Name: culturing and measuring fetal and newborn murine long bones
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Wij willen Alexandra Joyner bedanken voor haar steun toen dit protocol werd opgericht, Edwina McGlinn en Yi-Cheng Chang voor het delen van retinol zuur. Het Australische regeneratieve geneeskunde Instituut wordt gesteund door subsidies van de staatsoverheid van Victoria en de Australische overheid.

Alle experimenten moeten worden uitgevoerd naar aanleiding van de lokale gouvernementele en institutionele richtsnoeren van de ethische behandeling van proefdieren.
1. preparaten voorafgaand aan de dag van de bone Culture
<ol><li>Instellen getimede muis paringen om foetussen en pups te verkrijgen van de embryonale dag 14,5 (E 14.5) en verder. Opmerking: De cultuur van lange beenderen kan met succes op verschillende muis spanningen worden toegepast; in het huidige protocol...

<ol>
	<li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endochondral+skeleton.">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).</li><li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+ossification:+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton.">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li><li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+chondrogenesis.">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+a+multi-functional+complex+organ:+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification.">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).</li><li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats.">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li><li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+1alpha,+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora.">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).</li><li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage.">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography.">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li><li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals:+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification.">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies.">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone &amp; Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions.">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).</li><li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways.">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).</li><li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice.">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates.">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system.">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).</li><li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage.">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression.">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li><li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis.">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li><li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance.">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li><li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).</li><li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes.">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li><li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+strain+history+of+bone:+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains.">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li><li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain.">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li></ol>

Been ex vivo cultuur methoden zijn gebruikt voor enige tijd om de biologie van de groei van de botten28te beoordelen, maar zijn zelden toegepast op muizen lange botten. Met de ontwikkeling van Imaging technieken biedt ex vivo Bone Culture een aantrekkelijke manier om de beengroei in real time te bestuderen in een omgeving die sterk lijkt op de in vivo omstandigheden. In dit scenario is het belangrijk om de omstandigheden te definiëren waarin de groei van lange botten vergelijkbaar is met hun groe...

De orgaan groei moet strak worden afgestemd om de verschijning van groei wanorde te verhinderen, en impliceert de verordening van veelvoudige cel types, moleculaire wegen en overspraak onder verschillende delen van het lichaam. Imaging technieken zijn essentieel om de veranderingen die zich na verloop van tijd in een groeiend embryo, zowel in normale omstandigheden, als na een verstoring wordt geïnduceerd in het systeem aan te pakken. Embryo's met intra-uteriene ontwikkeling, zoals de veelgebruikte knaagdieren modellen, presenteren een extra uitdaging voor Live Imaging en medicamenteuze behandeling, die gedeeltelijk kan worden overwonnen met behulp van ex vivo cultuurtechnieken. Om de in vivo processen succesvol te recapituleren en zinvolle resultaten te verkrijgen, wordt het cruciaal om de juiste kweken voorwaarden te vinden voor elk orgaan of weefsel.
De meeste botten van het zoogdier skelet groeien door endochondral ossificatie, waar het embryonale kraakbeen (bestaande uit cellen genaamd chondrocyten) drijft longitudinale groei en wordt geleidelijk vervangen door het bot. Dit proces gebeurt op de groei platen, gelegen aan het einde van de lange botten, waar drie zones kunnen worden onderscheiden: rusten, proliferatie, en hypertrofische1,2. Ten eerste, de ronde voorloper chondrocyten in de rustzone overgang naar de wieler zuil chondrocyten in de proliferative zone. Tijdens het volgende stadium van differentiatie, worden deze chondrocyten hypertrofische en beginnen afscheidend type X collageen. Hypertrofische chondrocyten orkestreren de daaropvolgende stappen van ossificatie: ze scheiden belangrijke signalering moleculen, zoals bindweefsel groeifactor, bot morfogenetische eiwitten en Indiase egel, en direct de mineralisatie van de matrix, werven de bloedvaten aan het centrale deel van het been, en, op apoptosis, staan osteoblasten (been-vormende cellen) toe om de matrijs binnen te vallen om het primaire ossificatie centrum te vormen3,4. De minerale matrix vergemakkelijkt de penetratie van de bloedvaten waardoor osteoblasten migreren naar dit gedegradeerde kraakbeen te vervangen door een bone matrix5. De meeste osteoblasten binnenvallen het kraakbeen matrix van de perichondrium, een vezelige laag die het kraakbeen wraps6. Als alternatief, een deel van hypertrofische chondrocyten zijn in staat om te overleven en te transdifferentiëren naar osteoblasten7,8,9. De uiteindelijke lengte van het bot is te wijten aan de geaccumuleerde groei van de voorbijgaande kraakbeen, waarvan de groei op zijn beurt afhankelijk van het aantal en de grootte van de hypertrofische chondrocyten, en hun matrix productie10. Bovendien werd onlangs aangetoond dat de duur van de laatste hypertrofie fase correleert met de uiteindelijke lengte van het bot11. Daarom, strakke regulering van de proliferatie en differentiatie van deze cellen is vereist om een goede been grootte te garanderen.
Ondanks de wezenlijke kennis die in de loop van de jaren op de organisatie en de ontwikkeling van de de groei platen wordt verworven, zijn het grootste deel van deze conclusies gebaseerd op de observatie van vaste histologische secties. De sectie van het weefsel verstrekt waardevolle informatie over dit proces, maar kan met technische artefacten worden gereden, zodat kan het niet altijd betrouwbaar worden gebruikt om morfologisch of grootte veranderingen tussen verschillende stadia te schatten. Bovendien, als bot groei is een dynamisch proces, de statische twee-dimensionale (2D) beelden bieden een beperkt inzicht in de beweging van de cellen in de groei plaat, terwijl time-lapse beeldvorming op levend weefsel kan waardevolle informatie over het gedrag van de te bieden chondrocyten in de groei plaat.
Al deze beperkingen kunnen mogelijk worden opgelost met behulp van ex vivo Bone cultures. Terwijl de bot-cultuur protocollen zijn enige tijd geleden ontwikkeld, werden ze beperkt toegepast op muizen lange botten. De meeste studies gebruiken kuiken beenderen toe te schrijven aan de technische voordelen die door het kuiken model worden aangeboden12,13. Organotypic culturen (lucht/Liquid Interface) werden toegepast op kuiken embryonale femur, die werden gehandhaafd in de cultuur voor 10 dagen14. De geavanceerde genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in de muis maken dit model zeer aantrekkelijk om te worden gebruikt in ex vivo Bone cultuur. De studies die muizen gebruikt om te kijken naar de groei van het bot werkte meestal met metatarsale Bones15, waarschijnlijk te wijten aan hun kleine omvang en grotere aantallen verkregen per embryo16. Hoewel traditioneel beschouwd als lange botten, metatarsi Voer senescentie (gekenmerkt door een verminderde proliferatie en verwikkeling van de groei plaat17) eerder dan andere lange botten in vivo, en dus hun voortdurende groei ex vivo niet echt recapituleren het in vivo proces. Voor de toepassing van dit artikel, zullen we gebruik maken van de term lange botten voor botten uit de proximale en tussenliggende ledematen regio's. Verscheidene vorige studies gebruikten lange muizen beenderen, zoals Tibia, in ex vivo culturen en waargenomen een wezenlijke groei van het kraakbeen maar weinig ossificatie18. We hebben ook gebruikt tibiaal culturen onlangs, vooral om te studeren chondrocyten Dynamics19. Andere studies gebruikt femorale hoofden van jonge muizen20 of alleen het distale deel van het dijbeen voor cultuur21. Sommige recentere werken combineren met succes de ex vivo cultuur van volledige botten met time-lapse Imaging om driedimensionale (3D) films van chondrocyten te verwerven in het levende muis weefsel22,23. De auteurs slaagden erin om eerder ongemerkte gebeurtenissen in de herschikking van chondrocyten aan de proliferative streek23 in een goed voorbeeld van de potentiële toepassing van been ex vivo cultuur in acht te nemen. Het alternatief, dat wil zeggen, het analyseren van statische beelden, vereist indirecte en complexe technieken. Dit werd geïllustreerd door een recente studie het beoordelen van het belang van dwars-georiënteerde klonen voor kraakbeen groei, waar genetische tracering met multicolor reporter muis stammen in combinatie met wiskundige modellering werden gebruikt24. Daarom kan de ex vivo cultuur helpen om inzicht te krijgen in dynamische processen op een snellere en meer eenvoudige manier.
Hier presenteren we een methode voor muizen lange botten cultuur, die kan worden gecombineerd met verschillende moleculaire behandelingen en/of met time-lapse Live Imaging. Dit protocol past de methoden die worden gebruikt in eerdere rapporten15,18,25, maar adressen enkele extra problemen en richt zich op lange botten, zoals het scheenbeen, in plaats van metatarsale botten. Ten slotte onderzoekt het het potentieel van het gebruik van statistisch krachtige gepaarde vergelijkingen door kweken links en rechts botten afzonderlijk in de aanwezigheid van verschillende stoffen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS 61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:132px;">Adobe</td>
			<td>CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Base unit for the scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>435425-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Betaglycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Binocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">STEMI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v</td>
			<td style="width:132px;">Roche/Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DigiRetina 500 camera</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Dissection kit</td>
			<td style="width:132px;">Cumper Robbins</td>
			<td style="width:119px;">PFS00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMSO</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Eppendorf 2-mL tubes</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:132px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">159010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Forceps Dumont#5 Inox08</td>
			<td style="width:132px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">T05811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heracell 150 CO2 incubator</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Multiwell 24 well</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped</td>
			<td style="width:132px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Syringe filter 0.2 um&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Terumo syringe 20 mL</td>
			<td style="width:132px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">DVR-5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tretinoin (retinoic acid)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHR1187-3X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Trinocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;">AZS400T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and measuring fetal and newborn murine long bones

Lange botten zijn complexe en dynamische structuren, die voortkomen uit endochondral ossificatie via een kraakbeen intermediair. De beperkte toegang tot gezonde menselijke botten maakt bijzonder waardevol het gebruik van zoogdieren modellen, zoals muis en rat, te kijken naar verschillende aspecten van de groei van botten en homeostase. Bovendien, de ontwikkeling van geavanceerde genetische hulpmiddelen in muizen maakt meer complexe studies van lange bot groei en vraagt om een uitbreiding van de technieken die worden gebruikt om de groei van botten te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor ex vivo muizen Bone Culture, die het mogelijk maakt de studie van bot en kraakbeen op een strak gecontroleerde wijze, terwijl Recapitulerend het grootste deel van de in vivo proces. De beschreven methode maakt de cultuur van een reeks van botten, met inbegrip van Tibia, femur, en metatarsale botten, maar we hebben vooral gericht op tibiaal cultuur hier. Bovendien kan het gebruikt worden in combinatie met andere technieken, zoals time-lapse Live Imaging of medicamenteuze behandeling.

De cultuur van het been kan beginnend van verschillende stadia worden uitgevoerd. In Figuur 1a-Dwordt een vergelijking weergegeven tussen gekweekte Tibia en vers geëxtraheerde exemplaren in gelijkwaardige stadia. De eerste waarneming is dat tot twee dagen van de cultuur van de bereikte grootte is vergelijkbaar met de in vivo bot groei voor zowel kraakbeen en mineraal bot (Figuur 1a, B, D). Lange...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Kweken en meten van foetale en pasgeboren muizen lange botten

Hier presenteren we een methode voor ex vivo cultuur van lange muizen botten op zowel foetale en pasgeboren stadia, geschikt voor het analyseren van bot-en kraakbeen ontwikkeling en homeostase in gecontroleerde omstandigheden, terwijl Recapitulerend het in vivo proces.

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Deze methode past het middenvoetsbeentje cultuur protocol aan grotere botten, waardoor directe botmanipulatie kan worden gecombineerd met complexe genetische modellen om processen in verband met botontwikkeling aan te pakken. Deze techniek maakt manipulatie en analyse van botgroei mogelijk die in vivo niet mogelijk is, zoals live imaging of directe fysieke en farmacologische manipulatie. Deze ex vivo kweekmethode maakt het mogelijk de specifieke studie van de lokale effecten van de genetische inzet in het bot te scheiden van het systemische effect van de behandeling heeft op het organisme.Begin met het steriliseren van de buikstreek van een zwangere zwangerschapsdag 14,5 tot 18,5 muis met 80% ethanol en het gebruik van een kleine schaar om de huid en buikspieren te openen om toegang te krijgen tot de baarmoederhoorns. Om de baarmoeder uit de buikholte te halen, verwijder je het mesometrium en snijd je de basis van de hoorns door. Breng de baarmoeder vervolgens over op een petrischaaltje van 60 millimeter met ijskoud dissectiemedium op ijs.In een bioveiligheidskast die tussen de zakken met een schaar wordt gesneden om de individuele foetussen te scheiden, en een individuele zak in een nieuwe schotel van 60 millimeter met vers dissectiemedium onder een dissectiee stereomicroscoop over te brengen. Gebruik een pincet om de foetussen van de placenta's te scheiden en de foetussen van de membranen te reinigen. Gebruik een bijgesneden plastic pipet om het lichaam over te brengen in een nieuwe 60 millimeter schotel, en onthoofd het embryo voor verdere dissectie.Gebruik dan pincet om de huid te verwijderen, vanaf de rug en peeling uit aan de tenen. Gebruik de pincet te snijden dicht bij de wervelkolom en scheiden van de achterste ledematen van het lichaam. Breng de achterste ledematen over op een schone schaal met ijskoud dissectiemedium en steek de pincet tussen het oppervlaktekraakbeen van het distale dijbeen en het proximale scheenbeen om het scheenbeen van het dijbeen te scheiden.Verwijder de heupbeenderen van het proximale dijbeen en het calcaneusbot en het kuitbeen uit het scheenbeen. Zorgvuldig nip en trek de zachte weefsels van de femurs en scheenbeen en gebruik een steriele een-milliliter pipet om alle vier beenbotten over te brengen in de eerste put van een 24-put plaat met verse dissectie medium. Het is belangrijk om aan te tonen dat het zachte weefsel dat de pols van het bot verbindt wordt verwijderd.Anders zal het bot buigen en niet de juiste groei te bereiken. Wanneer de botten zijn ontleed uit het juiste experimentele aantal foetussen, beeld de botten in elke put soms nul onder een lichtmicroscoop met een goed contrast en vervang het dissectiemedium in elke put door een milliliter cultuurmedium per goed waarbij extra zorg wordt genomen om de botten niet aan te lokken. Om het effect van groeiremming in de kweekomstandigheden waar te nemen, behandel je de linkerscheenbeen met 500 nanomolar retinoïnezuur en broed je de rechterscheenbeen met een gelijkwaardig volume voertuig als controle.Plaats vervolgens de plaat in een celcultuur incubator onder standaard celcultuur voorwaarden. Behandel de botten na twee dagen gedurende één tot twee uur met een geschikte thymidineanaloog om de botcelproliferatie te beoordelen voordat de botten gedurende 10 minuten worden overgebracht naar afzonderlijke twee milliliterbuizen van 4%paraformaldehyde. Breng de botten vervolgens over naar PBS om de botten op het laatste tijdstip in beeld te brengen voordat u de monsters terugstuurt naar het paraformaldehyde voor nachtelijke fixatie bij vier graden Celsius.Om de lengte en gemineraliseerde regio van de botten te meten, opent u een geschikt imaging-softwareprogramma en houdt u rekening met de schaal van het beeld, meten zowel de totale lengte van het bot als het gemineraliseerde gebied. Het starten van de metingen vanaf de eerste donkere cellen aan de ene kant tot de laatste donkere cellen aan de andere kant. Om het groeipercentage te berekenen dat wordt gedefinieerd als de gemiddelde toename van de lengte per dag, verdeelt u het verschil tussen de uiteindelijke lengte van het bot en de initiële lengte door het aantal dagen in de cultuur.Hier wordt een vergelijking aangetoond tussen gekweekt scheenbeen en vers gewonnen scheenbeen in gelijkwaardige stadia. Na maximaal twee dagen van cultuur, de bereikte grootte is vergelijkbaar met de in vivo botgroei voor zowel het kraakbeen en gemineraliseerd bot. Langere cultuurperiodes leiden tot grotere verschillen tussen de gekweekte botten en vers geëxtraheerde botten.Let op, het scheenbeen geteeld met een onvolledige verwijdering van het zachte weefsel kan resulteren in buigen van het gekweekte scheenbeen. Behandeling met retinoïnezuur heeft al na twee dagen behandeling een robuust effect op de scheengroei. Hoewel er een consistente toename van de totale lengte van het scheenbeen na twee dagen in de cultuur, deze groei komt overeen met een geschatte toename van slechts negen tot 29%van de oorspronkelijke lengte.Minder dan de botgroei die in vivo zou worden waargenomen. Inderdaad, thymidine analoge etikettering toont minder positieve cellen in deze regio na cultuur in vergelijking met vers geëxtraheerde botten van een gelijkwaardige fase. Verder neemt in in vitro gekweekt scheenbeen de totale lengte van het skeletelement aanzienlijk toe, terwijl bijna geen toename van het gemineraliseerde gebied wordt waargenomen.Naast histologische en moleculaire analyse kunnen clearing en 3D-beeldvorming na de cultuur worden uitgevoerd om het cellulaire effect van de behandelingen die op de gekweekte botten worden toegepast, te karakteriseren. De techniek stelt ons in staat om vragen met betrekking tot interorganele communicatie aan te pakken. Bijvoorbeeld door botten van de verschillende genetische modellen te co-cultren in een soort pijnvrij parabiose-experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Gedrags- en reproductieve gevolgen van embryonale blootstelling aan toxische stoffen in lage dosis op lange termijn

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infectie van gekweekte menselijke foetale hersenen neurale stamcellen immunocytochemische p.a.

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Foetale muis cardiovasculaire Imaging met behulp van een systeem van hoge-frequentie echografie (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intraveneuze en Intra-vruchtwater In Utero transplantatie in het lymfkliertest Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Hoge frequentie echografie voor de analyse van de ontwikkeling van de foetus en placenta In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...