Name: culturing and measuring fetal and newborn murine long bones
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Alexandra Joyner for hennes støtte når denne protokollen ble etablert, Edwina McGlinn og Yi-Cheng Chang for deling retinoic acid. The Australian regenererende Medicine Institute er støttet av tilskudd fra staten regjeringen i Victoria og den australske regjeringen.

Alle eksperimentene skal utføres etter lokale statlige og institusjonelle retningslinjer for etisk håndtering av forsøksdyr.
1. forberedelser før dagen for Bone kultur
<ol><li>Sette opp tidsbestemt musen siamesere å få fostre og pups fra embryonale dag 14,5 (E 14.5) og videre. Merk: Kulturen i lange bein kan med hell brukes på forskjellige mus stammer; i dagens protokoll, outbred Swiss Webster Wild-type mus brukes.</li>
	<li>Forbered disseksjon medium (tilpasset fr...

<ol>
	<li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endochondral+skeleton.">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).</li><li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+ossification:+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton.">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li><li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+chondrogenesis.">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+a+multi-functional+complex+organ:+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification.">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).</li><li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats.">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li><li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+1alpha,+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora.">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).</li><li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage.">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography.">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li><li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals:+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification.">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies.">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone &amp; Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions.">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).</li><li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways.">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).</li><li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice.">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates.">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system.">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).</li><li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage.">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression.">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li><li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis.">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li><li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance.">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li><li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).</li><li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes.">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li><li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+strain+history+of+bone:+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains.">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li><li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain.">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li></ol>

Bone ex vivo kultur metoder har blitt brukt i noen tid til å vurdere biologi av bein vekst28, men har vært sjelden brukt på murine lange bein. Med det utviklingen av tenkelig teknikker, ex vivo Ben kulturen tilbyder en attraktiv vei å studere Ben oppblomstringen inne virkelig tid inne en innfatning undersøke saken grundig ligner det inne vivo vilkårene. I dette scenariet er det viktig å definere forholdene der veksten av lange bein kan sammenlignes med deres vekst i vivo.
<p class="jove...

Orgel vekst må være tett innstilt for å hindre utseendet av vekst forstyrrelser, og innebærer regulering av flere celletyper, molekylære trasé og crosstalk mellom ulike deler av kroppen. Imaging teknikker er avgjørende for å ta opp endringene som skjer over tid i et voksende embryo, både i normale forhold, så vel som etter en forstyrrelsene er indusert i systemet. Embryo med intrauterin utvikling, slik som mye brukt gnager modeller, presentere en ekstra utfordring for Live Imaging og narkotikabehandling, som kan delvis overvinnes ved hjelp av ex vivo kultur teknikker. For å kunne recapitulate in vivo prosesser og få meningsfulle resultater, blir det avgjørende å finne de rette dyrking forhold for hvert organ eller vev.
De fleste bein av pattedyr skjelettet vokse gjennom endokondral forbening, hvor den embryonale brusk (bestående av celler kalt chondrocytes) kjører langsgående vekst og er gradvis erstattet av bein. Denne prosessen skjer på vekst platene, som ligger på slutten av lange ben, der tre soner kan skilles: hvile, proliferativ, og hypertrofisk1,2. Først den runde stamfar chondrocytes i hvile sonen overgangen til sykling søyle chondrocytes i proliferativ sonen. Under neste fase av differensiering, disse chondrocytes bli hypertrofisk og starte sekresjon type X kollagen. Hypertrofisk chondrocytes arrangerer den påfølgende trinn av forbening: de skiller ut viktige signalering molekyler, som bindevevs vekstfaktor, bein Morfogenetiske proteiner og indiske pinnsvin, og direkte mineralisering av matrisen, rekruttere blodårene til den sentrale delen av benet, og på apoptose, tillate osteoblaster (bein-forming celler) å invadere matrisen for å danne den primære forbening Center3,4. Den mineralisert matrise forenkler inntrengning av blodkar gjennom hvilke osteoblaster migrere til å erstatte denne degradert brusk med et bein matrise5. De fleste osteoblaster invadere brusk matrise fra perichondrium, en fiber lag som brytes brusk6. Alternativt, en andel av hypertrofisk chondrocytes er kjøpedyktig overleve og transdifferentiate å osteoblaster7,8,9. Den endelige lengden av benet er på grunn av den akkumulerte veksten av transient brusk, som veksten i sin tur avhenger av antall og størrelsen på hypertrofisk chondrocytes, og deres matrise produksjon10. I tillegg ble det nylig vist at varigheten av den siste hypertrofi fase samsvarer med den endelige lengden av Ben11. Derfor er stram regulering av spredning og differensiering av disse cellene nødvendig for å sikre riktig bein størrelse.
Til tross for den betydelige kunnskapen ervervet gjennom årene på organisering og utvikling av vekst platene, er de fleste av disse konklusjonene basert på observasjon av faste histologiske seksjoner. Vev snitting gir verdifull informasjon om denne prosessen, men kan bli ridd med tekniske gjenstander, så det kan ikke alltid pålitelig brukes til å anslå morfologiske eller størrelses endringer mellom ulike stadier. I tillegg, som bein vekst er en dynamisk prosess, de statiske to-dimensjonale (2D) bilder gir et begrenset innblikk i bevegelsen av cellene i vekst platen, mens time-lapse Imaging på levende vev kan tilby verdifull informasjon om atferden til chondrocytes i vekst platen.
Alle disse begrensningene kan potensielt løses ved hjelp av ex vivo bein kulturer. Stund Ben kulturen protokoller ha blitt bebygget for noen tid siden, de var limitedly henvendte seg til murine lang ben. De fleste av studiene bruker Chick Bones på grunn av de tekniske fordelene som tilbys av Chick-modellen12,13. Organotypic kulturer (luft/væske-grensesnitt) ble brukt til Chick embryonale femurs, som ble opprettholdt i kultur i 10 dager14. Den sofistikerte genetiske verktøy tilgjengelig i musen gjør denne modellen svært attraktivt å bli brukt i ex vivo bein kultur. Studiene som brukte mus til å se inn bein vekst jobbet hovedsakelig med metatarsal bein15, sannsynligvis på grunn av deres lille størrelse og større tall innhentet per embryo16. Selv om det tradisjonelt betraktet som lange bein, metatarsi inn senescence (karakterisert ved redusert spredning og involution av vekst platen17) tidligere enn andre lange bein in vivo, og derfor deres kontinuerlige vekst ex vivo ikke virkelig recapitulate in vivo-prosessen. Ved anvendelsen av denne artikkelen, vil vi bruke begrepet lange bein for bein fra proksimale og mellomliggende lem regioner. Flere tidligere studier brukte lange murine bein, slik som Tibia, i ex vivo kulturer og observerte en betydelig vekst av brusk, men lite forbening18. Vi brukte også tibial kulturer nylig, hovedsakelig for å studere chondrocyte dynamikk19. Andre studier brukte lår Bens hodene fra unge mus20 eller bare den delen av femur for kultur21. Noe flere nylig arbeider med hell forbinde det ex vivo kulturen av i sin helhet Ben med tid-lapse tenkelig å erverve tre-dimensjonale (3D) film av chondrocytes inne lever musen tissue22,23. Forfatterne klarte å observere tidligere ubemerket hendelser i omorganisering av chondrocytes til proliferativ sone23 i et godt eksempel på den potensielle anvendelsen av bein ex vivo kultur. Alternativet, det vil si å analysere statiske bilder, krever indirekte og komplekse teknikker. Dette ble et eksempel på en studie hvor han vurderte viktigheten av bunnene kloner for brusk vekst, der genetisk sporing med flerfarget reporter mus stammer kombinert med matematiske modellering ble brukt24. Derfor kan ex vivo-kultur bidra til å få innsikt i dynamiske prosesser på en raskere og mer direkte måte.
Her presenterer vi en metode for murine lange bein kultur, som kan kombineres med ulike molekylære behandlinger og/eller med tidsforløp Live Imaging. Denne protokollen tilpasser metodene som brukes i tidligere rapporter15,18,25, men løser noen flere problemer og fokuserer på lange bein som Tibia, snarere enn metatarsal Bones. Til slutt, det Utforsker potensialet for å bruke statistisk kraftig sammenkoblet sammenligninger av dyrking venstre og høyre bein separat i nærvær av ulike stoffer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS 61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:132px;">Adobe</td>
			<td>CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Base unit for the scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>435425-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Betaglycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Binocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">STEMI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v</td>
			<td style="width:132px;">Roche/Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DigiRetina 500 camera</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Dissection kit</td>
			<td style="width:132px;">Cumper Robbins</td>
			<td style="width:119px;">PFS00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMSO</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Eppendorf 2-mL tubes</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:132px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">159010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Forceps Dumont#5 Inox08</td>
			<td style="width:132px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">T05811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heracell 150 CO2 incubator</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Multiwell 24 well</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped</td>
			<td style="width:132px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Syringe filter 0.2 um&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Terumo syringe 20 mL</td>
			<td style="width:132px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">DVR-5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tretinoin (retinoic acid)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHR1187-3X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Trinocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;">AZS400T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and measuring fetal and newborn murine long bones

Lange bein er komplekse og dynamiske strukturer, som oppstår fra endokondral forbening via en brusk mellomliggende. Den begrensede tilgangen til friske menneskelige bein gjør spesielt verdifullt bruk av pattedyr modeller, slik som mus og rotte, for å se på ulike aspekter av bein vekst og homeostase. I tillegg gir utviklingen av sofistikerte genetiske verktøy i mus mer komplekse studier av lange bein vekst og ber om en utvidelse av teknikker som brukes til å studere bein vekst. Her presenterer vi en detaljert protokoll for ex vivo murine bein kultur, som tillater studiet av bein og brusk på en strengt kontrollert måte mens recapitulating meste av in vivo prosessen. Metoden beskrevet gjør at kulturen i en rekke bein, inkludert Tibia, femur, og metatarsal bein, men vi har fokusert hovedsakelig på tibial kultur her. Videre kan den brukes i kombinasjon med andre teknikker, for eksempel time-lapse Live Imaging eller narkotikabehandling.

Bone kultur kan utføres fra ulike stadier. I figur 1a-D, en sammenligning mellom kultivert Tibia og ferske Hentet seg på tilsvarende stadier vises. Den første observasjonen er at opp til to dager med kultur størrelsen oppnås kan sammenlignes med in vivo bein vekst for både brusk og mineralisert bein (figur 1a, B, D). Lengre kultur perioder føre til større forskjeller mellom de kultivert b...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones at JoVE.com

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Dyrking og måle fosterets og nyfødt murine Long Bones

Her presenterer vi en metode for ex vivo-kultur for lange murine bein på både Foster og nyfødte stadier, egnet for analyse av bein og brusk utvikling og homeostase i kontrollerte forhold mens recapitulating in vivo prosessen.

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Denne metoden tilpasser metatarsal kulturprotokollen til større bein, slik at direkte beinmanipulering kan kombineres med komplekse genetiske modeller for å håndtere prosesser knyttet til beinutvikling. Denne teknikken tillater manipulering og analyse av beinvekst som ikke er mulig in vivo, for eksempel levende bildebehandling eller direkte fysisk og farmakologisk manipulasjon. Denne ex vivo kulturmetoden tillater den spesifikke studien av de lokale effektene av det genetiske innrøret i beinet som skiller den fra den systemiske effekten behandlingen har på organismen.Begynn med å sterilisere bukregionen av en gravid svangerskapsdag 14,5 til 18,5 mus med 80% etanol og bruke liten saks for å åpne hud- og magemusklene for å få tilgang til livmorhornene. For å trekke ut livmoren fra bukhulen, fjern mesometrium og kutt bunnen av hornene. Deretter overfører livmoren til en 60 millimeter petriskål som inneholder iskald disseksjonsmedium på is.I et biosikkerhetsskap kuttet mellom sekker med saks for å skille de enkelte fostrene, og overføre en individuell sekk til en ny 60 millimeter tallerken med fersk disseksjonsmedium under et disseksjonstereomikroskop. Bruk pinsett for å skille fostrene fra morkaken og for å rense fostrene fra membranene. Bruk en trimmet plastpipette til å overføre kroppen til en ny 60 millimeter tallerken, og halshugge embryoet før videre disseksjon.Bruk deretter pinsett for å fjerne huden, fra baksiden og peeling ut til tærne. Bruk pinsettene til å kutte nær ryggraden og skille baklemmer fra kroppen. Overfør baklemmer til en ren tallerken som inneholder iskaldt disseksjonsmedium, og sett pinsettene mellom overflatebrusken til den distale lårbenet og den proksimale tibia for å skille tibia fra lårbenet.Fjern hoftebenene fra den proksimale lårbenet og calcaneus-beinet og fibulaen fra tibia. Nip forsiktig og trekk det myke vevet fra lårbenet og tibias og bruk en steril en-milliliter pipette for å overføre alle fire benbein til den første brønnen av en 24-brønns plate som inneholder fersk disseksjonsmedium. Det er viktig å vise at det myke vevet som forbinder pulsen av beinet, fjernes.Ellers vil beinet bøye seg og ikke oppnå riktig vekst. Når beinene har blitt dissekert fra riktig eksperimentelt antall fostre, bilde bein i hver brønn til tider null under et lett mikroskop med en god kontrast og erstatte disseksjonsmediet i hver brønn med en milliliter kultur medium per godt tar ekstra forsiktighet for ikke å aspirere bein. For å observere effekten av veksthemming i kulturforholdene, behandle venstre tibias med 500 nanomolar retinosyre og inkubere de riktige tibias med tilsvarende volum av kjøretøy som en kontroll.Deretter plasserer du platen i en cellekultur inkubator under standard cellekulturforhold. Etter to dager, behandle bein med en passende thymidin analog i en til to timer for å vurdere bein celle spredning før overføring av bein til individuelle to-milliliter rør på 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Deretter overfører du beinene til PBS for å bilde beinene på det siste tidspunktet før du returnerer prøvene til paraformaldehyd for overnattingfiksering ved fire grader Celsius.For å måle lengden og mineralisert region av bein, åpne en passende bildebehandlingsprogram, og tar hensyn til omfanget av bildet, måle både den totale lengden på beinet, og mineralisert regionen. Starter målingene fra de første mørke cellene i den ene enden til de siste mørke cellene i den andre enden. For å beregne vekstraten som er definert som den gjennomsnittlige økningen i lengde per dag, del forskjellen mellom den endelige lengden på beinet og den opprinnelige lengden med antall dager i kulturen.Her vises en sammenligning mellom kultivert tibia og nyutvunnet tibia på tilsvarende stadier. Etter opptil to dager med kultur, er størrelsen oppnådd sammenlignbar med in vivo bein vekst for både brusk og mineralisert bein. Lengre kulturperioder fører til større forskjeller mellom de kultiverte beinene og nyutvunnet bein.Merk at tibia dyrket med en ufullstendig fjerning av bløtvevet kan resultere i bøying av den kultiverte tibia. Behandling med retinsyre har en robust effekt på tibialveksten så tidlig som etter to dagers behandling. Selv om det er en konsekvent økning i den totale lengden på tibia etter to dager i kultur, tilsvarer denne veksten en omtrentlig økning på bare ni til 29% fra opprinnelig lengde.Mindre enn bein vekst økning som ville bli observert in vivo. Faktisk viser thymidine analog merking færre positive celler i denne regionen etter kultur sammenlignet med nyutvunnet bein av et tilsvarende stadium. Videre, i in vitro kultivert tibia, øker den totale lengden på skjelettelementet betydelig, mens nesten ingen økning i den mineraliserte regionen observeres.I tillegg til histologisk og molekylær analyse kan rydding og 3D-avbildning utføres etter kulturen for å karakterisere cellulær effekt av behandlingene som brukes på de kultiverte beinene. Teknikken gjør det mulig for oss å ta opp spørsmål knyttet til interorganal kommunikasjon. For eksempel, ved å co-culturing bein fra de ulike genetiske modellene i en slags smertefri parabiosis eksperiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammer for langvarig konfokal imaging av rot og hypokotylutvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Langsiktig opptreden og reproduktive konsekvensene av embryonale eksponering for lav dose giftstoffer

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generasjon og dyrking av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika smitte av kultivert menneskelig fosterets hjerne nevrale stamceller for Immunocytochemical analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fosterets musen hjerte Imaging bruker høyfrekvente ultralyd (30 / 45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolasjon og kultur av primære Epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-amniotic In Utero transplantasjon i Murine modellen

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Høy frekvens ultralyd for analyse av Fetal og Placental utvikling i Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...