه الاحداث التي لم يلاحظها أحد في السابق في أعاده ترتيب الغضروفي إلى المنطقة التكاثرية23 في مثال جيد للتطبيق المحتمل لثقافة العظام السابقة المجرية. والبديل ، اي تحليل الصور الثابتة ، يتطلب تقنيات غير مباشره ومعقده. وقد تجسد ذلك في دراسة أجريت مؤخرا لتقييم اهميه المستنسخات الموجهة عبر الطريق لنمو الغضروف ، حيث استخدمت التتبع الجيني مع سلالات الفئران متعددة ألوان المراسلة مع النمذجة الرياضية24. ولذلك ، فان ثقافة الجسم الحي السابق قد تساعد في اكتساب نظره ثاقبه علي العمليات الديناميكية بطريقه أسرع وأكثر وضوحا.
هنا ، نقدم طريقه للثقافة العظام الطويلة murine ، والتي يمكن الجمع بينها مع العلاجات الجزيئية المختلفة و/أو مع التصوير الحي الفاصل الزمني. يتكيف هذا البروتوكول مع الأساليب المستخدمة في التقارير السابقة15،18،25، ولكنه يعالج بعض القضايا الاضافيه ويركز علي عظام طويلة مثل عظم الساق ، بدلا من عظام المشط. وأخيرا ، فانه يستكشف إمكانات استخدام المقارنات المزدوجة القوية إحصائيا عن طريق ذبح العظام اليمني واليسرى بشكل منفصل في وجود مواد مختلفه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS 61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:132px;">Adobe</td>
			<td>CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Base unit for the scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>435425-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Betaglycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Binocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">STEMI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v</td>
			<td style="width:132px;">Roche/Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DigiRetina 500 camera</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Dissection kit</td>
			<td style="width:132px;">Cumper Robbins</td>
			<td style="width:119px;">PFS00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMSO</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Eppendorf 2-mL tubes</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:132px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">159010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Forceps Dumont#5 Inox08</td>
			<td style="width:132px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">T05811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heracell 150 CO2 incubator</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Multiwell 24 well</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped</td>
			<td style="width:132px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Syringe filter 0.2 um&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Terumo syringe 20 mL</td>
			<td style="width:132px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">DVR-5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tretinoin (retinoic acid)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHR1187-3X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Trinocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;">AZS400T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and measuring fetal and newborn murine long bones

العظام الطويلة هي هياكل معقده وديناميكية ، والتي تنشا من تعظم داخل التحجر عن طريق الغضروف المتوسط. الوصول المحدود إلى العظام البشرية السليمة يجعل استخدام نماذج الثدييات ، مثل الفار والفئران ، قيمه خاصه للنظر في جوانب مختلفه من نمو العظام والتوازن. بالاضافه إلى ذلك ، فان تطوير الاداات الوراثية المتطورة في الفئران يسمح باجراء دراسات أكثر تعقيدا لنمو العظام الطويل ويطلب التوسع في التقنيات المستخدمة لدراسة نمو العظام. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لثقافة العظام السابقة الجسم الفيفو ، والذي يسمح بدراسة العظام والغضروف بطريقه تسيطر عليها باحكام بينما يلخص معظم عمليه في الجسم المجري. الطريقة الموصوفة تسمح بثقافة مجموعه من العظام ، بما في ذلك عظم الساق ، عظم الفخذ ، وعظام المشط ، ولكننا نركز بشكل رئيسي علي الثقافة الظنبوبيه هنا. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدامه بالاقتران مع التقنيات الأخرى ، مثل التصوير الحي الفاصل الزمني أو العلاج بالعقاقير.

يمكن اجراء ثقافة العظام بدءا من مراحل مختلفه. في الشكل 1A-D، يتم عرض مقارنه بين الساق مثقف والمستخرجة حديثا في مراحل مماثله. الملاحظة الاولي هي ان ما يصل إلى يومين من الثقافة الحجم الذي حققه هو مماثل لنمو العظام في الجسم المادي لكل من الغضروف والعظ?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

زراعه وقياس الجنين والوليد العظام الطويلة Murine

هنا ، نقدم طريقه للثقافة المجرية السابقة للعظام طويلة murine في مرحلتي الجنين وحديثي الولادة ، ومناسبه لتحليل العظام والغضروف التنمية والتوازن في الظروف التي تسيطر عليها في حين تلخيص عمليه في الجسم المجري.

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

هذه الطريقة تتكيف بروتوكول ثقافة مشط القدم إلى عظام أكبر، مما يسمح بالتلاعب المباشر في العظام بأن يتم دمجه مع النماذج الوراثية المعقدة لمعالجة العمليات المتعلقة بتطوير العظام. هذه التقنية تسمح بالتلاعب وتحليل نمو العظام غير الممكن في الجسم الحي ، مثل التصوير الحي أو التلاعب البدني والصيدلاني المباشر. تسمح هذه الطريقة السابقة لثقافة الجسم الحي بدراسة محددة للآثار المحلية للدين الوراثي في العظام التي تفصلها عن التأثير الجهازي للعلاج على الكائن الحي.تبدأ بتعقيم منطقة البطن من الحمل الحملي يوم 14.5 إلى 18.5 الماوس مع 80٪ الإيثانول واستخدام مقص صغير لفتح الجلد وعضلات البطن للوصول إلى قرون الرحم. لاستخراج الرحم من تجويف البطن، وإزالة mesometrium وقطع قاعدة قرون. ثم، نقل الرحم إلى طبق بتري 60 ملليمتر يحتوي على الجليد الباردة تشريح المتوسطة على الجليد.في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية قطع بين أكياس مع مقص لفصل الأجنة الفردية، ونقل كيس الفردية في طبق جديد 60 ملليمتر مع تشريح المتوسطة الطازجة تحت مجهر ستيريو تشريح. استخدم الملاقط لفصل الأجنة عن المشيمة وتنظيف الأجنة من الأغشية. استخدم ماصة بلاستيكية مشذبة لنقل الجسم إلى طبق جديد من 60 ملليمترًا، وقطع رأس الجنين قبل المزيد من التشريح.ثم استخدام ملاقط لإزالة الجلد، بدءا من الخلف وتقشير إلى أصابع الأقدام. استخدمي الملاقط لقطعها على مقربة من العمود الفقري وفصل الأطراف الخلفية عن الجسم. نقل أطرافه الخلفية إلى طبق نظيف يحتوي على الجليد الباردة تشريح المتوسطة، وإدراج الملاقط بين الغضروف السطحي لعظم الفخذ و شبه الساق لفصل الساق من عظم الفخذ.إزالة عظام الورك من عظم الفخذ القريب وعظمة كالكانيوس والشظية من الساق. قضم بعناية وسحب الأنسجة الرخوة من عظم الفخذ والقدمين واستخدام ماصة معقمة واحدة ملليلتر لنقل جميع عظام الساق الأربعة إلى البئر الأول من لوحة 24-well التي تحتوي على وسيلة تشريح جديدة. من المهم أن تظهر أن الأنسجة الرخوة التي تربط نبض العظام تتم إزالتها.خلاف ذلك، فإن العظام ينحني وعدم تحقيق النمو السليم. عندما تم تشريح العظام من العدد التجريبي المناسب من الأجنة، صورة العظام في كل بئر في أوقات صفر تحت مجهر خفيف مع تباين جيد واستبدال وسيط التشريح في كل بئر مع ملليلتر واحد من متوسطة الثقافة في بئر مع مزيد من الحذر لا لpirate العظام. لمراقبة تأثير تثبيط النمو في ظروف الثقافة، علاج الساق اليسرى مع 500 نانومولار حمض الريتينويك واحتضان الساق اليمنى مع حجم مكافئ من السيارة كتحكم.ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية تحت ظروف ثقافة الخلية القياسية. بعد يومين, علاج العظام مع التناظرية thymidine مناسبة لمدة ساعة إلى ساعتين لتقييم انتشار الخلايا العظمية قبل نقل العظام إلى أنابيب ميليلتر الفردية من 4٪ شبه شكلي لمدة 10 دقائق. ثم، نقل العظام إلى برنامج تلفزيوني لتصوير العظام في نقطة الوقت النهائي قبل إعادة العينات إلى شبه شكلي لل التثبيت بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.لقياس طول المنطقة معدن العظام، وفتح برنامج التصوير المناسب، ومع الأخذ في الاعتبار حجم الصورة، وقياس طول كل من الطول الكلي للعظم، والمنطقة معدن. بدء القياسات من الخلايا الداكنة الأولى في نهاية واحدة حتى الخلايا المظلمة الأخيرة في الطرف الآخر. لحساب معدل النمو الذي يعرف بأنه متوسط الزيادة في الطول في اليوم الواحد، قم بتقسيم الفرق بين الطول النهائي للعظم والطول الأولي على عدد الأيام في الثقافة.هنا، تظهر مقارنة بين الساق المستزرعة والساق المستخرجة حديثا في مراحل مماثلة. بعد ما يصل إلى يومين من الثقافة، وحجم ما تحقق هو مماثل لنمو العظام في الجسم الحي لكل من الغضاريف والعظام المعدنية. فترات أطول ثقافة تؤدي إلى اختلافات أكبر بين العظام المستزرعة والعظام المستخرجة حديثا.لاحظ أن الساق نمت مع إزالة غير مكتملة من الأنسجة الرخوة يمكن أن يؤدي إلى الانحناء من الساق المستزرعة. العلاج بحمض الريتينويك له تأثير قوي على نمو التيبال في وقت مبكر من بعد يومين من العلاج. على الرغم من وجود زيادة ثابتة في الطول الإجمالي لل الساق بعد يومين في الثقافة، وهذا النمو يقابل زيادة تقريبية من تسعة إلى 29٪ فقط من طول الأولي.أقل من زيادة نمو العظام التي من شأنها أن تكون لاحظت في الجسم الحي. في الواقع، thymidine التناظرية التسمية يظهر عدد أقل من الخلايا الإيجابية في هذه المنطقة بعد الثقافة مقارنة بالعظام المستخرجة حديثا من مرحلة مماثلة. علاوة على ذلك ، في الساق المستزرعة في المختبر ، يزداد الطول الإجمالي للعنصر الهيكلي بشكل كبير ، في حين لا يلاحظ أي زيادة تقريبًا في المنطقة المعدنية.بالإضافة إلى التحليل النسيجي والجزيئي، يمكن إجراء إزالة الصور والتصوير ثلاثي الأبعاد بعد الثقافة لتوصيف التأثير الخلوي للعلاجات المطبقة على العظام المستزرعة. هذه التقنية تسمح لنا بمعالجة الأسئلة المتعلقة بالاتصالات بين اللجان. على سبيل المثال، من خلال زراعة العظام المشتركة من النماذج الوراثية المختلفة في نوع من تجربة الباروبيسيس الخالية من الألم.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

زراعة متعددة القدرات البشرية والعصبية الخلايا الجذعية في نظام زراعة الخلايا المغلقة للبحوث الأساسية وقبل السريرية

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

الآثار السلوكية والإنجابية الطويلة الأجل الجنينية التعرض لجرعة منخفضة سميات

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

العدوى بفيروس زكى من الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري مثقف لتحليل إيمونوسيتوتشيميكال

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

القلب والأوعية الدموية التصوير باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالية التردد (MHZ 30/45) الجنينية الماوس

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي في الرحم زرع في نموذج مورين

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

الموجات فوق الصوتية عالية التردد لتحليل وضع الجنين والمشيمة في فيفو

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...