Name: culturing and measuring fetal and newborn murine long bones
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00
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私たちは、このプロトコルが確立されているときに彼女のサポートのためにアレクサンドラ・ジョイナーに感謝したいと思います, レチノイン酸を共有するためのエドウィナ McGlinn と Yi-チェン.オーストラリア再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの助成金によって支えられています。

すべての実験は、実験動物の倫理的取扱いに関する地方の政府および制度のガイドラインに従って行われるべきである。
1. 骨培養日前の準備
<ol><li>Matings の日 14.5 (E 14.5) 以降から胎児と仔を得るために、時限マウスを設定します。 注:長い骨の文化は、正常に異なるマウス系統に適用することができます。本プロトコールにおいて、outbred スイスウェブス?...

<ol>
	<li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endochondral+skeleton.">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).</li><li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+ossification:+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton.">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li><li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+chondrogenesis.">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+a+multi-functional+complex+organ:+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification.">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).</li><li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats.">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li><li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. 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M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography.">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li><li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals:+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification.">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies.">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone &amp; Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li><li>Lui, J. 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A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates.">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system.">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).</li><li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage.">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression.">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li><li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis.">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li><li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance.">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li><li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).</li><li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes.">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li><li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+strain+history+of+bone:+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains.">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li><li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain.">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li></ol>

骨 ex インビボ培養法は、骨成長28の生物学を評価するためにしばらくの間使用されてきたが、マウス長骨にはめったに適用されていない。画像化技術の発達により、ex vivo の骨培養は、インビボ条件に近い設定でリアルタイムで骨成長を研究する魅力的な方法を提供する。このシナリオでは、長い骨の成長がインビボでの成長に匹敵する条件を定義することが重要である。</...

臓器の成長は、成長障害の出現を防ぐために厳密に調整されなければならない、と体の異なる部分間の複数の細胞型、分子経路およびクロストークの調節を伴う。イメージング技術は、成長している胚において経時的に起こる変化に対処するために不可欠であり、正常な状態においても、またシステムにおいて摂動が誘発された後も同様である。子宮内発育を伴う胚は、広く使用されているげっ歯類モデルのような、生きた画像化および薬物治療のための追加の課題を提示し、これは ex vivo 培養技術を使用して部分的に克服することができる。インビボプロセスを正常に不在し、有意義な結果を得るためには、各器官または組織に対して適切な培養条件を見つけることが重要となる。
哺乳類の骨格のほとんどの骨は endochondral 骨化を通じて成長し、そこでは胚性軟骨 (軟骨細胞と呼ばれるセルで構成される) が長手方向の成長を駆動し、徐々に骨に置換される。このプロセスは、長い骨の末端に位置する成長プレートで発生します, 3 つのゾーンを区別することができます: 安静, 増殖性, 肥大と1,2.第1に、安静域における丸い前駆軟骨は、増殖性ゾーンにおいて循環柱状軟骨細胞へと移行する。分化の次の段階では、これらの軟骨細胞は肥厚性になり、タイプ X コラーゲンを分泌し始めます。肥大性軟骨細胞は骨化の後続のステップを調整します: 結合組織成長因子、骨形態形成タンパク質、インドヘッジホッグなどの主要なシグナル伝達分子を分泌し、マトリックスの無機化を誘導し、血管は、骨の中央部分に、そして、アポトーシスの際に、骨芽細胞 (骨形成セル) が一次骨化中心3,4を形成するマトリックスに浸潤することを可能にする。無機化されたマトリックスは、骨芽細胞がこの劣化した軟骨を骨格5に置き換えて移行する血管の浸透を促進する。ほとんどの骨芽細胞は、軟骨膜から軟骨基質に浸潤し、軟骨6を包み込む繊維層である。あるいは、肥厚性軟骨細胞の割合は、骨芽細胞7、8、9に生存し、transdifferentiate することができます。骨の最終的な長さは、一時的な軟骨の蓄積された成長によるものであり、その成長速度は、肥大性軟骨細胞の数およびサイズ、およびそれらのマトリックス産生10に依存する。さらに、最後の肥大期の持続時間が骨11の最終的な長さと相関することが最近示された。したがって、これらの細胞の増殖および分化の厳密な調節は、正しい骨サイズを確保するために必要である。
組織や成長プレートの開発に長年にわたって得られたかなりの知識にもかかわらず、これらの結論のほとんどは、固定組織学的セクションの観察に基づいています。ティッシュの区分はこのプロセスに関する貴重な情報を提供するが、技術的なアーティファクトと乗ることができる従って異なった段階間の形態的なかサイズの変更を推定するのに常に確実に使用することができない。さらに、骨の成長は動的なプロセスであるため、静的二次元 (2D) 画像は成長板の細胞の動きに限られた洞察を与え、生きた組織に対するタイムラプス撮影は、その行動に関する貴重な情報を提供することができます。成長プレート内の軟骨細胞。
これらすべての制限は、ex vivo の骨培養を使用して潜在的に解決することができます。骨培養プロトコルは、いくつかの時間前に開発されているが、彼らは限定マウスの長い骨に適用されました。研究のほとんどは、ひよこモデル12,13によって提供される技術的な利点のためにひよこの骨を使用しています。Organotypic 培養物 (空気/液体界面) を、10日間14の培養で維持したひよこ胚大腿骨に適用した。マウスで利用可能な洗練された遺伝学的ツールは、このモデルは、ex vivo の骨の培養で使用されることが非常に魅力的にする。骨の成長を調べるためにマウスを使用した研究は、ほとんど中足骨15で働いていましたが、おそらくその小さなサイズと胚16あたりのより大きな数に起因します。伝統的に長い骨と考えられていたが、metatarsi は、インビボで他の長骨よりも早く (成長プレート17の増殖および退縮を減少させることを特徴とする) 老化を入力し、したがってそれらの連続的な増殖は実際に in vivo プロセスを不在ます。この記事の目的のために、近位および中間肢領域からの骨のための長い骨という用語を使用します。以前のいくつかの研究では、脛骨のような長いネズミ骨を、ex vivo 培養で使用し、軟骨の実質的な成長を観察したが、少し骨化18.我々はまた、最近、主に軟骨ダイナミクス19を研究するために脛骨培養物を使用しました。他の研究は、若年マウス20または培養物21のための大腿骨の遠位部分のみから大腿骨頭を使用した。いくつかのより最近の作品では、正常な骨の ex 培養とタイムラプス撮影を組み合わせることで、生きているマウス組織22,23における軟骨細胞の三次元 (3d) 映画を得ることができます。著者らは、骨 ex インビボ培養の潜在的適用の良い例において、増殖性ゾーン23への軟骨細胞の再配置において以前気付かれなかった事象を観察することを管理した。静的な画像を分析する代替手段として、間接的で複雑になる手法が必要です。これは、軟骨成長のための横断的指向クローンの重要性を評価する最近の研究によって例示された、数学的モデリングと結合した多色レポーターマウス系統を用いた遺伝的トレースは24を使用した。したがって、ex vivo カルチャは、動的なプロセスについてより迅速かつ簡単に洞察を得るのに役立つ可能性があります。
ここでは、マウス長骨培養のための方法を提示し、これを異なる分子処理および/またはタイムラプスライブイメージングと組み合わせることができる。このプロトコルは、以前のレポート15、18、25で使用される方法を適応するが、いくつかの追加の問題に対処し、中足の骨ではなく、脛骨などの長骨に焦点を当てています。最後に、異なる物質の存在下で左右の骨を別々に培養することによって、統計的に強力な対比較を使用する可能性を探ります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS 61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:132px;">Adobe</td>
			<td>CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Base unit for the scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>435425-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Betaglycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Binocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">STEMI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v</td>
			<td style="width:132px;">Roche/Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DigiRetina 500 camera</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Dissection kit</td>
			<td style="width:132px;">Cumper Robbins</td>
			<td style="width:119px;">PFS00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMSO</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Eppendorf 2-mL tubes</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:132px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">159010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Forceps Dumont#5 Inox08</td>
			<td style="width:132px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">T05811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heracell 150 CO2 incubator</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Multiwell 24 well</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped</td>
			<td style="width:132px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Syringe filter 0.2 um&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Terumo syringe 20 mL</td>
			<td style="width:132px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">DVR-5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tretinoin (retinoic acid)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHR1187-3X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Trinocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;">AZS400T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and measuring fetal and newborn murine long bones

長骨は複雑で動的な構造であり、軟骨中間体を介して endochondral 骨化から生じる。健康な人間の骨への限られたアクセスは、マウスやラットなどの哺乳動物モデルの使用は、骨の成長と恒常性の異なる側面を調べるために特に貴重になります。さらに, マウスの洗練された遺伝的ツールの開発は、長い骨の成長のより複雑な研究を可能にし、骨の成長を研究するために使用される技術の拡大を求めます.ここでは、概説のほとんどの in vivo プロセスを使用しながら、厳密に制御された方法で骨と軟骨の研究を可能にする ex vivo ネズミ骨培養の詳細なプロトコルを紹介します。記載された方法は、脛骨、大腿骨、および中足骨を含む骨の範囲の培養を可能にするが、ここでは主に脛骨培養に焦点を当てている。また、タイムラプスライブイメージングや薬物治療などの他の技術と組み合わせて使用することができる。

骨培養は、異なる段階から開始して行うことができる。図 1a− Dにおいて、同一の段階での培養した脛骨と抽出したものとの比較が示されている。第1の観察は、達成された最大2日間の培養が、軟骨および無機骨の両方についてインビボ骨成長に匹敵することである (図 1a、B、D)。培養期間が長いと...

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Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

胎児と新生児のネズミの長骨の培養と測定

ここでは、胎児および新生児の両方の段階での長いネズミ骨の元インビボ培養のための方法を提示し、生体内プロセスを概説しながら制御された条件下で骨および軟骨の発達およびホメオスタシスを分析するのに適している。

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

この方法は、中足骨培養プロトコルを大きな骨に適応させ、骨の発達に関連するプロセスに対処するために複雑な遺伝モデルと直接骨操作を組み合わせることを可能にする。この技術は、ライブイメージングや直接物理的および薬理学的操作など、生体内では不可能な骨の成長の操作と分析を可能にします。このex vivo培養法は、治療が生物に及ぼす全身的な影響からそれを分離する骨の遺伝的インセットの局所的な影響の特定の研究を可能にする。妊娠14.5日目から18.5日のマウスの腹部領域を80%エタノールで殺菌し、小さなはさみを使って皮膚と腹筋を開いて子宮の角にアクセスすることから始めます。腹腔から子宮を抽出するには、メソムトリウムを取り除き、角の基部を切断する。次に、氷冷解離培地を含む60ミリメートルのシャーレに子宮を氷上に移します。バイオセーフティキャビネットでは、個々の胎児を分離するためにはさみで袋の間を切断し、解剖ステレオ顕微鏡の下で新鮮な解剖媒体で新しい60ミリメートル皿に個々の袋を転送します。ピンセットを使用して胎盤から胎児を分離し、胎児を膜からきれいにする。トリミングされたプラスチック製のピペットを使用して、新しい60ミリメートル皿に体を移し、さらに解剖する前に胚を切断します。その後、ピンセットを使用して皮膚を取り除き、背中から始めてつま先まで剥がします。ピンセットを使用して背骨の近くを切断し、後肢を体から分離します。後肢を氷冷解剖培地を含むきれいな皿に移し、遠位大腿骨の表面軟骨と近位脛骨の間にピンセットを挿入して脛骨と大腿骨を分離する。脛骨から近位大腿骨と踵骨と脛骨から股関節の骨を取り除きます。慎重にニップと大腿骨と脛骨から柔らかい組織を引っ張り、無菌1ミリリットルピペットを使用して、新鮮な解剖媒体を含む24ウェルプレートの最初の井戸にすべての4本の脚の骨を移します。骨の脈拍を接続する軟部組織が除去されることを示することが重要である。さもなければ、骨は曲がり、適切な成長を達成しない。骨が適切な実験数の胎児から解剖された場合、良好なコントラストを持つ光顕微鏡の下で時々ゼロで各井戸の骨を画像化し、骨を吸引しないように余分な注意を払って各井戸の解剖培地を1ミリリットルの培養培地に置き換えます。培養条件における成長阻害の効果を観察するには、500ナノモルレチノイン酸で左ティビアスを処理し、右側のチビアを同等の量の車両をコントロールとしてインキュベートします。次いで、標準的な細胞培養条件下で細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。2日後、適切なチミジンアナログで骨を1〜2時間治療し、骨細胞増殖を評価してから、骨を4%パラホルムアルデヒドの個々の2ミリリットルチューブに10分間移す。次に、骨をPBSに移して最終時点で骨を画像化してから、サンプルをパラホルムアルデヒドに戻し、摂氏4度で一晩固定します。骨の長さや鉱化領域を測定するには、適切なイメージングソフトウェアプログラムを開き、画像のスケールを考慮して、骨の全長と鉱化領域の両方を測定します。一方の端にある最初の暗い細胞から、もう一方の端にある最後の暗い細胞までの測定を開始します。1日あたりの平均増加長として定義される成長率を計算するには、骨の最終的な長さと初期の長さの差を培養日数で割ります。ここでは、培養脛辺と抽出したばかりの脛刺との比較を同等の段階で示す。培養の最大2日後に達成されたサイズは、軟骨およびミネラル化された骨の両方の生体内の骨の成長に匹敵する。培養期間が長いと、培養された骨と抽出された骨の間に大きな違いが生じる。なお、軟組織の不完全な除去で成長した脛脛は、培養された脛組織の曲げをもたらす可能性がある。レチノイン酸による治療は、2日間の治療の後、早くも脛犬の成長に強い影響を与えます。培養で2日後に脛脛の全長が一貫して増加するが、この成長は最初の長さからわずか9〜29%の概数の増加に相当する。インビボで観察されるであろう骨の成長の増加よりも少ない.実際、チミジンアナログ標識は、同等の段階の新鮮な抽出された骨と比較して、培養後のこの領域の陽性細胞の数が少ない。また、インビトロ培養脛刺では、骨格元素の全長が実質的に増加し、一方で鉱化領域の増加はほとんど見られない。組織学的および分子的解析に加えて、培養後のクリアリングおよび3Dイメージングを行い、培養骨に適用される治療の細胞効果を特徴付けることができる。この技術は、私たちが相互コミュニケーションに関連する質問に対処することを可能にします。例えば、何らかの痛みのないパラバイオシス実験で異なる遺伝モデルから骨を共同培養することによって。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

低線量の毒性に萌芽期の露出の長期的な行動および生殖の影響

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

心血管イメージング (30/45 MHZ) の高周波超音波を用いた胎児マウス

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

体内の胎児と胎盤の開発の分析のための高周波超音波

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...