Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Christopher Nelson per l'assistenza editoriale. Il programma di autopsia è supportato in parte dalla concessione di R35 NS097303 a BDT. Il lavoro nel laboratorio di RD è supportato da sovvenzioni del NINDS (NS096148) e della National Multiple Sclerosis Society, USA (RG 5298).

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis:+a+retrospective+study.">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li><li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na+/K++ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions.">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4/CXCL12+in+multiple+sclerosis.">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter:+pathology-imaging+correlations.">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li><li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data.">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li><li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking.">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li><li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+revisited:+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders.">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li><li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus.">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696 (2017).</li><li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Descriviamo un protocollo che è stato utilizzato per procurare ed elaborare rapidamente tessuti da oltre 150 individui con SM. Una caratteristica importante di questo protocollo è che gli scienziati che utilizzano il tessuto sono anche incaricati di stabilire il protocollo e di eseguire la raccolta dei tessuti. Ciò offre flessibilità nel soddisfare le esigenze scientifiche dei singoli progetti di ricerca. Diversi aspetti di questo protocollo ne migliorano l'utilità. I pazienti sono di solito ben caratterizzati prima della morte, poiché molti di loro sono stati seguiti da neurologi nel nostro centro. Un passo critico è l'elaborazione delle donazioni di tessuti subito dopo la morte, che aumenta la qualità del tessuto congelato rispetto ad altre banche cerebrali. Ciò consente studi molecolari di grande valore nel descrivere i cambiamenti nei prodotti genici trascrizionali e traslazionali, che sono essenziali per la giustificazione delle osservazioni istologiche e immunocitochimiche. L'utilizzo di dati morfologici/immunocitochimici e molecolari in più casi migliora l'affidabilità delle conclusioni. Questo è meglio illustrato dalla nostra descrizione dei cambiamenti genici mitocondriali nella corteccia cerebrale e nei cambiamenti dei geni neuronali negli ippocampi demielinati. Nuovi protocolli di profilazione genica sono in fase di sviluppo a un ritmo rapido e il tessuto congelato nella nostra banca dovrebbe fornire RNA di alta qualità per l'analisi dei tessuti e delle singole cellule.
Un altro aspetto apprezzato del nostro protocollo sono le fette cerebrali fisse brevi. Questi tessuti sono tagliati in sezioni di 30 m di spessore e galleggianti. Queste sezioni sono ideali per l'utilizzo della microscopia confocale per analizzare due o più antigeni in tre dimensioni. Buoni esempi includono l'interazione di processi oligodendrociti pre-mielinanti con assoni distrofici nelle lesioni croniche della SM, nonché l'identificazione di singole connessioni assonali ai bulbi di retrazione assonale transected. Questo è in contrasto con l'uso di routine di 7 sezioni di paraffina di spessore m, dove le immagini 3D non sono fattibili. I tessuti incorporati nella paraffina hanno un grande valore per alcune domande, in particolare la quantificazione delle densità neuronali nelle sezioni emisferiche 7 di m di spessore. I nostri protocolli di lavorazione dei tessuti, quindi, sono diversi e forniscono flessibilità per assicurare tessuti fissi e rapidamente congelati.
Un'altra caratteristica unica del nostro protocollo è la risonanza magnetica cerebrale post-mortem in situ. Le risonanze magnetiche cerebrali sono un biomarcatore insostituibile della malattia ms. È quindi essenziale stabilire le correlazioni patologiche dei segnali di risonanza magnetica anormali. I nostri studi hanno stabilito che sia T2 solo e T2T1MTR ROIs sono spesso mielinati. Questa scoperta supporta la necessità di modalità di imaging più specifiche che distinguano in modo affidabile tra materia bianca cerebrale mielinato e demielinato. La risonanza magnetica sembra essere sensibile per la rilevazione della mielina, ma i nostri studi dimostrano che anche una combinazione di T1/T2/MTR non è specifica per identificare la mielinazione. Il nostro protocollo postmortem fornisce una piattaforma ideale per testare la capacità di nuove modalità di imaging per distinguere tra materia bianca cerebrale mielinata e demielinata. La risonanza magnetica fornisce anche il veicolo ideale per la traduzione dei risultati scientifici di base nella pratica clinica, dato l'uso della risonanza magnetica nella nostra ricerca traslazionale e il suo uso clinico diffuso nei pazienti viventi.
Mentre il taglio di fette corte e lunghe fisse e congelate offre un vantaggio per la lavorazione del tessuto in più modalità per diversi studi, ci sono alcune limitazioni con questo metodo. La valutazione dell'intera struttura può essere limitata in quanto parti di essa possono essere elaborate in modo diverso su sezioni adiacenti. Il grande volume della banca dei tessuti, tuttavia, offre la capacità di studiare una struttura di interesse in più soggetti per migliorare il campionamento. Un'altra limitazione generale agli studi che utilizzano tessuti postmortem è che sono trasversali. Le conclusioni relative alla tempistica e alla progressione dei cambiamenti devono essere interpretate in questo contesto. Ci può essere un pregiudizio di selezione per i pazienti che donano i loro tessuti, che può limitare la generalizzazione dei dati a tutti i pazienti con SM. Poiché la maggior parte dei donatori muore a nome di complicazioni della SM avanzata, potrebbe non essere appropriato estrapolare i risultati da questi pazienti a quelli nelle fasi precedenti della SM. Tuttavia, abbiamo ricevuto tessuti da pazienti più giovani che sono morti per patologie non correlate alla SM (ad esempio, infarto miocardico acuto, sovradosaggio di droga, suicidio). L'ambito del nostro protocollo non comprende il campionamento di altri organi (ad esempio, il midollo gastrointestinale e osseo) che sono stati implicati nella SM. Crediamo che i punti di forza del programma superino di gran lunga i suoi limiti.

Uno dei modi migliori per studiare una malattia è quello di esaminare il tessuto malato stesso. Questo presenta sfide a coloro che studiano le malattie del sistema nervoso centrale (SNC). Le biopsie del cervello e del midollo spinale malati sono estremamente rare e di solito coinvolgono casi atipici. I tassi di autopsia per gli individui affetti da malattie del SNC sono diminuiti drasticamente negli ultimi anni e, se eseguiti, spesso non forniscono un rapido approvvigionamento di tessuti. Queste sfide hanno portato alla creazione di banche cerebrali centrate sulla malattia, tra cui diverse si sono concentrate sulla raccolta di tessuti da individui con sclerosi multipla (MS). La SM è una malattia infiammatoria mediata del SNC che distrugge la mielina, gli oligodendrociti (cellule formanti mielina), i neuroni e gli assoni. La maggior parte dei pazienti affetti da SM ha un decorso della malattia bi-fasica che inizia con bout di disabilità neurologica con recupero variabile che alla fine si evolve in una malattia gradualmente progressiva che è probabilmente neurodegenerativa in natura1. Per la maggior parte dei cervelli smstatunitensi donati, gli intervalli post-mortem (PMI) tra la morte e l'elaborazione dei tessuti superano i 24 ore. Mentre questi tessuti hanno fornito informazioni preziose per quanto riguarda i cambiamenti patologici nel cervello ms, non sono adatti per studi molecolari più avanzati che possono fornire potenti informazioni sulla fisiopatologia della malattia. Ciò è particolarmente vero per gli studi di profilazione genica, che richiedono RNA intatto.
Per superare i limiti di cui sopra, abbiamo sviluppato un programma di donazione rapida dei tessuti che consente la risonanza magnetica / correlazioni patologiche. Questo protocollo fornisce tessuti ben conservati adatti per moderni studi molecolari e consente il confronto diretto della patologia cerebrale e delle anomalie della risonanza magnetica nei cervelli della SM. Il programma di donazione di tessuti per la sclerosi multipla Cleveland è in vigore da oltre 20 anni. Questo programma di donazione rapida di tessuti procura cervelli e midollo spinale da individui con SM e altre condizioni neurologiche autoimmuni associate. Il programma mira ad ottenere risonanze magnetiche in situ entro 6 h dalla morte, seguite dalla rimozione del cervello e del midollo spinale per l'elaborazione dei tessuti.
arruolamento Le donazioni sono ottenute tramite il consenso ante mortem ottenuto direttamente da pazienti (pre-aconsentiti) o dai parenti prossimi dopo la morte. I pazienti pre-consentiti sono tipicamente identificati dalla popolazione clinica presso il Mellen Center for Multiple Sclerosis Treatment and Research di Cleveland, Ohio. Anche se la preferenza nel reclutamento nel programma di donazione rapida dei tessuti è data ai pazienti che sono stati seguiti in studi di ricerca longitudinali, è aperto a tutti i pazienti visti al centro. Ai partecipanti che si iscrivono prima della morte vengono date istruzioni affinché i membri della famiglia o i fornitori di assistenza contattino il team di ricerca, al momento della morte o quando si ritiene che la morte sia imminente. Il secondo metodo per gli individui di entrare nel programma di donazione di tessuti è al momento della morte per consenso da parte dei parenti prossimi. Lo Stato dell'Ohio richiede che i decessi siano deferiti a un'organizzazione di approvvigionamento di organi con mandato federale chiamata LifeBanc, che opera in 20 contee dell'Ohio nord-orientale. LifeBanc esamina tutti i decessi per una diagnosi di SM, che è un'esclusione per la donazione di organi. Sono stati presi accordi per LifeBanc per informare gli investigatori del programma di donazione di tessuti MS per tutti i decessi con una diagnosi associata di SM che si verificano entro un raggio di 75 miglia dalla Cleveland Clinic. I parenti e il personale ospedaliero vengono quindi contattati dal personale del programma di donazione dei tessuti e il consenso viene ottenuto per la donazione di tessuti cerebrali e del midollo spinale. Questi due metodi di reclutamento ante-mortem e post-mortem attraverso LifeBanc si traducono in circa 10-12 donazioni cerebrali all'anno. Vengono apportate modifiche al limite massimo di età superiore di decesso per gestire il numero di referral derivati da LifeBanc.
Acquisto di donazioni Il programma richiede una copertura di 24 ore, 365 giorni all'anno da parte dei membri del programma di donazione dei tessuti per l'approvvigionamento dei tessuti. Un sistema centralizzato di notifica di donazione di tessuti/ cercapersone/dispositivo mobile viene utilizzato dal team clinico che copre le donazioni di tessuti. LifeBanc viene fornito numeri per contattare il personale di chiamata per il programma di donazione di tessuti. I membri sono informati della morte dai fornitori ospedalieri/parenti prossimi (pre-acconsentiti) o da LifeBanc e altre fonti di riferimento. In primo luogo, viene fatta una determinazione dell'ora del decesso e la fattibilità della donazione dei tessuti. I decessi vengono quindi sottoposti a screening per condizioni che potenzialmente si traducono in tessuto di scarsa qualità, tra cui ipossia pre-mortem prolungata, tessuto cerebrale distruttivo massiccio (ad esempio, grandi emorragie intracraniche, lunghi ictus biemisferici, supporto prolungato del ventilatore (>3 giorni) e uso prolungato di agenti vasoattivi (>3 giorni) prima della morte. Quando un esaminatore medico è coinvolto in una morte, il neurologo dello studio può parlare con il medico legale per esplorare un modo per ricevere tessuti tempestivi senza compromettere la responsabilità del medico legale. Se si ritiene che il tessuto vitale sia presente, si ottiene il consenso scritto (se non ottenuto prima della morte) e vengono preparati per il trasporto del corpo. Un servizio di trasporto ingedente precedentemente contratto viene quindi contattato per il trasporto alle strutture di risonanza magnetica presso la Cleveland Clinic. Si presta attenzione a garantire che il corpo rimanga a temperatura ambiente e non venga messo in refrigerazione, poiché le temperature inferiori del corpo sono associate ad alterazioni delle caratteristiche del segnale di risonanza magnetica.
Storia clinica La storia clinica comprende dettagli sulla diagnosi della SM, l'insorgenza dei sintomi, i trattamenti utilizzati, i risultati dei test clinici e paraclinici (potenziali evocati, risultati del liquido cerebrospinale, tomografia di coerenza ottica), la sclerosi multipla composita funzionale , e l'espansione della scala dello stato di disabilità (EDSS; effettiva o stimata), che vengono raccolte dalla cartella clinica (ove disponibile) e dal colloquio diretto dei parenti prossimi. Vengono raccolte anche la risonanza magnetica pre-mortem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
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comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

Descriviamo un programma di donazione rapida di tessuti per persone con sclerosi multipla (MS) che richiede che scienziati e tecnici siano disponibili 24 ore su 24, 7 giorni su 7, 365 giorni all'anno. I partecipanti acconsentono a donare il loro cervello e il midollo spinale. La maggior parte dei pazienti è stata seguita da neurologi presso il Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research. I loro corsi clinici e le disabilità neurologiche sono ben caratterizzati. Poco dopo la morte, il corpo viene trasportato al MS Imaging Center, dove il cervello viene scansionato in situ da 3 T risonanza magnetica imaging (MRI). Il corpo viene quindi trasferito nella stanza dell'autopsia, dove vengono rimossi il cervello e il midollo spinale. Il cervello è diviso in due emisferi. Un emisfero viene immediatamente collocato in una scatola di affettare e fette alternate spesse 1 cm sono fissate in paraformaldeide del 4% per due giorni o congelate rapidamente nel ghiaccio secco e nel metilbutane 2. Le fette cerebrali fisse brevi vengono conservate in una soluzione di crioconservazione e utilizzate per analisi istologiche e rilevamento immunocitochimico di antigeni sensibili. Le fette congelate sono conservate a -80 gradi centigradi e utilizzate per studi molecolari, immunocitochimici e di ibridazione/RNA in situ. L'altro emisfero è posto in paraformaldeide del 4% per diversi mesi, posto nella scatola di taglio, ri-scansionato nello scanner a risonanza magnetica 3 T (MR) e tagliato a fette di centimetro di spessore. Le immagini MR (MR) postmortem in situ (MRI) sono registrate con fette cerebrali spesse 1 cm per facilitare le correlazioni RM-patologica. Tutte le fette di cervello sono fotografate e vengono identificate le lesioni della materia bianca del cervello. Il midollo spinale è tagliato in segmenti di 2 cm. I segmenti alternati sono fissati in paraformaldeide del 4% o congelati rapidamente. Il rapido approvvigionamento di tessuti MS postmortem consente analisi patologiche e molecolari del cervello e dei midollo spinale e correlazioni patologiche delle anomalie della risonanza magnetica cerebrale. La qualità di questi tessuti postmortem rapidamente elaborati (di solito entro 6 h dalla morte) è di grande valore per la ricerca sulla SM e ha portato a molte scoperte ad alto impatto.

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Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

La sclerosi multipla è una malattia demielinante infiammatoria senza cura. L'analisi del tessuto cerebrale fornisce importanti indizi per comprendere la patogenesi della malattia. Qui discutiamo la metodologia e l'analisi a valle del tessuto cerebrale MS raccolti attraverso un programma di autopsia rapida unico in funzione presso la Cleveland Clinic.

Programma completo di autopsia per persone con sclerosi multipla

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

L'obiettivo della nostra ricerca è studiare la patogenesi della sclerosi multipla. Per raggiungere questo obiettivo abbiamo stabilito un programma di autopsia rapida per ottenere e studiare il cervello da individui con SM. Ci sono due aspetti speciali del nostro programma di autopsia, il primo è che è rapido. Raccogliamo che il cervello ha meno di sei-otto ore di morte.Ciò consente studi molecolari all'avanguardia. Il secondo aspetto è che facciamo una risonanza in situ prima di muovere il cervello. Questo ci permette di correlare i cambiamenti patologici con i cambiamenti dell'imaging cerebrale.La dimostrazione visiva consente agli spettatori di capire come organizziamo il nostro spazio e il nostro tempo per ottenere risultati ottimali. L'elaborazione tissutale che avviene rapidamente e con attenzione consente l'analisi dell'RNA, l'immunosottenimento, l'immunoblotting e le correlazioni mri. I nuovi ricercatori possono lottare con la lavorazione dei tessuti con scarsa integrità tissutale.Evitare lunghi tempi di fissazione post mortem è importante e le corde dei tessuti MRI possono essere impegnative, quindi la consultazione con gli esperti di analisi della risonanza prima della valutazione può essere molto utile. A dimostrare la procedura saranno Emilie Christie e Christina Volsko. Tecnici del nostro laboratorio.Dopo la risonanza magnetica in situ, pesare e fotografare il cervello e posizionare qualsiasi dura attaccata in un contenitore del 4%Paraformaldeide o PFA. Separare il cervelletto e il tronco encefalico dal cerebro e fotografare il cerebro. Utilizzare una sonda per separare i nervi ottici, il chiasmo e le vie e resect la struttura con un bisturi.Separare gli emisferi cerebrali longitudinalmente e fotografare ogni emisfero singolarmente. Inchiostrare la corteccia motoria primaria o pmc per l'emisfero sinistro, rifotografare il tessuto e posizionare il tessuto in un contenitore da 3,3 litri per una lunga fissazione. Per asportare il PMC per l'emisfero destro rimuovere le meningi di copertura e rifotografare il tessuto.Quindi resect il PMC usando un bisturi. Quindi fotografare il PMC reinsediato vicino all'emisfero. Tagliare il PMC in sei sezioni di dimensioni uguali e inchiostrare l'aspetto rostrale di ogni sezione.Quindi posizionare ogni altra sezione in contenitori riempiti di PFA per una breve fissazione. E agganciare congelare le sezioni rimanenti per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, in frigo numero uno. Tagliare l'emisfero destro anteriore a posteriore in sezioni coronali spesse un centimetro.Fissare ogni altra sezione in PFA e congelare le sezioni rimanenti per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, nel dispositivo di raffreddamento numero uno. Separare il tronco encefalico dal cervelletto e posizionare il tronco encefalico in un contenitore riempito di PFA per una breve fissazione. Tagliare ogni emisfero cerebellare in quattro sezioni sagittali ugualmente fisse e fotografare le viste mediali e laterali.Quindi posizionare le fette emisferiche cerebellari sinistra in un contenitore di PFA per una breve fissazione. E schioccare congelare le fette emisferiche cerebellari giuste per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, in refrigeratore numero uno. Dopo aver ottenuto il midollo spinale con le radici nervose rimuovere il midollo spinale dura mater e conservare la dura in PFA.Separare le radici del nervo anteriore e posteriore sinistro e destro e tagliare le radici nervose anteriori e posteriori sinistra dal midollo spinale per una breve fissazione in PFA. Tagliare le radici nervose anteriori e posteriori destra dalla corda spinale e congelare questi tessuti per la conservazione in sacchetti congelatori sigillati, in refrigeratore numero due. Quindi fotografare il caudale-massimo 20 centimetri del midollo spinale e tagliare sezioni di trasferimento di due centimetri dalla direzione caudale a quella rostrale del cordone per la fissazione breve pfa e il congelamento a scatto.Quindi fotografare la porzione rostrale rimanente del midollo spinale. E tagliare sezioni di trasferimento di due centimetri dalla direzione caudale a quella rostrale del cavo per la fissazione breve della PFA e il congelamento a scatto. Tagliare sezioni di interesse dai tessuti fissi corti o lunghi.Posizionare le sezioni in singoli pozzi di un piatto di sei pozzetti e lavare i tessuti con tre lavaggi di cinque minuti in due millilitri di PBS fresco per lavaggio, con scuotimento. Per il recupero dell'antigene, microonde le sezioni per due o tre minuti in un bicchiere contenente circa 30 millilitri di tampone di citrato millimollare. Quando le sezioni si sono raffreddate a temperatura ambiente trasferire i campioni in una nuova piastra a sei pozzetti per tre lavaggi di cinque minuti e due millilitri di PBS, più 0,3%Triton X-100 per pozzo, per lavaggio.Seguito da blocco endogeno della perossidasi in due millilitri di perossido di idrogeno del 3% più 0,3%Tritone X-100 in PBS per 30 minuti, a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte in due millilitri di PBS più Triton X-100 per lavaggio, come dimostrato. Seguito dal blocco in due millilitri di siero di capra normale al 3% e PBS più Triton X-100 per un'ora a temperatura ambiente.Successivamente, incubare le sezioni dalla notte a cinque giorni negli anticorpi primari di interesse a quattro gradi celsius seguiti da tre lavaggi di cinque minuti in due millilitri di PBS per lavaggio. Incubare le sezioni in soluzione complessa di avidina-biotina o complesso ABC per un'ora, a temperatura ambiente. Segui questo con tre lavaggi di cinque minuti in PBS.Etichettare le sezioni con due millilitri di Diaminobenzidina filtrata integrata con perossido di idrogeno per pozzo per tre o otto minuti. Quando il colore si è sviluppato adeguatamente, lavare le sezioni tre volte in PBS e trasferire singolarmente ogni sezione in un contenitore riempito di PBS. Posizionare ogni sezione in modo piatto, sotto singoli scivoli tissutali.E sollevare delicatamente ogni scivolo dal PBS, mantenendo le sezioni il più piatte possibile. Utilizzare due pennelli per appiattire delicatamente e allungare ogni tessuto. E usa un tovagliolo di carta per tamponare l'acqua in eccesso.Quindi montare le sezioni con un mezzo di montaggio appropriato e sigillare ogni coperchio scivolare con smalto chiaro. Le sezioni tissutali vengono esaminate per la presenza di lesioni da materia bianca e le regioni selezionate sono macchiate per l'attività immunitaria e la deyelinazione. Nelle lesioni acute di Sceloris multipli molti di questi assoni demieliniati agiscono come bulbi di retrazione assonale che riflettono le estremità prossimali degli assoni traslitti.La densità degli assoni transetti nelle lesioni acute supera i 11000 millimetri cubi nelle lesioni attive rispetto a soli 15 nelle regioni adiacenti di materia bianca non lesionale. Gli oligodendrociti appena generati sono presenti anche in molte lesioni croniche della SM. Questi processi si associano ma non mielitano gli assoni demielininati.Una ricerca rappresentativa e imparziale dei cambiamenti del gene neuronale nel cortext motorio rapidamente congelato ottenuto da pazienti affetti da SM cronici, ha identificato riduzioni significative in 23 studi di credenziali del messaggero mitocondriale nucleare e codificato utilizzando l'immunocitochimica e l'ibridazione in situ ha indicato che questi geni erano altamente arricchiti nei neuroni di proiezione corticale e che i mitocondri isolati dagli assoni di proiezione mostrano una glicolisi ridotta. Il confronto dell'espressione genica neuronodica negli ippocampi mielinati e demielinizzati rivela riduzioni degli RNA messaggero neuronali, comprese le proteine coinvolte nella memoria e nell'apprendimento. Inoltre, rispetto alle cortici di controllo, la perdita neuronale corticale è significativamente maggiore in una sottostima di pazienti affetti da SM che hanno demielinazione del midollo spinale e cortext cerebrale ma non della materia bianca cerebrale.Durante la lavorazione dei tessuti, assicurarsi che quando le sezioni coronali vengono tagliate vengono tagliate in modo coerente rispetto allo spessore e all'orientamento. E che giacciono piatti quando galleggiano in un fissatore o quando congelati. Oltre all'analisi immunoistochimica, la raccolta dei tessuti congelati ci offre l'opportunità di condurre analisi genetiche e proteomiche.Queste tecniche hanno aiutato nell'identificazione di una nuova coorte di pazienti affetti da SM con lesioni cerebrali da materia bianca sulla risonanza ma senza alcuna deyelinizzazione significativa della materia bianca. Definito MS mielocorticale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Ricerca

Neuroscienze

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

Un protocollo completo per Segmentazione manuale delle Strutture mediale del lobo temporale

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Misurare Progressive neurologico disabilità in un modello murino di sclerosi multipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Analisi di interazione generalizzata psicofisiologica (PPI) di memoria relative connettività in individui a rischio genetico per la malattia di Alzheimer

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Risonanza magnetica funzionale in congiunzione con un nuovo dispositivo robotico indotto dalle mani compatibile con la risonanza magnetica per valutare la riabilitazione di individui che recuperano dai deficit di grip della mano

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Impianto cronico di più array di elettrodi polimerici flessibili

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Programma spettrogramma multitaper basato su computer per dati elettroencefalografici

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...