Name: culturing and measuring fetal and newborn murine long bones
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

היינו רוצים להודות אלכסנדרה ג'וינר על התמיכה שלה כאשר הפרוטוקול הזה היה להיות מבוסס, Edwina מקגלין ו-יי צ'נג צ'אנג עבור שיתוף חומצה retinoic. המכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית נתמך על ידי מענקים מממשלת המדינה של ויקטוריה והממשלה האוסטרלית.

כל הניסויים צריכים להתבצע בעקבות ההנחיות המקומיות והמוסדיים של טיפול מוסרי בבעלי חיים מעבדתיים.
1. ההכנות לקראת יום התרבות העצם
<ol><li>להגדיר מתזמן העכבר מתוזמן כדי להשיג עוברים וגורים מהיום העובריים 14.5 (E 14.5) והלאה. הערה: התרבות של עצמות ארוכות ניתן להחיל בהצלחה על...

<ol>
	<li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endochondral+skeleton.">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).</li><li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+ossification:+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton.">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li><li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+chondrogenesis.">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+a+multi-functional+complex+organ:+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification.">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).</li><li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats.">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li><li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+1alpha,+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora.">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).</li><li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage.">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography.">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li><li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals:+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification.">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies.">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone &amp; Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions.">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).</li><li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways.">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).</li><li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice.">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates.">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system.">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).</li><li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage.">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression.">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li><li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis.">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li><li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance.">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li><li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).</li><li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes.">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li><li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+strain+history+of+bone:+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains.">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li><li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain.">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li></ol>

שיטות התרבות vivo העצם שימשו זמן מה כדי להעריך את הביולוגיה של צמיחת העצם28, אבל כבר לעתים רחוקות להחיל את העצמות הארוכות murine. עם התפתחות של טכניקות דימות, תרבות העצם vivo ex מציעה דרך אטרקטיבית לחקור את צמיחת העצם בזמן אמת בהגדרה הדומה היטב בתנאים vivo. בתרחיש זה, חשוב להגדיר את התנאים...

צמיחת איברים צריך להיות מכוון הדוק כדי למנוע את המראה של הפרעות גדילה, וכרוך בוויסות של סוגי תאים מרובים, מסלולים מולקולריים ומוצלב בין חלקים שונים של הגוף. טכניקות הדמיה חיוניים כדי לטפל בשינויים המתרחשים במשך הזמן בעובר הולך וגדל, הן בתנאים נורמליים, כמו גם לאחר המושרה הנגרמת במערכת. עוברים עם התפתחות תוך רחמי, כגון מודלים מכרסם בשימוש נרחב, להציג אתגר נוסף עבור הדמיה חיה וטיפול בסמים, אשר ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש בטכניקות לשעבר התרבות הvivo. כדי ללכוד בהצלחה את התהליכים הvivo ולהשיג תוצאות משמעותיות, זה הופך להיות חיוני כדי למצוא את התנאים הנכונים culturing עבור כל איבר או רקמה.
רוב העצמות של השלד היונקים לגדול דרך endochondral האוסיפיקציה, שם הסחוס העובריים (מורכב של תאים המכונים כונדרוציטים) כוננים האורך והוא מוחלף בהדרגה על ידי עצם. תהליך זה קורה בלוחות צמיחה, הממוקם בסוף העצמות הארוכות, שבו שלושה אזורים ניתן להבחין: נח, מתרבים, ו יפרטרופית1,2. ראשית, כונדרוציטים עגולות באזור מנוחה המעבר לתוך כונדרוציטים האופניים טורי באזור ההתרבות. בשלב הבא של בידול, כונדרוציטים אלה להפוך יפרטרופית ולהתחיל הפרשה סוג X קולגן. כונדרוציטים יפרטרופית לארגן את הצעדים הבאים של האוסיפיקציה: הם מפרישות מולקולות איתות מפתח, כגון גורם הצמיחה רקמת חיבור, עצם מורפולפרוטאין חלבונים ו קיפוד הודי, ולהפנות את המינרליזציה של המטריצה, לגייס כלי הדם לחלק המרכזי של העצם, ו, על אפופטוזיס, לאפשר אוסטאופתית (העצם להרכיב תאים) כדי לפלוש למטריקס כדי ליצור את מרכז האוסיפיקציה העיקרי3,4. מטריקס מינרליזציה מקלה על חדירת כלי הדם שדרכו האוסטאופה מחליפים את הסחוס היורד בעזרת מטריצת עצם5. האוסטאופתי ביותר לפלוש מטריצה הסחוס מן perichondrium, שכבה סיבי העוטפת את הסחוס6. לחילופין, שיעור של כונדרוציטים יפרטרופית מסוגלים לשרוד ולשנות את היכולת לעבור מעבר לעצמות7,8,9. האורך הסופי של העצם נובע הצמיחה המצטברת של הסחוס חולף, שיעור הצמיחה שלו בתורו תלוי במספר ובגודל של יפרטרופית כונדרוציטים, ואת ייצור המטריצה שלהם10. בנוסף, הוכח לאחרונה כי משך השלב האחרון של היפרפרס התואם לאורך הסופי של העצם11. לכן, רגולציה הדוקה של התפשטות והבידול של תאים אלה נדרש כדי להבטיח גודל העצם הנכון.
למרות הידע הניכר שנרכש לאורך השנים על הארגון והפיתוח של לוחות הצמיחה, מרבית המסקנות הללו מבוססות על התבוננות בסעיפים היסטלוגיים קבועים. שימוש ברקמות מספק מידע רב ערך אודות תהליך זה, אך ניתן לרכבו עם חפצים טכניים, כך שהוא לא יכול לשמש תמיד באופן אמין להערכת שינויים מורפולוגיים או בגודל בין שלבים שונים. בנוסף, כמו צמיחת העצם הוא תהליך דינמי, התמונות דו מימדי סטטי (2D) מציעים תובנה מוגבלת לתוך התנועה של התאים בצלחת הצמיחה, בעוד הדמיה הזמן לשגות על רקמה חיה יכול להציע מידע חשוב על ההתנהגות של כונדרוציטים בצלחת הצמיחה.
כל המגבלות הללו ניתן לפתרון פוטנציאלי באמצעות תרביות עצם vivo לשעבר. בעוד שפרוטוקולי תרבות העצם פותחו לפני זמן מה, הם הוחלו על עצמות ארוכות של מורטין. רוב המחקרים משתמשים בעצמות האפרוח בשל היתרונות הטכניים המוצעים על-ידי דגם האפרוח12,13. תרבויות אורגאוטימית (ממשק אוויר/נוזלים) הוחלו על מורים עובריים, שהיו מתוחזקים בתרבות במשך 10 ימים14. הכלים הגנטיים המתוחכמים הזמינים בעכבר להפוך את המודל הזה מאוד מושך לשמש לשעבר בתרבות העצם vivo. המחקרים שהשתמשו בעכברים כדי להסתכל על גדילה העצם עבד בעיקר עם עצמות המסרק15, כנראה בשל גודלם הקטן ומספרים גדולים יותר המתקבלים לעובר16. למרות שנחשב באופן מסורתי עצמות ארוכות, מטאטסי להיכנס הזדקנות (מאופיין התפשטות מופחתת אינוולוציה של צלחת הצמיחה17) מוקדם יותר מאשר עצמות ארוכות אחרות vivo, ולכן הצמיחה המתמשכת שלהם לשעבר vivo אינו ממש את התהליך הvivo. לצורך מאמר זה, נשתמש במונח עצמות ארוכות לעצמות מאזורי הגפיים האבובי והביניים. מספר מחקרים קודמים השתמשו בעצמות murine ארוך, כגון שוקה, בתרבויות vivo לשעבר נצפתה צמיחה משמעותית של הסחוס אבל מעט ההתקשות18. השתמשנו גם בתרבויות הבאליס לאחרונה, בעיקר כדי ללמוד כchondrocyte dynamics19. מחקרים אחרים השתמשו בראשי הירך מעכברים צעירים20 או רק את החלק המרוחק של עצם הירך לתרבות21. כמה יצירות אחרונות יותר בהצלחה לשלב את התרבות הvivo ex של עצמות מלאות עם הדמיה זמן ההדמיה כדי לרכוש תלת מימדי (3d) סרטים של כונדרוציטים ברקמת העכבר חי22,23. המחברים הצליחו להתבונן בעבר אירועים מבלי שיבחינו בסידור מחדש של כונדרוציטים לאזור מתרבים23 בדוגמה טובה של היישום הפוטנציאלי של תרבות vivo ex העצם. החלופה, כלומר, ניתוח תמונות סטטיות, דורשת טכניקות עקיפות ומורכבות. זה היה לידי ביטוי על ידי מחקר שנערך לאחרונה הערכת החשיבות של שיבוטים transversally לצמיחת הסחוס, שם מעקב גנטי עם זנים רבים העכבר העיתונאי בשילוב עם מידול מתמטי שימשו24. לכן, התרבות הvivo לשעבר עשוי לעזור להשיג תובנה תהליכים דינמיים בצורה מהירה וישירה יותר.
כאן, אנו מציגים שיטה לתרבות ארוכה של עצמות ממורין, אשר ניתן לשלב עם טיפולים מולקולריים שונים ו/או עם הדמיה בזמן ההדמיה החיה. פרוטוקול זה מתאים את השיטות המשמשות בדוחות קודמים15,18,25, אך מטפל בנושאים נוספים ומתמקד בעצמות ארוכות כגון השוקה, במקום בעצמות המסרק. לבסוף, הוא חוקר את הפוטנציאל של שימוש מבחינה סטטיסטית השוואות לזווג חזק על ידי culturing עצמות שמאל וימין בנפרד בנוכחות של חומרים שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS 61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:132px;">Adobe</td>
			<td>CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Base unit for the scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>435425-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Betaglycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Binocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">STEMI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v</td>
			<td style="width:132px;">Roche/Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DigiRetina 500 camera</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Dissection kit</td>
			<td style="width:132px;">Cumper Robbins</td>
			<td style="width:119px;">PFS00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMSO</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Eppendorf 2-mL tubes</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:132px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">159010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Forceps Dumont#5 Inox08</td>
			<td style="width:132px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">T05811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heracell 150 CO2 incubator</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Multiwell 24 well</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped</td>
			<td style="width:132px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Syringe filter 0.2 um&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Terumo syringe 20 mL</td>
			<td style="width:132px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">DVR-5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tretinoin (retinoic acid)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHR1187-3X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Trinocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;">AZS400T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and measuring fetal and newborn murine long bones

עצמות ארוכות הן מבנים מורכבים ודינמיים, אשר נובעים endochondral אוסיפיקציה דרך הסחוס ביניים. הגישה המוגבלת לעצמות אנושיות בריאות הופכת ערך במיוחד לשימוש בדגמי היונקים, כגון עכבר ועכברוש, כדי לבדוק היבטים שונים של צמיחת העצם והומאוסטזיס. בנוסף, הפיתוח של כלים גנטיים מתוחכמים בעכברים מאפשר מחקרים מורכבים יותר של צמיחה עצם ארוך מבקש הרחבה של טכניקות המשמשות לחקר צמיחת העצם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור התרבות לשעבר vivo murine העצם, אשר מאפשר את המחקר של העצם ואת הסחוס באופן הדוק מבוקרת תוך לכידה של רוב בתהליך vivo. השיטה המתוארת מאפשרת את התרבות של מגוון העצמות, כולל עצמות השוקה, עצם הירך והמסרק, אך אנו מתמקדים בעיקר בתרבות הבאליס. כמו-כן, ניתן להשתמש בה בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון הדמיה בזמן הדמייה חיה או טיפול תרופתי.

תרבות העצם ניתן לבצע החל משלבים שונים. באיור 1A-D, השוואה בין השוקה התרבותית והמחולצים הטריים בשלבים שווי-ערך מוצג. ההתבוננות הראשונה היא כי עד יומיים של תרבות הגודל הושג הוא המקבילה לצמיחה בעצם vivo עבור סחוס ועצם מינרליזציה (איור 1A<...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

כאן, אנו מציגים שיטה עבור תרבות vivo ex של עצמות murine ארוך בשלבים העוברי והיילוד, מתאים לניתוח העצם ופיתוח הסחוס הומאוסטזיס בתנאים מבוקרים תוך לכידה בתהליך vivo.

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

שיטה זו מתאימה את פרוטוקול התרבות המטא-טארסלית לעצמות גדולות יותר, ומאפשרת שילוב של מניפולציה ישירה בעצמות עם מודלים גנטיים מורכבים לטיפול בתהליכים הקשורים להתפתחות העצם. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה וניתוח של צמיחת העצם כי אינם אפשריים ב vivo, כגון הדמיה חיה או מניפולציה פיזית ופרמקולוגית ישירה. שיטת תרבות אקס ויוו זו מאפשרת מחקר ספציפי של ההשפעות המקומיות של ההתפרצות הגנטית בעצם המפרידה אותה מההשפעה המערכתית שיש לטיפול על האורגניזם.התחל על ידי עיקור אזור הבטן של יום הריון בהריון 14.5 כדי 18.5 עכבר עם 80% אתנול ושימוש מספריים קטנים כדי לפתוח את העור ואת שרירי הבטן כדי לגשת קרני הרחם. כדי לחלץ את הרחם מחלל הבטן, להסיר את mesometrium לחתוך את הבסיס של הקרניים. לאחר מכן, מעבירים את הרחם לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה מדיום ניתוח קר כקרח על קרח.ב ארון biosafety לחתוך בין השקים עם מספריים כדי להפריד את העוברים בודדים, ולהעביר שק בודדים לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר עם מדיום ניתוח טרי תחת מיקרוסקופ סטריאו ניתוח. השתמש פינצטה כדי להפריד את העוברים מן שליה כדי לנקות את העוברים מן הממברנות. השתמש פיפטה פלסטיק גזוז להעביר את הגוף לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר, לערוף את העובר לפני ניתוח נוסף.לאחר מכן השתמש פינצטה כדי להסיר את העור, החל מאחור מתקלף אל בהונות. השתמש פינצטה לחתוך קרוב לעמוד השדרה ולהפריד את הגפיים האחוריות מהגוף. מעבירים את הגפיים האחוריות לצלחת נקייה המכילה מדיום ניתוח קר כקרח, ומכניסים את פינצטה בין סחוס פני השטח של עצם הירך הדיסטלית לבין השוקה הפרוקסימלית כדי להפריד את השוקה מעצם הירך.מוציאים את עצמות הירך מעצם הירך הפרוקסימלית ועצם הקלקניוס והבולבולה מה השוקה. בזהירות לקטוע ולמשוך את הרקמות הרכות מן הירך ואת השוקה ולהשתמש פיפטה סטרילי אחד מיליליטר להעביר את כל ארבע עצמות הרגל לתוך הבאר הראשונה של צלחת 24 היטב המכיל מדיום ניתוח טרי. חשוב להראות כי הרקמה הרכה שמחברת את הדופק של העצם מוסרת.אחרת, העצם תתכופף ולא תשיג צמיחה נאותה. כאשר העצמות נותאו ממספרם הניסיוני המתאים של העוברים, תדמיינו את העצמות בכל באר לפעמים אפס תחת מיקרוסקופ אור עם ניגודיות טובה והחליפו את מדיום הניתוח בכל באר במיליליטר אחד של מדיום תרבותי למטר תוך נקיטת זהירות נוספת שלא לקדם את העצמות. כדי לבחון את ההשפעה של עיכוב צמיחה בתנאי התרבות, לטפל השוקה השמאלית עם 500 חומצה רטינואית nanomolar ו דגירה השוקיים הימניים עם נפח שווה ערך של הרכב כבקרה.לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים בתנאי תרבות תאים סטנדרטיים. לאחר יומיים, לטפל בעצמות עם אנלוגי תימידין מתאים במשך שעה עד שעתיים כדי להעריך את התפשטות תאי העצם לפני העברת העצמות לצינורות בודדים שני מיליליטר של 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות. לאחר מכן, להעביר את העצמות PBS כדי לדמיין את העצמות בנקודת הזמן האחרונה לפני החזרת הדגימות paraformaldehyde עבור קיבעון לילה בארבע מעלות צלזיוס.כדי למדוד את האורך ואת האזור המינרלי של העצמות, לפתוח תוכנת הדמיה מתאימה, ולקחת בחשבון את קנה המידה של התמונה, למדוד הן את האורך הכולל של העצם, ואת האזור מינרלים. התחלת המידות מהתאים הכהים הראשונים בקצה אחד עד לתאים הכהים האחרונים בקצה השני. כדי לחשב את קצב הגדילה המוגדר כעלייה הממוצעת באורך ליום, חלק את ההפרש בין האורך הסופי של העצם לבין האורך הראשוני במספר הימים בתרבות.כאן מוצגת השוואה בין השוקה התרבותית לבין השוקה הטרייה המופקת בשלבים מקבילים. לאחר עד יומיים של תרבות, הגודל שהושג דומה לצמיחת העצם in vivo הן עבור הסחוס והן עבור עצם מינרלית. תקופות תרבות ארוכות יותר מובילות להבדלים גדולים יותר בין העצמות התרבותיות לבין העצמות שחולצו זה השנה.הערה, השוקה גדל עם הסרה מלאה של הרקמה הרכה יכול לגרום כיפוף של השוקה התרבותית. לטיפול בחומצה רטינואית יש השפעה חזקה על הצמיחה הטיביאלית כבר לאחר יומיים של טיפול. למרות שיש עלייה עקבית באורך הכולל של השוקה לאחר יומיים בתרבות, צמיחה זו תואמת לעלייה משוערת של תשעה עד 29% בלבד מהאורך הראשוני.פחות מצמיחת העצם כי יהיה נצפתה vivo. אכן, תיוג אנלוגי תימידין מראה פחות תאים חיוביים באזור זה לאחר התרבות לעומת עצמות שחולצו טריות של שלב שווה ערך. יתר על כן, בטיביה תרבותית במבחנה, האורך הכולל של אלמנט השלד עולה באופן משמעותי, בעוד כמעט ללא עלייה באזור מינרלים הוא ציין.בנוסף לניתוח היסטולוגי ומולקולרי, ניתן לבצע ניקוי והדמיה תלת מימדית לאחר התרבות כדי לאפיין את ההשפעה התאית של הטיפולים המוחלים על העצמות המתורתות. הטכניקה מאפשרת לנו להתייחס לשאלות הקשורות לתקשורת בין-אורגנית. לדוגמה, על ידי שיתוף culturing עצמות מן המודלים הגנטיים השונים בסוג כלשהו של ניסוי פרביוזיס ללא כאבים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

השלכות התנהגותיות, הרבייה לטווח ארוך של חשיפה עובריים חשיפה לרעלים במינון נמוך

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

אולטרסאונד בתדירות גבוהה לניתוח של התפתחות עוברית היפרדות In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...