Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una Biomedica Busch Grant, NSF concedere IBN-0548543, NSF concedere IBN-0919747, March of Dimes Foundation Grant 1-FY04-107, March of Dimes Foundation Grant 1-FY08-464 (a BLF). MKK e CGL sono stati sostenuti dal NIH Biotecnologie formazione di Grant GM008339 T32-20, e CGL è stato supportato anche da una Commissione NJ sulla Fellowship Spinal Cord Research Predoctoral 08-2941-SCR-E-0.

1. Prima di iniziare: 1) E18 dissezione ratto: Metodi dissezione standard di E18 neuroni dell&#39;ippocampo sono state precedentemente descritte 13. Per poter utilizzare il programma Falò di analizzare le caratteristiche morfologiche dei neuriti, 8 bit. Immagini tif dei singoli neuroni deve essere ottenuto. Questo può essere ottenuto in vari modi a seconda del protocollo sperimentale che si stanno seguendo. I neuroni possono essere placcati con una densità abbastanza basso in modo che singoli neuroni appaiono nel campo ottico. In alternativa, per i neuroni singola immagine che sono cresciuti in una cultura denso, i neuroni possono essere transfettate con una varietà di metodi di trasfezione con un plasmide codifica una proteina fluorescente. 2) Requisiti e installazione del software: <ol class="ualpha"><li> Il plugin NeuronJ per il software ImageJ dal NIH e NeuronStudio devono essere entrambi installati in modo da eseguire il programma Falò. I pacchetti software possono essere trovati attraverso i seguenti siti: ImageJ - <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> NeuronJ - <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> NeuronStudio - <a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a> </li><li> Il programma Falò è disponibile all&#39;indirizzo http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. Il manuale utente falò è disponibile anche su questo sito. Inoltre, la descrizione iniziale del falò si trovano in Langhammer et al, Citometria 2010. Tutti i nostri dati sono stati analizzati utilizzando un sistema operativo Windows. </li></ol> 3) Regolazione immagine Risoluzione: Avrete bisogno di modificare il programma Falò in base alla risoluzione delle immagini che si desidera analizzare. Nella parte bonfire_parameters del programma Falò, sostituire il valore corrente per la pix_conv variabile con il valore della risoluzione dell&#39;immagine (micron / pixel) delle immagini. 2. Struttura del file: Al fine di falò per analizzare i dati, i file devono essere organizzati in questa struttura specifica (Figura 2). Si avrà: <ul><li> Un maestro cartella </li><li> Sotto-cartelle (contenenti ciascuna delle vostre condizioni diverse) </li><li> File di immagine delle cellule (file filename.tif) contenuti nelle cartelle condizioni diverse </li><li> Una cartella contenente i falò falò Matlab mfiles (anche contenuti nella cartella principale) </li></ul> 3. I neuroni Tracing in NeuronJ: <ol><li> Preparare l&#39;immagine per il tracciamento <ol class="lalpha"><li> Aprire l&#39;immagine selezionando il pulsante &#39;Apri&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ e selezionando l&#39;immagine che si desidera tracciare. </li><li> Ridimensionare l&#39;immagine selezionando il pulsante &#39;massimizzare&#39;. </li><li> Regolare la luminosità e il contrasto dell&#39;immagine in modo da poter visualizzare tutti i neuriti, selezionando &#39;Immagine&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ quindi selezionando &#39;Regolare la luminosità / contrasto&#39;. </li></ol></li><li> Traccia il corpo cellulare in NeuronJ e identificare la traccia come &#39;Tipo 06&#39; <ol class="lalpha"><li> Selezionare il pulsante &#39;Aggiungi Tracce&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ. </li><li> Tracciare il perimetro del corpo cellulare. </li><li> Selezionare il pulsante &#39;tracciati etichetta&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ. </li><li> Selezionare &#39;N1&#39; dal &#39;Tracing ID&#39; menu a discesa. </li><li> &#39;Tipo 06&#39; Seleziona nella NeuronJ: Attributi finestra e selezionare &#39;OK&#39;. </li></ol></li><li> Tracciare la neuriti in NeuronJ <ol class="lalpha"><li> Selezionare il pulsante &#39;Aggiungi Tracce&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ. </li><li> Aggiungere una traccia lungo ogni ramo dei neuriti. È possibile selezionare solo i dendriti o l&#39;assone, a seconda del vostro esperimento. </li><li> Suggeriamo che i segmenti di disegnare fermarsi in ogni punto di diramazione, con ogni punto di diramazione figlia a partire da quel punto come una nuova traccia. </li><li> Selezionare il pulsante &#39;Salva tracciati&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ. </li><li> Salva il tracciato che avete appena creato nella stessa cartella del file immagine originale. </li></ol></li><li> Esportare il file di traccia e il file identificativo da traccia NeuronJ Due tipi di file devono essere esportati da NeuronJ e salvati nelle cartelle appropriate condizioni insieme al. Tif e file. Ndf. <ol class="lalpha"><li> Selezionare il pulsante &#39;Trace Export&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ. </li><li> Selezionare la &quot;Scheda-deliminated file di testo: file separato per &#39;opzione sul&#39; ogni tracciamento NeuronJ: Export &#39;finestra di dialogo e selezionare&#39; OK &#39;. </li><li> Lasciare NeuronJ di scegliere i nomi dei file e la posizione di salvataggio. </li><li> Selezionare il pulsante &#39;tracciati misura&#39; sulla barra degli strumenti NeuronJ. </li><li> Selezionate l&#39;opzione &#39;misure di visualizzazione tracing&#39; sul &#39;NeuronJ: Misure&#39; finestra e selezionare &#39;Esegui&#39;. </li><li> &#39;File&#39; selezionare nel &#39;NeuronJ: tracciati&#39; finestra. </li><li> Selezionare &#39;Save As&#39; e salvare il file come Filename_info. &#39;Filename&#39; deve corrispondere esattamente al nome del file immagine originale (tra cui capitalizzazione), seguita da _info e non devono contenere un 3-lettera di file-extension. Ad esempio, per Cell20.tif nome originale dell&#39;immagine, questo file dovrebbe essere chiamato &#39;Cell20_info&#39;. Controllare che il computer non aggiunge automaticamente un file. Xls file con estensione. In caso affermativo, l&#39;estensione del file deve essere cancellata manualmente. </li></ol></li></ol> 4. Usa falò per costruire file SWC preliminari di dati NeuronJ.: <ol><li> Riorganizzare le cartelle utilizzando &#39;bonfire_load&#39; <ol class="lalpha"><li> Matlab aperto con un doppio clic sull&#39;icona. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;&#39; in alto a destra della finestra di comando. </li><li> Selezionare la cartella &#39;Falò&#39; nella cartella principale del &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra. </li><li> Tipo &#39;bonfire_load&#39; nella finestra di comando Matlab e premere invio. </li><li> Selezionare la cartella condizione che si desidera analizzare nel &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra e selezionare &#39;OK&#39;. </li><li> Questo riorganizzare la struttura delle cartelle con la creazione di cellule sotto-cartelle contenenti tutti i dati per ogni singola cellula. </li></ol></li><li> Creare file filename_prelim.swc usando &#39;bonfire_ndf2swc&#39; <ol class="lalpha"><li> Tipo &#39;bonfire_ndf2swc&#39; nella finestra di comando e premere invio. </li><li> Selezionare la cartella stessa condizione che hai appena riorganizzato con &#39;bonfire_load&#39; nel &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra e selezionare &#39;OK&#39;. </li><li> Questo creerà un file. SWC in ogni cartella cella per la condizione scelta. Ogni cartella cellula ora contiene 5 file;. All&#39;originale immagine tif, il file NDF, il _info file di identificatore di traccia, un file txt e un file SWC.... </li></ol></li></ol> 5. Usa NeuronStudio per finalizzare file SWC.: <ol><li> Aprire e calibrare le immagini neurone in NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Aprire il programma NeuronStudio. </li><li> Selezionare File → Apri sulla barra degli strumenti NeuronStudio. </li><li> Trova l&#39;. Immagine tif del neurone che si desidera modificare e aprirlo. </li><li> Selezionare Impostazioni → Esegui e digitare &#39;1 &#39;in ciascuno dei 3 (X, Y, Z) caselle nella&#39; finestra Dimensione Voxel &#39;. </li><li> Selezionare File → Importa SWC. Selezionare il file. SWC. Il file immagine sarà ora sovrapposti con un&#39;immagine traccia. Il soma cellulare dovrebbe essere ricoperto con un cerchio rosso. </li></ol></li><li> Usa NeuronStudio per neuriti collegamento <ol class="lalpha"><li> Utilizzare gli strumenti in NeuronStudio di identificare correttamente i punti filiali e punti finali (si consiglia di familiarizzare con le caratteristiche NeuronStudio e scorciatoie prima di analizzare i dati). </li><li> In particolare, utilizzare lo &#39;strumento neurite&#39; di unirsi nodi in modo che: <ul><li> Ogni punto di diramazione (nodi giallo) non può che creare due rami </li><li> Tutte le tracce sono in continuità con il soma (un solo nodo rosso) </li></ul></li></ol></li><li> Esportare dati da NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Selezionare File → Salva neuriti (salvo il nome predefinito). </li></ol></li><li> Verificare la presenza di errori nei file. SWC usando &#39;bonfire_trace_check&#39; <ol class="lalpha"><li> &#39;Bonfire_trace_check&#39; digita nella finestra di comando Mathlab e premere invio. </li><li> Selezionare la cartella condizione che contiene i dati che avete appena trattati nel &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra e selezionare &#39;OK&#39;. </li><li> Se ci sono errori in una delle immagini presenti nella cartella del programma di uscita visualizzare immagini in cui l&#39;errore si trova. </li><li> Correzione degli errori in NeuronStudio <ol class="lroman"><li> Aprire il file immagine salvato nel passaggio di esportazione. </li><li> Individuare e risolvere il problema (s). </li><li> Fare clic su File → Salva neuriti. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per altre immagini che devono essere corretti. </li><li> Rieseguire &#39;bonfire_trace_check&#39; (5,4). </li></ol></li></ol></li></ol> 6. Usare &#39;falò&#39; per estrarre i dati morfologici da file SWC.: <ol class="lalpha"><li> &#39;Falò&#39; digita nella finestra di comando e premere invio. </li><li> Selezionare la cartella condizione che contiene i dati da analizzare nel &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra e selezionare &#39;OK&#39;. </li><li> L&#39;analisi falò genererà una finestra per ogni dei neuroni in fase di analisi, i grafici in cui la morfologia neuronale insieme con gli anelli Sholl utilizzati nell&#39;analisi. Inoltre, il comando &#39;falò&#39; genera il. Tappeto file che contiene tutte le informazioni morfologiche che è stato tolto l&#39;analisi. </li></ol> 7. Usare &#39;bonfire_results&#39; per visualizzare i dati: <ol class="lalpha"><li> Tipo &#39;bonfire_results&#39; nella finestra di comando Matlab. </li><li> Selezionare la cartella condizione per la condizione che si desidera visualizzare nella &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra e selezionare &#39;OK&#39;. </li><li> Il &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra si chiude temporaneamente e riaprire, che consente di selezionare le condizioni aggiuntive che si desidera visualizzare. </li><li> Quando si è terminata la selezione delle cartelle condizione, selezionare &#39;Annulla&#39; per uscire dal processo di selezione. </li><li> &#39;Bonfire_results&#39; restituirà grafici sintesi tra °dati e dalle cartelle condizione selezionata. </li></ol> 8. Usare &#39;bonfire_export&#39; esportare i dati in Excel: <ol class="lalpha"><li> Tipo &#39;bonfire_export&#39; nella finestra di comando. </li><li> Selezionare la cartella condizione che contiene i dati che si desidera esportare nella &#39;Sfoglia per cartelle&#39; finestra e selezionare &#39;OK&#39;. Bonfire_export creerà i file di Excel dei dati morfologici e li collocherà nella cartella condizione che è stata selezionata. </li></ol> 9. Rappresentante dei risultati: Un esempio di dati generati dal programma Falò su un set di dati contenente due condizioni è mostrata in Figura 3. In questo esempio, condizione 1 neuroni contengono più neuriti distale al corpo cellulare. Questo fenomeno può essere osservato nelle immagini di esempio (Figura 3B), così come nella curva Sholl del dendritiche pergolato totale (Figura 3A) e nel grafico del numero di punti terminali (Figura 3C). Inoltre, poiché il programma Falò esegue anche l&#39;analisi Sholl in subregioni delle immagini, siamo in grado di identificare più precisamente l&#39;identità dei neuriti, che sono aumentati. Sia il numero totale delle intersezioni di 3 ° ordine o superiore neuriti (Fig. 3F) e il numero totale di entrambi intermediario e neuriti terminale (Figura 3G) sono aumentati distale al corpo cellulare. Queste tendenze possono anche essere osservati nelle figure 3D e 3E. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1:. Diagramma di flusso del programma Falò neuroni sono tracciate con ImageJ. I dati vengono poi esportati e convertiti dal programma Falò in file SWC preliminari.. NeuronStudio viene utilizzato per definire la connettività dei neuriti. Controlli falò per gli errori e poi calcola le curve Sholl, il numero dei primari, neuriti ordine secondario e superiore, e il numero di punti di ramificazione e suggerimenti dei neuriti. Infine, i dati vengono esportati in Excel per l&#39;analisi statistica. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Struttura dei file necessari per l&#39;analisi dei falò La struttura del file deve corrispondere a questo o il programma non funzionerà correttamente.. I nomi delle cartelle e dei file e la quantità delle cartelle e dei file possono essere cambiati. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Esempio di dati in uscita dal programma Falò A) curve Sholl Totale.. B) Esempio invertita immagini di entrambe le condizioni. C) Numero medio di punti di ramificazione e delle estremità / cell. D) Numero medio di processi / cella per primaria, secondaria e terziaria o superiore neuriti. E) Numero medio di processi / cella per root, intermedio e neuriti terminale. F) l&#39;identità specifica del segmento curve di analisi Sholl. Segmenti sono raggruppati come primario, secondario o terziario o superiore. G) l&#39;identità specifica del segmento curve di analisi Sholl. Segmenti sono raggruppati come segmenti di root, segmenti intermedi, o segmenti terminali.

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Gli autori dichiarano senza interessi in competizione. Le agenzie di finanziamento non ha avuto ruolo scientifico per lo sviluppo di Falò.

Il programma Falò è un programma semi-automatico per l&#39;analisi dei dendriti e degli assoni morfologia. Aumenta notevolmente l&#39;efficienza e l&#39;accuratezza delle analisi Sholl oltre eseguendo l&#39;analisi manualmente. Inoltre, il programma Falò salva i dati in ogni fase del processo, permettendo di controllare i dati e di verificare l&#39;accuratezza dell&#39;analisi. Pertanto, il compito di analisi dei dati possono essere distribuiti a numerosi individui senza compromettere la precisione. Infine, effettuan...

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<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
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<td>Bonfire program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://lifesci.rutgers.edu/~firestein">http://lifesci.rutgers.edu/~firestein</a></td>
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<tr>
<td>NeuronStudio</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MatLab Program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MathWorks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated sholl analysis of digitized neuronal morphology at multiple scales

Morfologia neuronale svolge un ruolo significativo nel determinare come i neuroni e la funzione di comunicare 1-3. In particolare, colpisce la capacità dei neuroni di ricevere input da altre cellule 2 e contribuisce alla propagazione dei potenziali d&#39;azione 4,5. La morfologia dei neuriti influisce anche come l&#39;informazione viene elaborata. La diversità di morfologie dendrite facilitare segnalazione locale e lungo raggio e consentire neuroni singoli o gruppi di neuroni per svolgere funzioni specializzate all&#39;interno della rete neuronale 6,7. Alterazioni nella morfologia dendrite, anche la frammentazione dei dendriti e cambiamenti ramificazione modelli, sono stati osservati in un certo numero di stati patologici, tra cui il morbo di Alzheimer 8, 9,10 schizofrenia e ritardo mentale 11. La capacità di comprendere sia i fattori che determinano morfologie dendrite e per identificare i cambiamenti nella morfologia dendrite è essenziale per la comprensione della funzione del sistema nervoso e disfunzioni. Morfologia dei neuriti è spesso analizzata mediante l&#39;analisi Sholl e contando il numero di neuriti e il numero di punte ramo. Questa analisi è generalmente applicata a dendriti, ma può anche essere applicato a assoni. L&#39;esecuzione di questa analisi a mano sia in termini di tempo e introduce inevitabilmente variabilità a causa di pregiudizi sperimentatore e incoerenza. Il programma Falò è un approccio semi-automatico per l&#39;analisi dei dendriti e degli assoni morfologia che si basa su disposizione strumenti open-source l&#39;analisi morfologica. Il nostro programma permette il rilevamento di cambiamenti locali in dendriti e degli assoni ramificazione comportamenti effettuando analisi Sholl in subregioni del pergolato neuritiche. Per esempio, l&#39;analisi Sholl viene eseguita su entrambi i neuroni nel suo complesso così come su ogni sottoinsieme di processi (primari, secondari, terminale, radice, ecc) Dendrite e patterning assone è influenzato da una serie di fattori intracellulari ed extracellulari, molti agire localmente. Così, la morfologia pergolato risultante è il risultato di processi specifici che agiscono per neuriti specifici, rendendo necessario effettuare analisi morfologica su scala minore, allo scopo di osservare queste variazioni locali 12. Il programma Falò richiede l&#39;utilizzo di due strumenti open-source di analisi, il plugin di ImageJ NeuronJ e NeuronStudio. I neuroni sono tracciati in ImageJ, e NeuronStudio viene utilizzato per definire la connettività tra neuriti. Falò contiene una serie di script personalizzati scritti in Matlab (MathWorks) che vengono utilizzati per convertire i dati nel formato appropriato per ulteriori analisi, controllare gli errori degli utenti e, infine, effettuare analisi Sholl. Infine, i dati vengono esportati in Excel per l&#39;analisi statistica. Un diagramma di flusso del programma Falò è mostrata in Figura 1.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Abbiamo sviluppato un programma per computer per analizzare la morfologia neuronale. In combinazione con due strumenti source aperta esistente analisi, il nostro programma esegue l&#39;analisi Sholl e determina il numero di neuriti, punti di ramificazione, e suggerimenti dei neuriti. Le analisi vengono eseguite in modo che i cambiamenti nella morfologia locale neurite può essere osservato.

Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

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Research

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Neuroscience

33.3K Views.  Rutgers University. Abbiamo sviluppato un programma per computer per analizzare la morfologia neuronale. In combinazione con due strumenti source aperta esistente analisi, il nostro programma esegue l'analisi Sholl e determina il numero di neuriti, punti di ramificazione, e suggerimenti dei neuriti. Le analisi vengono eseguite in modo che i cambiamenti nella morfologia locale neurite può essere osservato.

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Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

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Neuroscienze

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Misurare Progressive neurologico disabilità in un modello murino di sclerosi multipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Analisi automatizzata di andatura in topi con lesione da costrizione cronica

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...