Name: culturing and measuring fetal and newborn murine long bones
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Vi vil gerne takke Alexandra Joyner for hendes støtte, da denne protokol blev etableret, Edwina McGlinn og Yi-Cheng Chang for at dele retinoinsyre. Den australske regenerative Medicine Institute er støttet af tilskud fra staten regeringen i Victoria og den australske regering.

Alle forsøgene bør gennemføres efter de lokale statslige og institutionelle retningslinjer for etisk håndtering af forsøgsdyr.
1. forberedelser forud for dagen for knogle kultur
<ol><li>Indstil tidsindstillede muse parring for at opnå fostre og unger fra embryonale dag 14,5 (E 14.5) og fremefter. Bemærk: Kulturen i lange knogler kan med held anvendes til forskellige muse stammer; i denne protokol, er udavlede schweiziske Webster Wild-type mus anvendes.</li>
	<li>Fo...

<ol>
	<li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endochondral+skeleton.">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).</li><li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+ossification:+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton.">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li><li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+chondrogenesis.">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+a+multi-functional+complex+organ:+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification.">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).</li><li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats.">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li><li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+1alpha,+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora.">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).</li><li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage.">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography.">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li><li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals:+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification.">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies.">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone &amp; Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions.">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).</li><li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways.">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).</li><li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice.">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates.">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system.">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).</li><li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage.">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression.">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li><li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis.">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li><li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance.">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li><li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).</li><li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes.">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li><li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+strain+history+of+bone:+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains.">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li><li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain.">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li></ol>

Knogle ex vivo kultur metoder har været anvendt i nogen tid til at vurdere biologi knoglevækst28, men har været sjældent anvendt til murine lange knogler. Med udviklingen af billedbehandlings teknikker, tilbyder ex vivo knogle kultur en attraktiv måde at studere knoglevækst i realtid i en indstilling, der ligner de in vivo betingelser. I dette scenario er det vigtigt at definere de betingelser, hvorunder væksten af lange knogler er sammenlignelig med deres vækst in vivo.
<p class="jove...

Organ vækst skal være stramt afstemt for at forhindre fremkomsten af vækstforstyrrelser, og indebærer regulering af flere celletyper, molekylære veje og krydstale mellem forskellige dele af kroppen. Imaging teknikker er afgørende for at løse de ændringer, der sker over tid i et voksende embryo, både under normale forhold, samt efter et forstyrrelse er induceret i systemet. Embryoner med intrauterin udvikling, såsom de udbredte gnaver modeller, udgør en yderligere udfordring for levende billedbehandling og narkotikabehandling, som kan delvist overvindes ved hjælp af ex vivo kultur teknikker. For at kunne rekapitulere in vivo processer og opnå meningsfulde resultater, bliver det afgørende at finde de rigtige dyrkningsbetingelser for hvert organ eller væv.
De fleste knogler i pattedyrs skelet vokser gennem endokondral ossifikation, hvor den embryonale brusk (sammensat af celler kaldet chondrocytter) driver langsgående vækst og gradvist erstattes af knogle. Denne proces sker på vækst pladerne, placeret i slutningen af de lange knogler, hvor tre zoner kan skelnes: hvile, proliferative, og hypertrofisk1,2. Første, den runde progenitorchondrocytter i hvile zonen overgang til cykling enkelt kolonne chondrocytter i den proliferativ zone. I den næste fase af differentiering, disse chondrocytter bliver hypertrofisk og begynde at udskilning type X kollagen. Hypertrofiske chondrocytter organiserer de efterfølgende trin af ossifikation: de udskiller vigtige signalerings molekyler, såsom bindevævs vækstfaktor, knogle morfogenetiske proteiner og indisk pindsvin, og direkte mineralisering af matrixen, rekruttere blodkar til den centrale del af knoglen, og ved apoptose, tillade osteoblaster (knogledannende celler) at invadere matrixen til at danne den primære ossifikation Center3,4. Den mineraliserede matrix letter indtrængning af blodkar, hvorigennem osteoblaster migrerer for at erstatte denne nedbrudte brusk med en knoglematrix5. De fleste osteoblaster invaderer brusk matrixen fra perikondrium, et fibrøst lag, der omslutter brusk6. Alternativt, en andel af hypertrofisk chondrocytter er i stand til at overleve og omdifferentiere til osteoblaster7,8,9. Den endelige længde af knoglen skyldes den akkumulerede vækst af den forbigående brusk, hvis vækstrate igen afhænger af antallet og størrelsen af hypertrofisk chondrocytter, og deres matrix produktion10. Derudover, det blev for nylig vist, at varigheden af den sidste hypertrofi fase korrelerer med den endelige længde af knoglen11. Derfor er der behov for stram regulering af spredningen og differentieringen af disse celler for at sikre korrekt knogle størrelse.
På trods af den betydelige viden, der i årenes løb er opnået om vækst plades organisation og udvikling, er de fleste af disse konklusioner baseret på observation af faste histologiske sektioner. Vævs skæring giver værdifulde oplysninger om denne proces, men kan rides med tekniske artefakter, så det kan ikke altid pålideligt bruges til at estimere morfologiske eller størrelsesændringer mellem forskellige stadier. Desuden, som knoglevækst er en dynamisk proces, de statiske to-dimensionelle (2D) billeder giver et begrænset indblik i bevægelsen af cellerne i vækstpladen, mens time-lapse Imaging på levende væv kunne tilbyde værdifulde oplysninger om opførsel af chondrocytter i vækstpladen.
Alle disse begrænsninger kan potentielt løses ved hjælp af ex vivo knogle kulturer. Mens knogle kultur protokoller er blevet udviklet for nogen tid siden, blev de begrænset anvendt til murine lange knogler. De fleste af undersøgelserne bruger chick knogler på grund af de tekniske fordele, der tilbydes af chick model12,13. Organotypiske kulturer (luft/flydende grænseflade) blev anvendt til chick embryonale femurs, som blev opretholdt i kultur i 10 dage14. De sofistikerede genetiske værktøjer til rådighed i mus gør denne model meget tiltalende at blive brugt i ex vivo knogle kultur. De undersøgelser, der brugte mus til at se på knoglevækst arbejdede mest med metatarsal knogler15, sandsynligvis på grund af deres lille størrelse og større antal opnået pr. embryo16. Selv om traditionelt betragtes lange knogler, metatarsi indtaste senescens (karakteriseret ved reduceret proliferation og involution af vækstpladen17) tidligere end andre lange knogler in vivo, og derfor deres fortsatte vækst ex vivo ikke virkelig rekapitulere in vivo-processen. Med henblik på denne artikel, vil vi bruge udtrykket lange knogler til knogler fra den proximale og mellemliggende lemmer regioner. Flere tidligere undersøgelser anvendte lange murine knogler, såsom skinneben, i ex vivo kulturer og observerede en betydelig vækst i brusk, men lidt ossifikation18. Vi har også brugt tibial kulturer for nylig, primært at studere Chondrocyt dynamik19. Andre undersøgelser anvendte femoral hoveder fra unge mus20 eller kun den distale del af femur for kultur21. Nogle nyere værker med held kombinere ex vivo kultur af fuld knogler med time-lapse Imaging til at erhverve tre-dimensionelle (3D) film af chondrocytter i levende muse vævet22,23. Forfatterne formåede at observere tidligere ubemærkede begivenheder i omorganiseringen af chondrocytter til den proliferativ zone23 i et godt eksempel på den potentielle anvendelse af knogle ex vivo kultur. Alternativet, dvs analysere statiske billeder, kræver indirekte og komplekse teknikker. Dette blev eksemplificeret ved en nylig undersøgelse, der vurderede betydningen af transversally-orienterede kloner for brusk vækst, hvor genetisk sporing med multifarvet reporter muse stammer kombineret med matematisk modellering blev brugt24. Derfor kan ex vivo-kulturen hjælpe med at få indblik i dynamiske processer på en hurtigere og mere ligetil måde.
Her præsenterer vi en metode til murine lange knogler kultur, som kan kombineres med forskellige molekylære behandlinger og/eller med time-lapse Live imaging. Denne protokol tilpasser de metoder, der anvendes i tidligere rapporter15,18,25, men løser nogle yderligere problemer og fokuserer på lange knogler såsom skinneben, snarere end metatarsal knogler. Endelig udforsker det potentialet ved at bruge statistisk kraftfulde parrede sammenligninger ved at kulturere venstre og højre knogler separat i tilstedeværelsen af forskellige stoffer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS 61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:132px;">Adobe</td>
			<td>CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Base unit for the scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>435425-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Betaglycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Binocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">STEMI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v</td>
			<td style="width:132px;">Roche/Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DigiRetina 500 camera</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Dissection kit</td>
			<td style="width:132px;">Cumper Robbins</td>
			<td style="width:119px;">PFS00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMSO</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Eppendorf 2-mL tubes</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:132px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">159010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Forceps Dumont#5 Inox08</td>
			<td style="width:132px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">T05811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heracell 150 CO2 incubator</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Multiwell 24 well</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped</td>
			<td style="width:132px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Syringe filter 0.2 um&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Terumo syringe 20 mL</td>
			<td style="width:132px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">DVR-5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tretinoin (retinoic acid)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHR1187-3X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Trinocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;">AZS400T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and measuring fetal and newborn murine long bones

Lange knogler er komplekse og dynamiske strukturer, som opstår fra endokondral ossifikation via en brusk mellemprodukt. Den begrænsede adgang til sunde menneskelige knogler gør særlig værdifuld brug af pattedyr modeller, såsom mus og rotte, for at se på forskellige aspekter af knoglevækst og homøostase. Derudover, udvikling af sofistikerede genetiske værktøjer i mus giver mere komplekse undersøgelser af lang knoglevækst og beder om en udvidelse af teknikker, der anvendes til at studere knoglevækst. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for ex vivo murine knogle kultur, som tillader studiet af knogle og brusk på en stramt kontrolleret måde, mens rekapitulere det meste af in vivo-processen. Den beskrevne metode tillader kulturen i en række knogler, herunder skinneben, femur og metatarsale knogler, men vi har primært fokuseret på tibial kultur her. Desuden kan det bruges i kombination med andre teknikker, såsom time-lapse levende billedbehandling eller narkotikabehandling.

Knogle kultur kan udføres startende fra forskellige stadier. I figur 1a-Dvises en sammenligning mellem kultiveret skinneben og frisk ekstraherede på tilsvarende stadier. Den første observation er, at op til to dages kultur den opnåede størrelse er sammenlignelig med in vivo knoglevækst for både brusk og mineraliseret knogle (figur 1a, B, D). Længere kultur perioder fører til større fors...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Kulturering og måling af føtal og nyfødte murine lange knogler

Her præsenterer vi en metode til ex vivo kultur af lange murine knogler på både føtale og nyfødte stadier, egnet til at analysere knogle-og brusk udvikling og homøostase under kontrollerede forhold, mens rekapitulere in vivo-processen.

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Denne metode tilpasser metatarsal kultur protokol til større knogler, så direkte knogle manipulation, der skal kombineres med komplekse genetiske modeller til at løse processer relateret til knogleudvikling. Denne teknik tillader manipulation og analyse af knoglevækst, der ikke er muligt in vivo, såsom levende billeddannelse eller direkte fysisk og farmakologisk manipulation. Denne ex vivo kultur metode giver mulighed for specifik undersøgelse af de lokale virkninger af den genetiske indstænkning i knoglen adskiller det fra den systemiske effekt behandlingen har på organismen.Begynd med at sterilisere maveregionen af en gravid svangerskabsdag 14,5 til 18,5 mus med 80% ethanol og bruge små saks til at åbne huden og mavemusklerne for at få adgang til livmoderhorn. For at udtrække livmoderen fra bughulen, fjerne mesometrium og skære bunden af hornene. Derefter overføreuter til en 60 millimeter petriskål, der indeholder iskold dissektion medium på is.I et biosikkerhedsskab skåret mellem sækkene med en saks for at adskille de enkelte fostre og overføre en individuel sæk til en ny 60 millimeter skål med frisk dissektionsmedium under et dissektionsteremikroskop. Brug en pincet til at adskille fostre fra moderkagen og til at rense fostre fra membranerne. Brug en trimmet plastpipette til at overføre kroppen til en ny 60 millimeter skål, og halshugge fosteret før yderligere dissektion.Brug derefter pincet til at fjerne huden, startende fra bagsiden og peeling ud til tæerne. Brug pincet til at skære tæt på rygsøjlen og adskille bag lemmer fra kroppen. Overfør baglestremerne til en ren skål, der indeholder iskold dissektion medium, og indsæt pincet mellem overfladen brusk af det distale lårben og det proksimale skinneben til at adskille skinnebenet fra lårbenet.Fjern hofteknoglerne fra det proksimale lårben og calcaneusknoglen og fibulaen fra skinnebenet. Forsigtigt nip og trække det bløde væv fra lårben og skinneben og bruge en steril en-milliliter pipette til at overføre alle fire ben knogler i den første brønd af en 24-brønd plade, der indeholder frisk dissektion medium. Det er vigtigt at vise, at det bløde væv, der forbinder knoglens puls, fjernes.Ellers vil knoglen bøje og ikke opnå ordentlig vækst. Når knoglerne er blevet dissekeret fra det passende eksperimentelle antal fostre, billede knoglerne i hver brønd til tider nul under en lys mikroskop med en god kontrast og erstatte dissektion medium i hver brønd med en milliliter kultur medium per godt at tage ekstra omhu for ikke at aspirere knoglerne. At observere effekten af væksthæmning i kulturbetingelserne, behandle venstre skinneben med 500 nanomolar retinsyre og inkubere højre skinneben med en tilsvarende mængde køretøj som en kontrol.Placer derefter pladen i en cellekulturskuvøse under standardcellekulturforhold. Efter to dage behandles knoglerne med en passende thymidinanalogi i en til to timer for at vurdere knoglecelleproliferation, før knoglerne overføres til individuelle to milliliterrør på 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Overfør derefter knoglerne til PBS for at afbilde knoglerne på det sidste tidspunkt, før prøverne returneres til paraformaldehyd til natfiksering ved fire grader Celsius.For at måle længden og mineraliseret region af knoglerne, åbne en passende billedbehandling software program, og under hensyntagen til omfanget af billedet, måle både den samlede længde af knoglen, og mineraliseret region. Start af målingerne fra de første mørke celler i den ene ende til de sidste mørke celler i den anden ende. For at beregne vækstraten, der defineres som den gennemsnitlige stigning i længden pr. dag, divideres forskellen mellem knoglens endelige længde og den oprindelige længde med antallet af dyrkede dage.Her vises en sammenligning mellem kultiveret skinneben og friskudvundet skinneben på tilsvarende stadier. Efter op til to dages kultur kan den opnåede størrelse sammenlignes med in vivo knoglevæksten for både brusk og mineraliseret knogle. Længere kulturperioder fører til større forskelle mellem de dyrkede knogler og friskudtænte knogler.Bemærk, skinnebenet dyrket med en ufuldstændig fjernelse af det bløde væv kan resultere i bøjning af den dyrkede skinneben. Behandling med retinsyre har en robust effekt på den tibial vækst så tidligt som efter to dages behandling. Selv om der er en konsekvent stigning i skinnebenets samlede længde efter to dages kultur, svarer denne vækst til en omtrentlig stigning på kun ni til 29% fra den oprindelige længde.Mindre end knoglevækst stigning, der ville blive observeret in vivo. Faktisk thymidin analog mærkning viser færre positive celler i denne region efter kultur i forhold til friskudvundet knogler af en tilsvarende fase. Endvidere, i in vitro dyrket skinneben, den samlede længde af skeletelementet stiger betydeligt, mens næsten ingen stigning i mineraliserede region er observeret.Ud over histologisk og molekylær analyse, clearing og 3D-billeddannelse kan udføres efter kulturen til at karakterisere cellulære effekt af de behandlinger, der anvendes til de dyrkede knogler. Teknikken giver os mulighed for at behandle spørgsmål i forbindelse med interorganal kommunikation. For eksempel ved co-culturing knogler fra de forskellige genetiske modeller i en slags smertefri parabiose eksperiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering af Mesenchymale stromacellers fra human navlestrengen og føtalt Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En simpel afdeling til langvarig konfokal billeddannelse af rod- og hypokotyludvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Langsigtede adfærdsmæssige og reproduktiv konsekvenser af embryonale eksponering for lav-dosis giftige stoffer

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation og dyrkning af primære humane keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infektion af kulturperler menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller til andre analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Føtal mus kardiovaskulære Imaging ved hjælp af en høj frekvens ultralyd (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolation og kultur af primær epikardielle celler, der stammer fra menneskelige voksen og fostrets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-fostervand In Utero Transplantation i Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Høj frekvens ultralyd til analyse af føtal og placenta udvikling In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...